一种对氧磷酶1的检测试剂盒及制备方法
阅读说明：本技术 一种对氧磷酶1的检测试剂盒及制备方法 (Detection kit for paraoxonase 1 and preparation method thereof ) 是由 袁嘉扬 单以朗 于 2019-11-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种对氧磷酶1的检测试剂盒,其特征在于：包括试剂R1和试剂R2,试剂R1的各组分及浓度包括：20-100mmol/L的第一缓冲液、0.5-2g/L的稳定剂、5-20mmol/L的激活剂、1-5g/L的抗干扰剂A、20-60ml/L的表面活性剂、5-20g/L的抗干扰剂B以及0.8-2.0ml/L的防腐剂；试剂R2的各组分及浓度包括：20-100mmol/L的第二缓冲液,2-10mmol/L的对硝基苯乙酸乙酯,5-20g/L的电解质,1-5ml/L的助溶剂,5-10g/L的促进剂以及0.8-2.0ml/L的防腐剂。本发明的优点是：稳定性好、线性范围宽、准确度高、精密度好。(The invention relates to a detection kit for paraoxonase 1, which is characterized in that: the reagent comprises a reagent R1 and a reagent R2, wherein the reagent R1 comprises the following components in percentage by weight: 20-100mmol/L of first buffer solution, 0.5-2g/L of stabilizer, 5-20mmol/L of activator, 1-5g/L of anti-interference agent A, 20-60ml/L of surfactant, 5-20g/L of anti-interference agent B and 0.8-2.0ml/L of preservative; the components and concentrations of the reagent R2 include: 20-100mmol/L of second buffer solution, 2-10mmol/L of ethyl p-nitrophenylacetate, 5-20g/L of electrolyte, 1-5ml/L of cosolvent, 5-10g/L of accelerant and 0.8-2.0ml/L of preservative. The invention has the advantages that: good stability, wide linear range, high accuracy and good precision.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种对氧磷酶1的检测试剂及制备方法。
背景技术
PON1基因产物，也叫血清对氧磷酶，不仅在有机磷神经毒剂解毒中起重要作用，而且与动脉粥样硬化、冠心病及2型糖尿病等疾病发病有密切关系。
血清对氧磷酶的动物和体内实验表明，该蛋白可能有重要的病理生理学和药理学作用。随着分子生物学技术的发展，PON1基因产物的体外表达及基因治疗将成为可能，使其在有机磷农药中毒、心血管疾病和糖尿病血管并发症等救治中发挥重要作用。
已有的检测对氧磷酶1的试剂和检测方法存在着灵敏度和重复性差、检测时间长、准确性低的缺陷，限制了它的应用。因此，应该提供一种新的技术方案解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是：提供一种稳定性好，准确度高的对氧磷酶1的检测试剂盒及制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种对氧磷酶1的检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1的各组分及浓度包括：
所述试剂R2的各组分及浓度包括：
进一步的技术方案：
所述试剂R1中的第一缓冲液和试剂R2中的第二缓冲液分别为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、GOOD’S缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的一种或两种以上混合物。
所述试剂R1、R2中的防腐剂分别为叠氮钠、Proclin950、Proclin300、硫柳汞中的一种或两种以上混合物。
所述试剂R1中的稳定剂为酪蛋白、甘露醇、牛血清白蛋白中的一种或两种以上混合物。
所述试剂R1中的表面活性剂为2-吡咯烷酮、吐温20、曲拉通、聚乙烯吡咯烷酮、辛基苯基聚氧乙烯醚、NP-40中的一种或两种以上混合物。
具体的：
所述试剂R1中的激活剂为氯化钙，抗干扰剂A为亚铁***，抗干扰剂B为尿素。
所述试剂R2中的电解质为氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁中一种或两种以上混合物。
所述试剂R2中助溶剂为丙三醇、苯甲酸钠、水杨酸钠、对氨基苯甲酸、尿素、菸酰胺、乙酰胺中的一种或两种以上混合物。
所述试剂R2中促进剂为聚乙二醇8000、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、聚乙二醇2000中的一种或两种以上混合物。
对氧磷酶1的检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤，
(1)、试剂R1制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照以上浓度要求边搅拌边投入第一缓冲液、稳定剂、激活剂、抗干扰剂A、表面活性剂、抗干扰剂B和防腐剂，搅拌20-30分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后，调节pH值到6.30-9.50之间，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标识；
(2)、试剂R2制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照以上浓度要求边搅拌边投入第二缓冲液、对硝基苯乙酸乙酯、电解质、助溶剂、促进剂和防腐剂，搅拌20-30分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后，调节pH值到6.30-9.50之间，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标识。
由于上述技术方案的应用，本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、该发明首次实现在全自动生化分析仪上检测对氧磷酶1的活性，该方法使用的样本量较少，与其他检测方法相比具有简单、准确、快速的特点，并可在全自动生化分析仪上批量分析实现高通量检测。
2、本发明针对现有的检测试剂在检测过程中存在干扰物质较多，灵敏度较差的缺陷，在R1试剂中同时添加2-吡咯烷酮、亚铁***和尿素，可有效去除405nm波长附近的干扰，同时可使线性范围可达到2-300U/L，改善灵敏度，保证检测结果的准确性，可广泛应用大、中、小医院。
附图说明
图1是校准品定标曲线图
其中：X轴表示校准品浓度，Y轴表示吸光度。
图2是准确度线性曲线图
其中：X轴表示理论浓度，Y轴表示检测结果的均值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述：
实施例1：
一种对氧磷酶1的检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1的各组分及浓度包括：作为第一缓冲液的三羟甲基氨基甲烷，其浓度为20mmol/L、作为稳定剂的牛血清白蛋白，其浓度为0.5g/L、作为激活剂的氯化钙，其浓度为10mmol/L、作为抗干扰剂的亚铁***，其浓度为3g/L、作为表面活性剂的2-吡咯烷酮，其浓度为20ml/L、同样作为抗干扰剂的尿素，其浓度为20g/L以及作为防腐剂的Proclin950，其浓雾为0.8ml/L。
所述试剂R2的各组分及浓度包括：作为第二缓冲液的三羟甲基氨基甲烷，其浓度为100mmol/L、浓度为10mmol/L的对硝基苯乙酸乙酯、作为电解质的氯化钠，其浓度为15g/L、作为助溶剂的丙三醇，其浓度为5ml/L、作为促进剂的聚乙二醇6000，其浓度为10g/L以及作为防腐剂的Proclin950，其浓度为2.0ml/L。
以上对氧磷酶1的检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤，
A)、试剂R1制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照上述的浓度要求边搅拌边投入三羟甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白、氯化钙、亚铁***、2-吡咯烷酮、尿素和Proclin950，搅拌20分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后，调节pH值为6.30，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标识；
B)、试剂R2制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照上述浓度要求边搅拌边投入三羟甲基氨基甲烷、对硝基苯乙酸乙酯、氯化钠、丙三醇、聚乙二醇6000和Proclin950，搅拌30分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后，调节pH值为6.30之间，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标识。
实施例2
一种对氧磷酶1的检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1的各组分及浓度包括：作为第一缓冲液的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，其浓度为60mmol/L、作为稳定剂的甘露醇和牛血清白蛋白的混合物，其浓度为1g/L、作为激活剂的氯化钙，其浓度为5mmol/L、作为抗干扰剂的亚铁***，其浓度为5g/L、作为表面活性剂的聚乙烯吡咯烷酮，其浓度为40ml/L，同样作为抗干扰剂的尿素，其浓度为5g/L以及作为防腐剂的Proclin300，其浓雾为1.3ml/L。
所述试剂R2的各组分及浓度包括：作为第二缓冲液的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，其浓度为20mmol/L、浓度为7mmol/L的对硝基苯乙酸乙酯、作为电解质的氯化钾，其浓度为5g/L、作为助溶剂的水杨酸钠，其浓度为1ml/L、作为促进剂的聚乙二醇4000，其浓度为8g/L以及作为防腐剂的Proclin300，其浓度为1.3ml/L。
以上对氧磷酶1的检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤，
A)、试剂R1制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照上述的浓度要求边搅拌边投入4-羟乙基哌嗪乙磺酸、甘露醇和牛血清白蛋白的混合物、氯化钙、亚铁***、聚乙烯吡咯烷酮、尿素和Proclin300，搅拌25分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后，调节pH值为8.0，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标识；
B)、试剂R2制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照上述浓度要求边搅拌边投入4-羟乙基哌嗪乙磺酸、对硝基苯乙酸乙酯、氯化钾、水杨酸钠、聚乙二醇4000和Proclin300，搅拌20分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后，调节pH值为8.0，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标识。
实施例3
一种对氧磷酶1的检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1的各组分及浓度包括：作为第一缓冲液的2-(N-***啉)乙磺酸，其浓度为100mmol/L、作为稳定剂的甘露醇，其浓度为2g/L、作为激活剂的氯化钙，其浓度为20mmol/L、作为抗干扰剂的亚铁***，其浓度为1g/L、作为表面活性剂的吐温20，其浓度为60ml/L，同样作为抗干扰剂的尿素，其浓度为13g/L以及作为防腐剂的叠氮钠，其浓雾为2.0ml/L。
所述试剂R2的各组分及浓度包括：作为第二缓冲液的2-(N-***啉)乙磺酸，其浓度为60mmol/L、浓度为2mmol/L的对硝基苯乙酸乙酯、作为电解质的硫酸镁，其浓度为20g/L、作为助溶剂的乙酰胺，其浓度为3ml/L、作为促进剂的聚乙二醇2000，其浓度为5g/L以及作为防腐剂的叠氮钠，其浓度为0.8ml/L。
以上对氧磷酶1的检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤，
A)、试剂R1制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照上述的浓度要求边搅拌边投入2-(N-***啉)乙磺酸、甘露醇、氯化钙、亚铁***、吐温20、尿素和叠氮钠，搅拌30分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后，调节pH值为9.50，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标识；
B)、试剂R2制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照上述浓度要求边搅拌边投入2-(N-***啉)乙磺酸、对硝基苯乙酸乙酯、硫酸镁、乙酰胺、聚乙二醇2000和叠氮钠，搅拌25分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后，调节pH值为9.50之间，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标识。
本发明对氧磷酶1的检测试剂盒的应用，其工作原理是:
即：血清样本中对氧磷酶1(PON-1)能够催化降解对硝基苯乙酸乙酯，生成对硝基酚和乙酸。通过在405nm波长条件下测定对硝基苯酚的含量，确定对氧磷酶1活性的大小。
下面通过具体的实验，结合表格和曲线图，对本发明对氧磷酶1的检测试剂盒的几个重要指标进行说明，具体如下：
1、定标：
使用校准品进行定标，结果如表1所示，定标曲线如图1所示。
表1、校准品定标结果：
2、线性范围检测：
选取待测样本用生理盐水进行稀释，产生接近于方法线性范围低限浓度水平的样本，一般为4个浓度水平，分别为：1.50U/L、2.00U/L、2.50U/L和3.00U/L。每个浓度水平样本重复测定10次。以CV≤8％为可接受界值，由数据中选取CV值等于或小于可接受界值的最低浓度水平做为检测范围低限。检测结果如下表：
理论浓度(U/L)
1.50
2.00
2.50
3.00
1
1.27
2.00
2.68
3.08
2
1.63
2.14
2.30
2.95
3
1.45
1.89
2.44
3.05
4
1.56
1.93
2.35
3.15
5
1.44
2.20
2.44
3.02
6
1.36
1.89
2.60
3.13
7
1.70
2.18
2.70
3.08
8
1.59
1.90
2.49
2.82
9
1.30
2.05
2.38
2.91
10
1.47
2.12
2.53
3.17
均值
1.48
2.03
2.49
3.04
SD
0.14
0.12
0.14
0.11
CV％
9.65％
6.12％
5.46％
3.71％
可见：当样本浓度低于2.00U/L时，CV＞8％。当样本浓度高于2.00U/L时，CV＜8％。故线性范围低限定为2.00U/L。
选取待测样本用生理盐水进行稀释，产生接近于方法线性范围高限浓度水平的样本，一般为4个浓度水平，分别为：240U/L、270U/L、300U/L和330U/L。每个浓度水平样本重复测定10次。以CV≤8％为可接受界值，由数据中选取CV值等于或小于可接受界值的最高浓度水平做为检测范围高限。检测结果如下表：
可见：当样本浓度高于300U/L时，CV＞8％。当样本浓度低于300U/L时，CV＜8％。故线性范围高限定为300U/L。
结论：该发明的线性范围可做到2-300U/L。
3、重复性CV检测：
以临床血清为样本，重复测定10次，检测结果如下表：
1
6.90
20.00
145.27
307.40
2
6.93
22.78
158.72
286.43
3
6.39
22.84
149.50
289.65
4
6.10
22.83
155.11
308.68
5
6.90
22.94
143.99
297.65
6
6.77
21.45
152.01
317.32
7
6.88
22.28
154.73
296.37
8
6.25
22.39
156.53
306.05
9
6.35
20.94
143.05
294.80
10
6.59
22.05
151.11
291.73
均值
6.61
22.05
151.00
299.61
SD
0.31
0.97
5.47
9.84
CV％
4.72％
4.41％
3.62％
3.28％
结论：重复性CV均较小，8％以内。
4、准确度检测：
选取不同浓度临床血清样本，用试剂盒分别检测每个浓度3次，分别测出每个浓度检测结果的均值(Yi)。以理论浓度(Xi)为自变量，以检测结果的均值(Yi)为因变量求出线性回归方程并计算绝对偏差和相对偏差，准确度检测结果如下表，准确度线性曲线如图2。
结论：得出线性回归方程为R2＝0.9986，绝对偏差≤5U/L，相对偏差≤5％。
综上：本发明的对氧磷酶1的检测方法与其他检测方法相比具有简单、准确、快速的特点，并可在全自动生化分析仪上批量分析实现高通量检测。该检测试剂盒具有稳定性好、线性范围宽、准确度高、精密度好、检测时间短等优点。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进或替换，这些改进或替换也应视为本发明的保护范围。