用于预防肥胖症的甜菜碱
阅读说明：本技术 用于预防肥胖症的甜菜碱 (Betaine for preventing obesity ) 是由 C·勒兰·马丁内斯 J·C·希门尼斯·奇利亚龙 M·雷蒙·克劳埃尔 于 2018-05-11 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种甜菜碱化合物,该甜菜碱化合物应用于预防受试者的肥胖症、过度脂肪累积、和/或与前两者中任一种相关的代谢紊乱,其中所述预防包括直接对婴儿期的受试者施用所述甜菜碱化合物,或在母乳喂养期间对受试者的母亲施用所述甜菜碱化合物。还提供了用于该应用的包含有效量的甜菜碱化合物以及一种或多种药学上或食用可接受的赋形剂和/或载体的组合物。(The present invention provides a betaine compound for use in preventing obesity, excessive fat accumulation, and/or a metabolic disorder associated with either of the foregoing in a subject, wherein the prevention comprises administering the betaine compound directly to the subject in infancy or to the mother of the subject during breastfeeding. Also provided are compositions for use comprising an effective amount of a betaine compound and one or more pharmaceutically or dietetically acceptable excipients and/or carriers.)
本申请要求于2017年5月12日提交的欧洲专利申请EP17382270.1的权益。
技术领域
本发明涉及营养和疾病领域，更具体地涉及预防和治疗肥胖症及相关疾病。
背景技术
肥胖症被广泛认为是一种慢性疾病，与许多严重的健康问题相关，包括2型糖尿病、心血管疾病、高血压和至少数十种癌症。在过去的三十年中，肥胖症和超重的患病率大幅上升，并影响了全球6亿多人。世界各地的权威机构都将其视为21世纪最严重的公共卫生问题之一。
体重过度增加受多种因素影响，包括遗传易感性、营养不良、个人行为以及环境和社会因素。膳食营养素在肥胖症中的作用长期以来一直存在争议，并且已经进行了许多研究以寻找可用于预防和治疗肥胖症的化合物，但收效甚微。尽管对疗法和膳食补充剂进行了深入研究，但预防和治疗肥胖症的黄金标准是节食和体育锻炼。然而，膳食计划通常会在短期内导致体重减轻，但是难以保持这种体重减轻，经常需要持续运动和永久较低的食物能量膳食。在肥胖症和超重人群中，不遵守该方案和随后重量增加的情况特别高。
外科手术干预对于肥胖症的治疗是有效的，并且在一些国家中对严重肥胖症患者常规进行。程序类型包括腹腔镜可调式镜胃束带术、Roux-en-Y胃旁路术、垂直袖状胃切除术和胆胰分流术。严重肥胖症的外科手术与长期体重减轻、肥胖症相关状况的改善、以及总体死亡率降低有关。但是，公共卫生的相关成本很高，并且约17％的病例发生并发症(7％的病例需要再次手术)。由于其成本和风险，研究人员正在寻找针对这种状况的其他有效但侵入性较小的治疗方法。
在发达国家中儿童肥胖症一直在逐步增加，并已成为主要的公共关注问题。全球各国政府制定战略计划并启动官方宣传计划，以提高对此问题的认识。但是，儿童肥胖症不易应对，因为儿童难以遵守持续节食，并且不建议外科手术干预。在预防策略上正在做出巨大的努力，但是面对生活方式和膳食习惯，这些往往会失败。
普遍的共识是，应特别重视对发展儿童期肥胖症的风险的人群的预防策略。在风险因素中，母亲超重导致生长加快，并且是儿童期肥胖症的主要预测指标。这对于肥胖症的流行病学具有至关重要的影响，因为儿童期超重通常被追踪到成年生活中，从而导致肥胖症的循环，这使肥胖症和代谢风险持续到子孙后代。产后营养也被描述为在决定生长和肥胖症风险中起重要作用。与母乳喂养相比，配方食品一直与儿童期超重有关，其组成会影响肥胖症风险。母乳喂养的持续时间与肥胖症风险呈负相关，而乳组成(包括寡糖多样性和激素水平)的差异与婴儿的成长、肥胖和微生物群组成相关。但是，尽管一些报告已经确定了由母亲肥胖症引起的乳组成变化(瘦素、胰岛素、IL-6、TNF-α较高)，但这些变化与婴儿加速增重无关，甚至被认为是保护性因素。因此，对特定的乳成分如何导致肥胖症风险的母婴传播还知之甚少。
由于肥胖症的高发及其相关的健康后果，需要有效的策略来减少肥胖症的发病率，尤其是终止致肥胖症循环，这种致肥胖症循环使这种不健康状态在有这种危险的子孙后代中持续。
发明内容
发明人惊讶地发现，对婴儿施用甜菜碱不仅在进行补充甜菜碱时，而且在甜菜碱补充已经停止很久以后所述婴儿以后的生命来都可降低肥胖症和相关疾病的发生率。
在下面的实施例中证明了这种惊人的效果。如实施例中所示，发明人已经发现，较低的乳甜菜碱含量与具有肥胖症风险的婴儿的早期生长加快之间有很强的联系。此外，小鼠中的母体补充实验表明，哺乳期甜菜碱的摄入增加降低了肥胖并改善整个成年期的全身代谢。
因此，本发明的第一方面提供了一种甜菜碱化合物，所述甜菜碱化合物应用于预防受试者的肥胖症、过度脂肪累积、和/或与前两者中任一种相关的代谢紊乱，其中所述预防包括直接对婴儿期的受试者施用所述甜菜碱化合物，或在母乳喂养期间对受试者的母亲施用所述甜菜碱化合物。
还可以将上述方面重新阐述为甜菜碱化合物在制备用于预防受试者的肥胖症、过度脂肪累积、和/或与前两者中任一种相关的代谢紊乱的组合物中的应用，其中所述预防包括直接对婴儿期的受试者施用甜菜碱化合物，或在母乳喂养期间对受试者的母亲施用甜菜碱化合物。本发明还涉及预防受试者的肥胖症、过度脂肪累积、和/或与前两者中任一种相关的代谢紊乱的方法，该方法包括直接对婴儿期的受试者施用，或在母乳喂养期间对受试者的母亲施用有效量的甜菜碱化合物以及药学上或食用可接受的赋形剂和/或载体。
在第二方面，本发明提供了一种组合物，其包含有效量的甜菜碱化合物以及一种或多种药学上或食用可接受的赋形剂和/或载体，其用于上述应用。该组合物可以是药物组合物(即药物)或非药物组合物，例如可食用组合物，例如食品或膳食补充剂。
附图说明
图1:A)甜菜碱的相对水平，以任意单位计。B)乳常量营养素成分，以g/100mL计(n＝5/组)；Ch，糖；Prot，蛋白质，C)乳能量含量，以Kcal/mL计(n＝5/组)。D)2周龄雄性中以任意单位计的血浆甜菜碱水平(n＝6/组)。E)哺乳期后代体重(左图代表雄性，n＝18；右图代表雌性，n＝12)；Y轴表示体重，以g计；X轴表示生命的周数。F)1周龄的乳摄入量，以体重百分比表示(n＝4升/组))。数据是平均值±标准误差。*,t-检验p<0.05；**,p<0.0001。对于所有柱状图，白色柱表示来自对照母体的乳(n＝8)，黑色柱表示来自甜菜碱处理的母体的乳(n＝8)。
图2:A)在来自对照母体(白色柱，n＝7)或甜菜碱处理的母体(黑色柱，n＝9)的6周龄雄性小鼠中的脂肪质量，以g(右)和％(左)表示。B)来自肥胖对照母体(MO-C，n＝19)或甜菜碱处理母体(MO-B，n＝21)的雄性后代的体重；Y轴表示体重(g)；X轴表示周龄。C)1周龄的乳摄入量(n＝3升/组)，以体重百分比表示。D)6周龄的雄性小鼠的脂肪质量，以g表示(n＝8/组)。数据是平均值±标准误差。*,t-检验p<0.05；**,p<0.0001。
图3.在2周龄(A)和6周龄(B)时，甜菜碱处理母体(B，n＝10)或对照母体(C，n＝10)的雄性后代中通过LEfSe鉴定的差异富集属的相对丰度(％)。
图4:A)寿命6周时，回肠切片中表示为杯状细胞/100μm的杯状细胞数(n＝16/组)。B)炎症标志物Ccl2m Tlr4和Cd11c的mRNA在6周龄雄性小鼠(n＝8-10/组)的eWAT中的相对表达。C)6周龄雄性小鼠(n＝10/组)的炎症标志物MCP1、IL-6和Pai-1的循环水平，以pg/mL表示。D)寿命6周时nuc8的相对回肠mRNA水平(n＝8/组)。数据是平均值±标准误差。*,t-检验p<0.05；#,Mann-Whitney U检验p<0.05。对于所有图，白色柱表示对照小鼠(C,n＝10)，黑色柱表示甜菜碱处理的小鼠(B,n＝10)。
图5:A)断乳后给对照(白色柱/圆圈，n＝16)或甜菜碱处理的母体(黑色柱/圆圈，n＝16)的雄性后代以饲料喂养，并监测体重(以g表示；Y轴)至24周龄(X轴周龄)。B)处死后的肝脏(L)和eWAT重量，以g表示；Y轴表示组织重量，以g表示。C)第20周时的葡萄糖耐量；Y轴表示葡萄糖浓度，以mg/dL计；X轴表示时间，以分钟计。D)葡萄糖负荷0和15分钟后的胰岛素水平；Y轴表示胰岛素浓度，以pmol/L计。E)断乳后对肥胖对照(MO-C，n＝11)和甜菜碱处理(MO-B，n＝13)的母体的雄性后代保持饲料喂养，并监测体重(以g表示；Y轴)至24周龄(X轴周龄)。F)处死后的肝脏(L)和eWAT重量；Y轴表示组织重量，以g计。G)第20周时的葡萄糖耐量；Y轴表示葡萄糖浓度，以mg/dL计；X轴表示时间计。H)葡萄糖负荷0和15分钟后的胰岛素水平；Y轴表示胰岛素浓度，以pmol/L计。数据是平均值±标准误差。*,t-检验p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001。
图6:A)将具有对照(白色柱/圆圈)和甜菜碱处理的母体(黑色柱/圆圈)的6周龄小鼠喂饲HFD 4个月(雄性(M)：对于HF-C和HF-B而言n＝14和n＝20；雌性(F)：n＝14/组)；计算高脂喂养期间的体重增加(以g表示；Y轴表示)。B)18周时的雄性小鼠的葡萄糖耐量；Y轴葡萄糖浓度，以mg/dL计；X轴表示时间，以分钟计。C)葡萄糖负荷0和15分钟后18周雄性小鼠的胰岛素水平；Y轴表示胰岛素浓度，以pmol/L计。D)雄性小鼠的肝甘油三酯水平(n＝8/组)；Y轴表示μg TAG/mg蛋白质。数据是平均值±标准误差。*,t-检验p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001。
图7:对以甜菜碱(B组，黑色圆圈/柱)、抗生素(AB组，白色三角形/阴影柱)、抗生素和甜菜碱(AB-B组，黑色三角形/斑点柱)、或无补充(C组，白色圆圈/柱)处理的母体的雄性后代进行分析(n＝12，来自3升/组)。A)监测体重至24周龄；Y轴表示体重，以g计；X轴表示年龄，以周为计。B)处死后的肝脏(L)和eWAT重量；Y轴表示组织重量，以g计。C)22周龄的葡萄糖耐量；Y轴表示葡萄糖浓度，以mg/dL计；X轴表示时间，以分钟计。D)eWAT中炎症标志物Ccl2m和Cd11c的mRNA的相对表达(n＝8-12/组)。数据是平均值±标准误差。*,单因素ANOVA，伴有事后Tukey检验，与对照相比p<0.05。
具体实施方式
本发明涉及通过向婴儿施用甜菜碱化合物来预防肥胖症、过度脂肪累积和相关紊乱。
“肥胖症”是这样的状况：其中存储在动物，特别是人和其他哺乳动物的脂肪组织中的自然能量储备增加到与某些健康状况或死亡率增加相关的程度。术语“过度脂肪累积”应理解为具有比最佳健康态更多的体内脂肪。“过度脂肪累积”也可以称为“超重”。肥胖症和过度脂肪累积通常由个人的身体质量指数定义。“身体质量指数”或“BMI”是指以千克为单位的体重与以米为单位的身高的平方之比。通常将BMI大于30的成年人定义为“肥胖症”。通常将BMI从25至30的成年人视为“超重”。对于2岁以上的人类儿童，BMI会绘制在BMI vs.年龄增长图表(针对女孩或男孩)上以获取百分位排名。对于2岁以下的儿童(婴儿)，绘制的是重高指数而不是BMI。百分位数和z得分是评估单个儿童的大小和生长方式的最常用指标。百分位表示在相同性别和年龄的个体的群体中孩子的BMI或重高指数。z得分表示一个个体偏离具有相同性别和年龄的人群的平均值的标准差(SDS)数。如果人类儿童的BMI或重高指数百分位数位于第85至95个百分位数之间，或z评分介于1至2个SDS之间，则被视为超重。如果人类儿童的BMI或重高指数百分比位于第95个百分位数或以上，或z得分等于或高于2个SDS，则被认为是肥胖。
术语“营养不足”也称为“营养不足”，应理解为由于食物不足、膳食不均衡或同化不良而导致的缺乏足够营养。某些疾病或遗传状况也可能导致营养不足。如果人类婴儿的BMI或重高指数位于第10个百分位数或以下，通常被称为营养不良。如果人类婴儿BMI或重高指数位于第3个百分位数或以下，通常认为是严重营养不良。
与超重、肥胖症和/或过度脂肪累积相关的代谢紊乱是本领域技术人员众所周知的。例如，这些病症包括心血管疾病，如冠心病；胰岛素抵抗；2型糖尿病；高血压；睡眠呼吸暂停、呼吸问题和/或血脂异常；但也有一些癌症如子宫内膜癌、乳腺癌和/或结肠直肠癌；中风；肝胆疾病；骨关节炎；和/或妇科问题。特别地，本发明实施方式的与肥胖症和/或过度脂肪累积相关的代谢性疾病选自冠心病、胰岛素抵抗、2型糖尿病、高血压、血脂异常、和睡眠呼吸暂停，更特别是冠心病、高血压、血脂异常和睡眠呼吸暂停。
在本发明的意义上，术语“婴儿期”应理解为受试者具有推荐母乳喂养的年龄的时间段，该母乳喂养可以是单独的喂养手段，或与婴儿配方食品和/或固体食物结合使用。在人类中，婴儿期通常被认为是从0岁到2岁左右，即从出生到2岁左右。然而，技术人员将理解，与术语“儿童期”、“***”和“成人期”相同，术语“婴儿期”不是绝对时期，因为它取决于每个个体的成熟度。因此，这些术语中的每一个都与平均年龄范围相关，而不是与确切的年龄范围相关。
在本发明的意义上，“儿童期”被理解为婴儿期和***开始之间的时期。“***”通常被定义为身体变化的过程，通过该过程孩子的身体成熟成为能够进行性生殖的成年身体。术语“***(puberty)”和“***(adolescence)”可互换使用。对人类平均而言，女孩的***在10-11岁之间开始；男孩的***在11-12岁之间开始。因此，对于人类来说，“儿童期”平均从约3岁至约12岁。“***”在人类中的平均年龄从约13岁到约18岁。
“成年期”通常被定义为从***结束，即个体完全成长并且性成熟时开始的时期。在人类情况中，术语成人还具有与社会和法律概念相关的含义。在本发明的意义上，术语“成年期”优选是指生物学上的成年期，其在人类中从约18岁开始直至个体死亡。
“预防”应理解为避免发展肥胖症、过度脂肪累积和/或与上述二者中任一种相关的代谢性疾病，并减少发生肥胖症、过度脂肪累积和/或与上述二者中任一种相关的代谢性疾病的可能性。
在本发明的意义上，“母亲”是对作为婴儿的受试者进行母乳喂养的女性。母亲通常(但不一定)是受试者的女性家长。
“感染”被理解为是由致病因子(通常称为病原体)入侵生物体组织，其繁殖以及宿主组织对这些生物体及其产生的毒素的反应。感染是许多疾病的原因。
如本文所用，表述“有效量”是指化合物当施用时足以预防或在某种程度上减轻所针对的病症的一种或多种症状的发展的量。根据本发明施用的化合物的具体剂量当然将取决于关于病例的具体情况，包括所施用的化合物、施用途径、所治疗的特定病症以及类似的考虑因素。当本发明的组合物是药物组合物时，“有效量”是“治疗有效量”。
术语“药学上可接受的赋形剂和/或载体”是指药学上可接受的材料、组合物或载剂。从与药物组合物的其他成分相容的意义上讲，每种组分都必须是药学上可接受的。其也必须适合与人和动物的组织或器官接触，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或其他问题或并发症，且相称地具有合理的获益/风险比。类似地，表述“食用可接受的赋形剂和/或载体”是指可食用组合物，例如食品、营养食品或膳食补充剂可接受的成分、材料、组合物或载剂。“食用可接受的赋形剂和/或载体”必须是食品级成分。在与可食用组合物的其他成分相容的意义上，每种组分都必须是可食用的。其也必须适合在摄取时使用，且无过度毒性、刺激性、过敏反应、免疫原性或其他问题或并发症，且相称地具有合理的获益/风险比。
如本文所用，术语“膳食补充剂”、“食物补充剂”或“营养补充剂”或“营养品”可互换地使用，是指旨在补充膳食并提供在人的膳食中可能缺失或可能不以足够量消耗的营养物的制剂。
“婴儿配方食品”在本领域中通常被理解为设计和销售用于给婴儿喂食的制成食品，并且通常被制备用于从粉末(与水混合)或液体(有或没有额外的水)进行乳瓶喂养或杯子喂养。
在本发明的意义上，“甜菜碱化合物”应理解为两性离子化合物，例如甘氨酸甜菜碱(也称为N,N,N-三甲基氨乙酸或N,N,N-三甲基甘氨酸)，和衍生自其他氨基酸的与甘氨酸甜菜碱相似的化合物。
在一个实施方式中，甜菜碱化合物具有式(I)：
其中：
X是N或As；
R1和R2独立地为(C1-C6)烷基，该(C1-C6)烷基可选地取代有一个或多个卤素原子；和
R3和R4与和它们连接的原子一起形成5至6元环，所述环可选地取代有一个或多个选自OH、卤素和(C1-C3)烷基的取代基，所述(C1-C3)烷基可选地取代有一个或多个卤素原子；或者
R3是(C1-C6)烷基；且
R4是H或(1H-吲哚-3-基)甲基。
如本文所用，术语“(C1-Cn)-烷基”是指具有1至n个碳原子的饱和支链或直链烃侧链。
在本发明的具体实施方式中，甜菜碱化合物选自分别由式II至VI表示的甘氨酸甜菜碱、偶砷基甜菜碱、脯氨酸甜菜碱、4-羟基脯氨酸甜菜碱和色氨酸甜菜碱：
在另一具体实施方式中，甜菜碱化合物选自甘氨酸甜菜碱、偶砷基甜菜碱和脯氨酸甜菜碱。在又一实施方式中，甜菜碱化合物是甘氨酸甜菜碱。
本发明可应用于哺乳动物中，用于兽医或医学领域。本发明在宠物健康、牲畜健康和人类健康领域中特别有用。优选地，本发明可应用于人类健康。因此，在本发明的第一方面的优选实施方式中，甜菜碱化合物用于向人施用。
在本发明的第一方面的优选实施方式中，甜菜碱化合物用于预防肥胖症。
有趣的是，当仅在婴儿期施用甜菜碱化合物时，发明人发现了持久的有益代谢后果，包括减少的脂肪累积。实验数据强烈表明，在生命早期(婴儿期)甜菜碱化合物的暴露增加可能足以在以后的生命降低肥胖和改善代谢健康。该发现有利于最终提供长期寻找的预防肥胖症和相关紊乱，特别是预防儿童期肥胖症的策略。因此，在本发明的一个实施方式中，预防肥胖症、过度脂肪累积、和/或与前两者中任一种相关的代谢紊乱包括婴儿期之后的预防，即在受试者的儿童期，在受试者的***和/或在受试者的成年时期的预防。在另一个实施方式中，预防肥胖症、过度脂肪累积、和/或与前两者中任一种相关的代谢紊乱包括从3岁开始，从13岁开始和/或从18岁开始的预防。
一些受试者有更高风险发展肥胖症、过度脂肪累积、和/或与前两者中任一种相关的代谢紊乱。在这种高危人群中减少发展这些疾病的可能性的干预措施特别有益。因此，在本发明的第一方面的特定实施方式中，所述受试者有风险患有肥胖症、过度脂肪累积、和/或与前两者中任一种相关的代谢紊乱。
一些生命早期因素显然与以后的生命，即在儿童期、***和/或成年期的超重、肥胖症和相关紊乱有关。其中，产妇肥胖症和糖尿病、胎儿营养不良、过多的妊娠体重增加、缺乏母乳喂养、母亲吸烟和婴儿快速生长尤其具有代表性。这些风险因素可能是由于生活方式或遗传原因所致。尽管对于每个风险因素而言关联性都不太高，但是如果风险因素在人群中普遍存在，则在对较小的可归因风险采取行动时可能会取得很大的效果。同样，一些可能的决定因素可能比其他因素更重要，因为它们通过实施有效的干预措施更容易解决。在本发明的第一方面的特定实施方式中，受试者具有选自以下的状况：由肥胖母亲生产、患有子宫内发育迟缓、出生体重低(特别是位于或低于第三百分位数的重高指数)、出生后体重迅速增加及其组合。
根据发明人的发现，在哺乳期增加甜菜碱的摄入减少了肥胖症并改善了整个成年期的全身代谢。因此，预防肥胖症、过度脂肪累积、和/或相关紊乱的有效策略可以是使母乳喂养的母亲食用甜菜碱化合物。在本发明的第一方面的特定实施方式中，将甜菜碱化合物施用于母乳喂养时的受试者的母亲。但是，这种策略并不总是可行的，因为一些婴儿主要或仅以婴儿配方食品喂养。此外，配方食品喂养的婴儿的加速生长和肥胖症的风险更高。通过向这些婴儿施用甜菜碱化合物来预防肥胖症是期望的。因此，在本发明的第一方面的另一个实施方式中，将甜菜碱化合物直接施用于在婴儿期的受试者。直接施用于在婴儿期的受试者可例如通过将甜菜碱化合物包括在婴儿配方食品、婴儿食品或婴儿膳食补充剂中实现。直接施用于在婴儿期的受试者也可以是含甜菜碱化合物和适当赋形剂和/或载体的溶液形式，用于口服施用，例如通过注射器或滴管口服施用。在本发明的第一方面的另一个实施方式中，将甜菜碱化合物施用于婴儿期的男性人类受试者。在本发明的第一方面的另一个实施方式中，甜菜碱化合物施用于婴儿期的女性人类受试者。
发明人已经发现，为了获得预防肥胖症、过度脂肪累积和/或与前两者中任一种相关的代谢紊乱的效果所需的甜菜碱化合物的量远远超过了通过自然膳食能够获得的量，且也远超过通过增加天然甜菜碱源的摄入量所能获得的量。通常，发明人发现在婴儿期为了获得所希望的效果而需要直接施用于受试者的甜菜碱化合物的量可以是2mg/Kg/天至500mg/Kg/天，特别是4mg/Kg/天至100mg/Kg/天，更特别是4mg/Kg/天至50mg/Kg/天。因此，本发明的另一个实施方式涉及用于上述应用的甜菜碱化合物，其中所述预防和/或治疗包括对婴儿期受试者直接施用以4至100mg甜菜碱化合物/Kg/天。这通常也称为“每日剂量”。当在母乳喂养期间将甜菜碱化合物施用给受试者的母亲时，要施用给母亲的每日剂量可以是每天500mg至20g，特别是1至10g/天，更特别是2至6克/天。因此，本发明的另一个实施方式涉及用于上述应用的甜菜碱化合物，其中所述预防和/或治疗包括在母乳喂养期间对受试者的母亲施用1至10g/天的甜菜碱化合物。
本发明考虑将甜菜碱化合物作为纯甜菜碱化合物施用，例如以可直接摄入或溶解在液体中的粉末形式。然而，本发明额外考虑将甜菜碱化合物配制成包含有效量的甜菜碱化合物和其他成分例如赋形剂和/或载体的组合物。
因此，本发明的第二方面提供了一种可用于上述应用的组合物，其包含有效量的甜菜碱化合物以及一种或多种药学上或食用可接受的赋形剂和/或载体。组合物中的有效量可以由技术人员考虑所施用的化合物、日剂量、施用途径、受试者的年龄、受试者的体重以及其他考虑因素来确定。本发明的组合物可以一天一次施用，每周一次施用，每周几天施用或每天几次施用。
在本发明第二方面的一个实施方式中，用于上述应用的组合物是药物组合物，并且赋形剂是药学上可接受的赋形剂。
在另一个实施方式中，用于上述应用的组合物是膳食补充剂，并且赋形剂是食用可接受的赋形剂。在特定的实施方式中，该组合物是用于母乳喂养女性的膳食补充剂。在另一个特定的实施方式中，该组合物是用于婴儿的膳食补充剂。
本发明的药物组合物和膳食补充剂可以配制成几种形式，包括但不限于溶液剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、分散剂、粉剂、锭剂、可咀嚼的糖果、糖果棒、浓缩物、滴剂、酊剂、乳剂、薄膜、凝胶、颗粒剂、口香糖、果冻、油、糊剂、含片剂、丸剂、糖浆剂、可咀嚼的明胶形式或可咀嚼的片剂。考虑到组合物的特定目的而对赋形剂的选择和最合适的配制方法在本领域普通技术人员的范围内。例如，滴剂、溶液剂、糖浆剂和混悬剂可能更适合直接向婴儿施用甜菜碱化合物，而粉剂、片剂和胶囊剂更适合向哺乳母亲施用甜菜碱化合物。通常，用于口服施用的药物组合物和膳食补充剂是优选的。
本发明的第二方面的进一步实施方式提供了用于上述应用的组合物，所述组合物包含有效量的甜菜碱的化合物以及食用可接受的赋形剂和/或载体，其中组合物是可食用的产品。在一个具体的实施方式中，该组合物是可食用的婴儿产品。在另一个实施方式中，可食用组合物是婴儿配方食品。
下面的实例表明，哺乳期间较高的甜菜碱摄入量可以减少肥胖症，并在以后的生命中改善全身代谢。不受理论的束缚，发明人认为甜菜碱引起的后代代谢健康改善可能是通过调节婴儿肠道微生物群来介导的。该理论得到所获得的的以下证据的支持：甜菜碱促进某些有益肠道细微生物群落生长的能力，以及通过持续抗生素治疗破坏甜菜碱效果。
肠道微生物群在健康和疾病中起重要作用。它通过从其他不易消化的膳食多糖(例如抗性淀粉和膳食纤维)中提取能量来发挥重要的代谢活性。这些代谢活动还导致重要营养素的产生，例如人类自身无法生的短链脂肪酸(SCFA)、维生素(例如维生素K，维生素B12和叶酸)和氨基酸。另外，肠道微生物群通过诸如定植抗性和产生抗菌化合物等机制参与对病原体的防御。此外，肠道微生物群参与胃肠感觉和运动功能、肠屏障和粘膜免疫系统的发育、成熟和维持。越来越多的证据表明肠道微生物群的生物失调与肠道和肠道外疾病的病理有关。“生物失调”是肠道微生物群失衡或适应不良的术语。
甜菜碱补充剂对肠道微生物群提供的有益调节可能因此带来其他好处。本公开还涉及用于肠道微生物群有益调节的甜菜碱化合物。有益调节被理解为促进有益的肠道微生物群落的生长。本说明书还涉及甜菜碱化合物，其用于预防和/或治疗受试者中与肠道微生物群生物失调有关的疾病，其中所述预防和/或治疗包括直接对婴儿期的受试者施用甜菜碱化合物，或者对母乳喂养期间的受试者母亲直接施用甜菜碱化合物。可以将其重新阐述为甜菜碱化合物在制备用于预防和/或治疗与受试者肠道微生物群生物失调相关的疾病的组合物中的应用，其中所述组合物直接对婴儿期的受试者施用，或者对母乳喂养期间的受试者母亲施用。本公开还涉及一种预防和/或治疗与肠道微生物群生物失调有关的疾病的方法，该方法包括直接对婴儿期的受试者有效量的甜菜碱化合物，或者对母乳喂养期间的受试者母亲施用有效量的甜菜碱化合物，以及药学上或食用可接受的赋形剂和/或载体。所述疾病包括营养不良、感染、炎性肠疾病、肠易激综合症(IBS)、乳糜泻、过敏、哮喘、以及肥胖症和相关紊乱，例如心血管疾病、胰岛素抵抗、2型糖尿病；高血压、睡眠呼吸暂停、呼吸问题、血脂异常和癌症。
在甜菜碱补充剂提供的益处的背景下，发明人还发现甜菜碱促进肠屏障完整性(参见实施例2.4和图4)。本公开还涉及用于在受试者中维持或改善肠屏障功能的甜菜碱化合物，其中所述维持或改善肠屏障功能包括直接对婴儿期的受试者施用甜菜碱化合物，或者对母乳喂养期间的受试者母亲施用甜菜碱化合物。可以将其重新阐述为甜菜碱化合物在制备用于维持或改善受试者的肠屏障功能的组合物中的应用，其中直接对婴儿期的受试者施用所述组合物，或者对母乳喂养期间的受试者母亲施用所述组合物。本公开还涉及一种用于维持或改善受试者的肠屏障功能的方法，其包括直接对婴儿期的受试者施用，或者对母乳喂养期间的受试者母亲施用有效量的甜菜碱化合物，以及药学上或食用可接受的赋形剂和/或载体。在一个特定的实施方式中，所述受试者是人。在另一个特定的实施方式中，受试者是动物。
婴儿的营养不良导致肠道生物失调和肠屏障功能受损，这对儿童造成多种后果，包括营养吸收不良、生长和认知发育受损、细菌易位(内毒素血症)和系统性炎症。这可能会产生严重后果，从发育迟缓到腹膜炎。因此，改善或维持营养不良婴儿的肠屏障功能可能会影响氨基酸、蛋白质、脂质、糖和其他营养物质的吸收和代谢。
维持或改善肠屏障功能不仅有助于改善后代的代谢健康，而且还具有其他好处，尤其是在预防内毒素血症和感染方面。这对于有营养不良风险的婴儿(例如营养不良的婴儿)尤其重要。
本公开还涉及用于预防受试者中的感染的甜菜碱化合物，其中所述预防包括直接对婴儿期的受试者施用甜菜碱化合物，或者对母乳喂养期间的受试者母亲施用甜菜碱化合物。可以将其重新阐述为甜菜碱化合物在制备用于预防受试者感染的组合物中的应用，其中直接对婴儿期的受试者施用所述组合物，或者对母乳喂养期间的受试者母亲施用所述组合物。本公开还涉及预防受试者中的感染的方法，该方法包括直接对婴儿期的受试者施用，或者对母乳喂养期间的受试者母亲施用有效量的甜菜碱化合物，以及药学上或食用可接受的赋形剂和/或载体。在一个特定的实施方式中，所述受试者是人。在另一个特定的实施方式中，受试者是动物。
所有用于预防肥胖症、过度脂肪累积和/或与前两者中任一种相关的代谢紊乱的上述实施方式也适用于预防和/或治疗与肠道微生物群生物失调有关的疾病、维持或改善肠屏障功能和预防感染。甜菜碱化合物如上所述优选选自甘氨酸甜菜碱、偶砷基甜菜碱、脯氨酸甜菜碱、4-羟基脯氨酸甜菜碱和色氨酸甜菜碱，更优选选自甘氨酸甜菜碱、偶砷基甜菜碱和脯氨酸甜菜碱，进而更优选为甘氨酸甜菜碱。
如上所述，可以通过母乳，即通过在母乳喂养期间将甜菜碱化合物给予受试者的母亲而将甜菜碱化合物施用于婴儿，或者可以将甜菜碱化合物例如作为膳食补充剂或包含在婴儿配方食品或婴儿食品中直接施用于婴儿期的受试者。为了获得上述益处而直接向婴儿施用的甜菜碱化合物的日剂量可以为2至500mg/Kg/天，特别是4至100mg/Kg/天，更特别地4至50mg/Kg/天。向受试者的母亲服用甜菜碱化合物时，每日剂量可能为500mg/天至20g/天，特别是1至10g/天，更特别是2至6g/天。
根据本发明的甜菜碱化合物的有效日剂量可以通过直接摄入纯甜菜碱化合物来施用，例如以直接摄入或溶解在液体中的粉末形式。然而，本公开还涉及一种组合物，其包含有效量的甜菜碱化合物以及药学上或食用可接受的赋形剂和/或载体，以如上所述用于预防和/或治疗与肠道微生物群生物失调相关的疾病、以维持或改善肠屏障功能并预防感染。该组合物可以是具有药学上可接受的赋形剂和/或载体的药物组合物，或者是具有食用可接受的赋形剂和/或载体的膳食补充剂，或者具有食用可接受的赋形剂和/或载体的可食用产品。当组合物是可食用产品时，它可以是例如婴儿配方食品。
当考虑预防感染时，所述感染特别是肠道感染，例如引起肠胃炎的感染，例如肠病原体。此外，预防感染优选肠道感染可包括在婴儿期和/或儿童期进行预防。本公开还预期所述受试者可能是具有感染风险，特别是由于营养不足和/或因为接受抗生素治疗而遭受感染的风险的受试者。
在整个说明书和权利要求书中，词汇“包括”和该词的变体并不旨在排除其他技术特征、添加物、组分或步骤。此外，词汇“包括”涵盖“由……组成”的情况。本领域技术人员通过阅读说明书可以清楚，或者通过实施本发明可以获悉本发明的其他目的、优点和特征。以下实施方式和附图通过举例的方式提供，它们不意图限制本发明。此外，本发明涵盖本文描述的特定和优选实施方式的所有可能的组合。
实施例
所有实施例中的甜菜碱是甘氨酸甜菜碱。
1.材料和方法
1.1.人类研究设计
简而言之，纯母乳喂养的母亲和婴儿在上午8:00至10:00之间抵达University ofOklahoma Health Sciences(Oklahoma City,OK,USA)的校园。鼓励母亲使用医院级吸乳器排空整个***。对于本研究，我们的主要结果变量是1个月龄时的重高指数z得分(WLZ)，并根据出生WLZ(及其他协变量)进行了调整。从代数上讲，这与出生与出生至1个月(针对出生WLZ进行调整)之间的WLZ差异相同，因此反映了生命第一个月内WLZ的变化。
1.2.乳代谢组学分析
一碳代谢物s-腺苷甲硫氨酸(SAM)、s-腺苷高半胱氨酸(SAH)、甲硫氨酸、胱硫醚、胆碱和甜菜碱如前所述通过LC-MS/MS来确定((M.Inoue-Choi等,One-carbon metabolismnutrient status and plasma s-adenosylmethionine concentrations in middle-agedand older Chinese in Singapore.Int J Mol Epidemiol Genet 3,160-173(2012))。如前所述，通过LC-MS/MS测定5-甲基四氢叶酸(E.Arning等,Quantitation of 5-甲基tetrahydrofolate in cerebrospinal fluid using liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry.Methods Mol Biol 1378,175-182(2016))。总高半胱氨酸通过LC-MS/MS测量。对于此分析，通过将10μL母乳或标准品添加到120μL内标溶液(在溶于蒸馏水中的4mM二硫苏糖醇中含有d4-高半胱氨酸)中来制备样品。在室温下温育30分钟后，将样品用200μL乙腈和0.1％甲酸脱蛋白，并以1400rpm离心5分钟。在synergiHydro 4μ 150x3mm(Phenomenex)上注射10μL提取物后，保持在30℃，并用缓冲液A(100％水，0.5％甲酸和0.25％七氟丁酸)和缓冲液B(100％乙腈，0.5％甲酸，0.25％七氟丁酸)梯度洗脱，对样品进行分析。流速为0.5mL/min，在10分钟的总运行时间内具有逐步梯度。在4000QTrap(Sciex,Framingham,MA)上进行质谱分析，碎片离子的观测(m/z)值为高半胱氨酸(m/z 136→90)和d4-高半胱氨酸(m/z 140→94)。使用Analyst软件v1.4.2(Sciex,Framingham,MA)收集和处理所有数据。
1.3.动物护理和治疗
所有动物实验方案均得到Institutional Animal Care and Use Committee ofthe University of Barcelona(Spain)的批准。将小鼠饲养在12小时的光暗周期中，可以自由获取食物和水。使雄性和雌性ICR-CD1小鼠(Envigo)交配以获得后代。为了最大程度地减少生长变化，出生时将每个母体的产仔数调整为8只幼仔，以去除体重最重和最轻的小鼠。哺乳期间在水中施用甘氨酸甜菜碱(1％wt/vol)，氨苄青霉素(1g/L)和新霉素(0.5g/L)(Sigma-Aldrich)。断乳后，每笼饲养4只小鼠，并喂食2014Teklad膳食(Envigo)。对于膳食引起的肥胖症，提供了高脂膳食(HFD，45％的kcal来自脂肪)(D12451,Research Diets)。对于产妇肥胖症研究，对6周龄的雌性动物在交配前进行8周的HFD喂养；妊娠和哺乳期间维持这种相同的膳食。为了评估乳的摄入量，将幼仔从母体分离2小时，然后放回笼子中1小时；喂养前后的体重差异表示为克数/初始体重/小时。为了收集乳，在出生后第14天在麻醉下(戊巴比妥，40mg/kg)手动收集样品；收集乳后处死母体和幼仔，并获取盲肠内容物用于微生物组研究。身体组成通过使用7.0T Bruker Biospect MRI系统(Bruker Medical Gmbh,Germany)确定。在代谢笼(PhenoMaster/LabMaster,TSE Systems GmbH,Germany)中测量间接量热法；监测O2、CO2、食物摄入和运动活动48小时，并对于重复测量使用2因素ANOVA分析数据。禁食16或4小时后分别进行腹膜内葡萄糖(1.5g/kg)和胰岛素(0.6U/kg)耐受性检查。在上午9点至11点之间麻醉小鼠(腹膜内戊巴比妥，50mg/kg)，并处死。
1.4.生物化学分析
将小鼠乳样品以1：3稀释，然后在Miris分析仪(Miris AB)中通过中红外光谱进行常量营养素素分析。相对甜菜碱浓度通过液相色谱法(Acquity UPLC BEH HILIC柱,Waters)与质谱(QqQ/MS 6490,Agilent)联用确定。通过ELISA(Millipore)确定血浆胰岛素。使用Milliplex Map(EMD Millipore,Merck)测量血浆MCP-1、IL-6和PAI-1。使用甘油三酯测定试剂盒(Sigma-Aldrich)在来自肝脏或粪便(50mg)的氯仿-甲醇提取物中对肝和粪中甘油三酯进行定量。
1.5.基因表达分析
用TRI试剂(Sigma-Aldrich)从组织中分离总RNA，并用大容量cDNA试剂盒(Applied Biosystems)获得cDNA。使用Hprt作为管家基因，使用SybrGreen(Takara Bio)进行qPCR。引物序列如下：
Ccl2正向:5'-CAAGATGATCCCAATGAGTAG-3'(SEQ ID NO:1)
Ccl2反向:5'-TTGGTGACAAAAACTACAGC-3'(SEQ ID NO:2)
Tlr4正向:5'-GCCTCCCTGGCTCCTGGCTA-3'(SEQ ID NO:3)
Tlr4反向:5'-CAGGGACTTTGCTGAGTTTCTGATCCA-3'(SEQ ID NO:4)
Cd11c正向:5'-AGTCTGTTGGGTTCTGTAAG-3'(SEQ ID NO:5)
Cd11c反向:5'-ACAGTTCTGTTATGACATGC-3'(SEQ ID NO:6)
Hprt正向:5'-GCCCCAAAATGGTTAAGGTTG-3'(SEQ ID NO:7)
Hprt反向:5'-GTCAAGGGCATATCCAACAAC-3'(SEQ ID NO:8)
Muc2正向:5'-CTGACCAAGAGCGAACACAA-3'(SEQ ID NO:9)
Muc2反向:5'-CATGACTGGAAGCAACTGGA-3'(SEQ ID NO:10)
1.6.组织学分析
将组织通过浸入***中固定，石蜡包埋，并用苏木精/曙红染色。对于WAT，每只动物在30个随机显微镜视野中测量脂肪细胞面积(10-20个细胞/视野)。对于回肠，用高碘酸-希夫(PAS)方法对横切面进行染色。每只小鼠从5-6个切片中分析了十个绒毛。测定每个绒毛的杯状细胞数，并表示为每100μm的细胞数。由不了解样品ID的研究人员使用ImageJ进行分析。
1.7.肠道微生物组分析
收集来自瘦对照(lean control)和经甜菜碱处理的母体的2周龄和6周龄雄性小鼠的盲肠内容，并在-80℃下储存，直到使用
1.8.统计分析
除非另有说明，否则数据以平均值±sem表示。对人乳代谢产物数据进行了对数转换，并在SPSS 19.0(Armonk,NY:IBM Corp.)中实施了多元回归。采用两尾t检验、Mann-Whitney U检验(用于非正态分布数据)或单因素ANOVA和Tukey事后检验(用于多于两个组)来确定统计显著性。对于所有分析，P<0.05被认为是显著的。
2.R结果
2.1.母乳甜菜碱水平与人类婴儿的早期生长呈负相关
为了确定乳一碳代谢产物是否与母亲超重和婴儿生长有关，对纯母乳喂养的34个母婴对进行了一系列母亲BMI(18.5-47.2kg/m2)研究(表1)。与正常体重(NW)的母亲相比，母亲超重或肥胖症(OWO)导致婴儿在1个月时的重高指数z得分(WLZ)、脂肪量和瘦体重更高(表1)。
表1.参与者的人口和代谢特点
值代表平均值(SD)。粗体表示p<0.05。NW和OWO组之间的双尾t检验用于连续变量；Pearson卡方检验用于分类变量(性别)。NW，正常体重；OWO，超重或肥胖；WLZ，重高指数z得分。
对出生后1个月的乳样品进行分析，以对胆碱、甜菜碱、甲硫氨酸、SAM、SAH、胱硫醚、5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)和总半胱氨酸(tHcy)进行定量，并发现代谢物之间存在显著相关性。NW和OWO母亲之间的分类比较显示，乳代谢产物水平无差异(表1)。接下来，我们检查了乳分析物和婴儿WLZ之间的潜在关联。在所有代谢物中，甜菜碱是唯一与生命1个月的WLZ显著相关的变量(r＝-0.40，p＝0.018)，对于SAH和胱硫醚，仅观察到趋势(表2)。
表2.生命1个月时乳代谢产物与婴儿WLZ之间的多变量相关性。
将代谢物水平进行对数转换，并评估与1个月WLZ的相关性。粗体表示p<0.05。βstd，标准化β系数，来自回归模型；CHO，胆碱；BET，甜菜碱；MET，甲硫氨酸；SAM，s-腺苷甲硫氨酸；SAH，s-腺苷高半胱氨酸；CYSTA，胱硫醚；5-MTHF，5-甲基四氢叶酸；tHCY，总高半胱氨酸。针对母亲年龄、孕前BMI、胎龄和出生WLZ进行了调整的模型。
针对母亲年龄、孕前BMI、胎龄和出生WLZ进行调整并没有实质性地改变未调整的估计值(βstd＝-0.37，p＝0.041，表2)。甜菜碱和WLZ之间的相关性在来自OWO母亲的婴儿中特别强(βstd＝-0.80，p<0.001)，而在NW母亲中则没有观察到相关性(βstd＝0.07，p＝0.904；表2)。对于SAH观察到类似的肥胖症依赖性效应(表2)。乳的甜菜碱含量也与其他生长参数(包括出生重量指数)相关，并且观察到与头围或身体成分的测量值均无相关性(数据未显示)。
总之，这些结果表明由肥胖症母亲生产但暴露于较高乳甜菜碱含量的婴儿与低甜菜碱暴露的婴儿相比在1个月时生长下降。
2.2.小鼠中膳食甜菜碱转移到母乳中，并减少了后代肥胖
为了研究乳甜菜碱是否能调节生长和肥胖症风险，我们专门在哺乳期对小鼠进行了母体补充实验。母体在分娩后的第一天随机分配为对照组(C)或处理组(B，水中1％甜菜碱)。出生后第14天从母体小组中收集乳样品，以确定甜菜碱水平。补充剂可使乳甜菜碱含量增加5倍(p<0.0001，图1A)，而不会改变常量营养素组成或能量含量(图1B-2C)。14天龄的后代显示血浆甜菜碱增加(1.8倍，p<0.05，图1D)。在哺乳期(图1E)或乳摄入期(图1F)，补充品不能调节后代的生长方式。但是，在6周龄时进行的身体成分分析显示，与对照雄性小鼠相比，甜菜碱处理组中脂肪量减少(p<0.05，图2A)。其他代谢参数包括葡萄糖耐量、食物摄入、能量消耗、呼吸交换率和活动水平在年轻小鼠的各组之间没有差异(数据未显示)。
为了检验甜菜碱是否与母体肥胖症相互作用，在母体肥胖症小鼠模型中在哺乳期进行了甜菜碱补充。母体在交配前喂食高脂膳食(HFD)8周，并且在分娩时随机分配为对照组(MO-C)或甜菜碱处理(MO-B)组。如上所述进行补充。与瘦母亲的后代相比，母体肥胖症导致哺乳期间后代体重增加更多(比较图1E和2B)。在这种情况下，甜菜碱补充剂与对照相比(图2B)减缓了子代的生长，而乳摄入量没有差异(图2C)，并引起了6周龄时脂肪量降低的趋势(图2D)。
母体甜菜碱引起的年轻小鼠的变化转化为雄性后代的长期代谢作用，并且还预防了雄性和雌性小鼠中膳食引起的肥胖症。这些数据表明，生命早期的甜菜碱暴露增加可能足以降低肥胖症。高脂喂养后，治疗还可以预防肝脂质蓄积。
2.3.母体甜菜碱补充调节后代生命早期肠道微生物群
由于肠道微生物组受产后营养的影响，因此考虑了微生物组的改变是否可以介导甜菜碱的作用。分析了来自瘦对照和甜菜碱处理的母体的2周龄和6周龄雄性小鼠的盲肠内容物。为了考虑幼崽间的差异，分别分析了2周和6周龄的每组8只幼崽和6只幼崽。未加权UniFrac距离的主坐标分析表明，母体甜菜碱在2周龄时调节了微生物群落组成，在6周龄时未观察到差异。系统发育多样性在各组之间没有差异。线性判别分析效果大小(LEfSe)分析鉴定确定了组之间显著不同的几个细菌组，包括2周时的放线菌属、阿克曼菌属和假单胞菌属，和6周时的阿克曼菌属、臭味菌属(Odoribacter)、颤螺菌菌属和罗斯氏菌属(图3A-3B)。在这些细菌组中，只有阿克曼菌属水平的差异通过在LEfSe之前修剪非常低丰度的序列读数可维持更严格的生物信息学分析。
罗斯氏菌属是已知的丁酸酯生产者，其可以在宿主中诱导有益的代谢作用。值得注意的是，阿克曼粘菌(Akkermansia muciniphila)是唯一在2周和6周龄都发生改变的物种，也是唯一维持更严格生物信息学分析的细菌组。大量研究报告，阿克曼粘菌与改善的代谢健康之间存在关联。有趣的是，阿克曼微生物群增加最近与在出生后营养不良的小鼠模型中的体重增加变慢有关。此外，阿克曼粘菌先前的研究表明，对成年小鼠施用可增加回肠杯状细胞的数量，并改善肠屏障功能，从而导致全身性炎症减少和代谢健康改善。
在6周龄时，盲肠短链脂肪酸没有发现差异。此外，甜菜碱补充剂并未改变母体肠道微生物组。
2.4.母体甜菜碱补充剂可改善肠上皮功能、轻度全身性炎症和代谢功能障碍
甜菜碱处理的母体的6周龄后代在回肠绒毛长度上没有差异，但是杯状细胞数增加(1.3倍，p<0.05，图4A)和Muc2 mRNA表达增加(图4D)。这些变化伴随附睾的白色脂肪组织(eWAT，图4B)中的炎性标志物(Ccl2、Tlr4、Cd11c)的mRNA水平降低。在棕色脂肪、肝脏和骨骼肌中，Ccl2(或单核细胞趋化蛋白1，MCP-1)的表达也降低。此外，补充降低了炎症标志物白细胞介素6(IL-6，p<0.05)的循环水平，而MCP-1和纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)仅显示出数值下降(分别是p＝0.08和p＝0.25，图4C)。
2.5.母体甜菜碱补充改善后代在整个成年期的代谢健康
还调查了在生命早期的上述变化是否转化为长期的代谢改善。断乳后的后代保持低脂膳食，并监测到24周龄。甜菜碱处理的母体生出的雄性小鼠在整个成年期显示出体重增加较低，eWAT体重下降(图5A-B)，但在雌性中未观察到作用。与较低的肥胖相一致，甜菜碱处理的母体的雄性后代中脂肪细胞大小和炎性标志物减少。雄性小鼠表现出葡萄糖耐量的显著改善(图5C)，对雌性后代没有影响。此外，与对照组相比，治疗组的基础胰岛素水平降低了40％(p<0.05，图5D)。胰岛素耐受性测试显示，来自治疗组的雄性在每个时间点的血糖均显著降低，但对胰岛素施用的响应无差异。补充对肝甘油三酯累积没有显著影响。在母体肥胖症小鼠模型中观察到类似的表型，其中与对照组相比，在甜菜碱处理组中成年雄性后代的体重和肥胖降低(图5E-4F)，葡萄糖耐量提高(图5G)和基础胰岛素水平降低(图5H)。
然后测试了这种生命早期干预是否能保护免于膳食引起的肥胖症。为此，给瘦对照或甜菜碱处理的母体的6周大后代喂饲HFD 16周(分别为HF-C和HF-B组)。当接受HFD挑战时，与对照组相比，来自甜菜碱处理组的雄性和雌性后代均显示出较低的体重增加(图6A)。我们观察到累积食物摄入量有所下降，但未达到统计学意义，粪便脂质含量也没有差异。补充剂改善了葡萄糖耐量(图6B)，并且降低空腹血糖(时间0，图6B)和胰岛素水平(图6C)。HF-B组中肝甘油三酯累积减少了30％(p<0.05，图6D)。
2.6.哺乳期共施用抗生素会削弱甜菜碱的长期代谢作用
生命早期的母体抗生素施用会破坏后代肠道微生物群的组成。先前曾观察到，母体氨苄青霉素和新霉素的施用在2周龄后代中会增加盲肠重量，并降低盲肠细菌含量。为了检验生命早期的肠道微生物组是否有助于甜菜碱的长期有益代谢作用，将母体随机分配到4个组，分娩后的第一天开始接受甜菜碱(B组)、抗生素(AB组，饮用水中1g/L氨苄青霉素和0.5g/L新霉素)、抗生素和甜菜碱(AB-B组)，或无添加组(C组)。监测后代直至成年。抗生素治疗完全消除了长期由甜菜碱引起的对体重(图7A)和脂肪库重量的影响，而肝重量不受任何一种治疗的影响(图7B)。此外，在抗生素存在下，母体甜菜碱治疗不再改善葡萄糖耐量(图7C)。同样，在抗生素存在下，甜菜碱也不会降低eWAT炎症标志物(图7D)。
引用列表
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