一种甜菜碱的应用
阅读说明：本技术 一种甜菜碱的应用 (Application of betaine ) 是由 周文 张靖宇 贾伟 夏机良 于 2021-08-30 设计创作，主要内容包括：本发明首次公开了一种甜菜碱的应用。甜菜碱(Betaine)是广泛存在于动植物体内的一种生物碱,化学名称为N,N,N-三甲基甘氨酸,化学结构与甘氨酸类似,属季铵碱类物质,分子式为C-(5)H-(11)NO-(2)。本发明首次发现甜菜碱可以单独或者联合硼替佐米应用于多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)的治疗。本发明公开了甜菜碱对多发性骨髓瘤治疗效果,对多发性骨髓瘤的进展具有抑制作用,对于多发性骨髓瘤的基础研究和临床治疗具有重要意义。(The invention discloses application of betaine for the first time. Betaine (Betaine) is an alkaloid widely existing in animals and plants, has a chemical name of N, N, N-trimethylglycine, has a chemical structure similar to that of glycine, belongs to quaternary ammonium base material, and has a molecular formula of C 5 H 11 NO 2 . The invention discovers for the first time that betaine can be applied to the treatment of Multiple Myeloma (MM) alone or in combination with bortezomib. The invention discloses a treatment effect of betaine on multiple myeloma, has an inhibiting effect on the progress of multiple myeloma, and has important significance on basic research and clinical treatment of multiple myeloma.)
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及甜菜碱在制备多发性骨髓瘤治疗药物中的用途，以及甜菜碱治疗多发性骨髓瘤的机制。
背景技术
多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是血液系统的恶性肿瘤疾病，主要表现为骨髓浆细胞异常增生、并过度产生单克隆免疫球蛋白或轻链(M蛋白)。其发病率约为2～3人/10万人，多见于60岁以上老年人；随着我国近年来人口老龄化，MM发病人数呈上升趋势。在临床上MM患者常伴有多发性溶骨性损害、高钙血症、贫血、肾脏损害；且由于正常免疫球蛋白的生成受抑制，使得MM患者易于受到各种细菌性感染。
目前临床重要问题是耐药和复发，现有MM治疗药物和方案之所以最终失败，是因为MM的发生发展及复发耐药机制极其复杂，涉及肿瘤起始细胞(干/祖细胞)与克隆演变、遗传学改变导致的多种信号通路的异常、瘤细胞与骨髓微环境间恶性循环式相互作用等多方面、多维度的机制，因此针对某一方面或某一靶点的治疗难于取得理想的治疗效果，需要将肿瘤耐药细胞及其所处骨髓微环境作为一个整体，在细胞和分子水平上对MM细胞与微环境间相互作用的复杂机制进行深入研究，为阐明MM耐药新机制及研发临床预警的生物标志物提供全新的思路。
本发明前期利用靶向代谢组学技术检测了31例健康对照和111例初诊MM患者的外周血以及骨髓上清代谢产物，发现在MM患者中存在29种骨髓微环境差异代谢产物，其中发生重要改变的是甘氨酸代谢。MM细胞会从微环境中摄取大量外源性甘氨酸，为细胞的增殖和耐药提供有利条件；因此，干扰甘氨酸的摄取对多发性骨髓瘤的治疗具有重要意义。
发明内容
本发明从代谢角度为多发性骨髓瘤的初诊和复发患者提供新的治疗方式，证实甜菜碱对于多发性骨髓瘤治疗的有效性，完善目前多发性骨髓瘤的治疗策略。
本发明的首要目的是提供甜菜碱的一种应用，用于制备治疗多发性骨髓瘤的药物。
所述的甜菜碱(Betaine)化学名称为N,N,N-三甲基甘氨酸，分子式为C5H11NO2。
进一步地，甜菜碱与硼替佐米组合用于制备治疗多发性骨髓瘤的药物。
本发明提供甜菜碱有效抑制多发性骨髓瘤疾病进程的方式，是持续并有规律地将甜菜碱注射到多发性骨髓瘤小鼠模型体内。
实验结果显示，通过腹腔注射甜菜碱的方式，可以有效延缓多发性骨髓瘤的进程，减轻其肿瘤负荷，延长小鼠生存时间。
本发明的第二个目的是提供甜菜碱的第二种应用，用于制备抑制多发性骨髓瘤细胞增殖的药物。
进一步地，抑制具有剂量依赖性，浓度越高，抑制效果越好。
本发明的通过提供对多发性骨髓瘤细胞的增殖具有抑制作用的甘氨酸类似物，分别是N,N-二甲基甘氨酸和N,N,N-三甲基甘氨酸(即甜菜碱)进行实验。
实验结果显示甜菜碱对多发性骨髓瘤细胞具有显著的杀伤作用，而N,N-二甲基甘氨酸对细胞增殖并无明显作用。
本发明实验结果显示，甜菜碱和硼替佐米具有协同效应，更加有效地抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖。
本发明的第三个目的是提供甜菜碱的第三种应用，甜菜碱用于制备抑制甘氨酸合成谷胱甘肽的制剂。
本发明的第四个目的是提供甜菜碱的第四种应用，甜菜碱用于制备抑制细胞摄取外源性甘氨酸的制剂。
本发明实验结果显示，甜菜碱通过抑制多发性骨髓瘤对外源性甘氨酸的摄取，阻断多发性骨髓瘤细胞增殖所必须的营养需求，从而抑制细胞增殖。
本发明优势：
(1)本发明中所采用的甜菜碱是天然化合物，广泛存在于动植物体内，可以被人体代谢利用，减少副反应；
(2)本发明中甜菜碱的筛选和利用经过大量实验验证，能够准确反映多发性骨髓瘤的代谢特征和甜菜碱的治疗效果；
(3)本发明中甜菜碱的作用机制具有实验支持，为甜菜碱的临床应用提供了科学依据；
(4)本发明为多发性骨髓瘤的临床治疗提供了一种新的思路，完善现有的治疗方案。
下面将结合辅图和实施例对本发明的实施方案进行详细说明。除另外定义，本文中所用的科技术语均为本发明领域普通技术人员通常所理解的含义。本文中所用的命名和实验方法是公知的，且在所属领域中常规使用。使用标准技术进行的所用操作通常是根据仪器耗材生产商的产品说明书和常规技术要求及本文中提供的参考资料进行的。需要注意的是，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围限定。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为本发明的保护范围。
附图说明
图1.甘氨酸在多发性骨髓瘤患者外周血(Peripheral blood,PB)血清、骨髓(BoneMarrow,BM)上清和表达CD138的肿瘤细胞(CD138+ Cell)中显著升高。
图2. 2种甘氨酸类似物对多发性骨髓瘤细胞增殖的作用。
图3.甜菜碱抑制多发性骨髓瘤细胞摄取外源性甘氨酸。
图4.甜菜碱对多发性骨髓瘤肿瘤进程的抑制作用。
图5.甜菜碱和硼替佐米的协同作用。
图6.甜菜碱抑制多发性骨髓瘤细胞增殖的机制。
具体实施方式
实施例1：健康对照和多发性骨髓瘤患者的甘氨酸含量检测
在实施例中，遵守相关伦理要求共获取了31例健康供者(Health doner,HD)和111例初诊多发性骨髓瘤患者的骨髓上清和血清样本，以及12例健康供者的CD138+浆细胞和16例初诊多发性骨髓瘤患者的CD138+肿瘤细胞样本，所有标本来自于中南大学附属湘雅医院、中南大学附属湘雅二医院、中南大学附属湘雅三医院和中国医学科学院天津血液病医院。所有多发性骨髓瘤患者均经检测血清单克隆免疫球蛋白类型和骨髓浆细胞比例确诊为多发性骨髓瘤患者，且均为初诊患者，未接受治疗，以排除因治疗引起的代谢变化。健康供者的年龄、性别和体重指数与多发性骨髓瘤患者相匹配，以排除饮食习惯、年龄、性别和体重指数导致的代谢差异。采血时间均为清晨空腹状态。所有样品均保存在-80℃待用。
样品前处理及检测中所采用的试剂包括：乙腈、甲醇、甲酸(色谱级别)购于Sigma-Aldrich公司；分析纯氯仿、吡啶、无水硫酸钠购于中国医药集团总公司；L-2-氯苯丙氨酸、甲氧基胺、N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(含1％三甲基氯硅烷)、十七烷酸、亮氨酸-脑啡肽购于Sigma-Aldrich公司；去离子水由Millipore公司的MIlli-Q超纯水系统制备。
取100μL骨髓上清或血浆于1.5mL离心管中，加入10μL L-2-氯苯丙氨酸(0.3mg/mL，水溶解)和10μL十七烷酸(1mg/mL，甲醇溶解)作为内参，涡旋10秒混匀；然后加入300μL甲醇/氯仿混合液(3：1)，涡旋30秒混匀，将样本置于-20℃孵育10分钟后，12000g离心10分钟(4℃)；取300μL上清于玻璃取样瓶中，在室温下用氮吹仪吹干，加入80μL甲氧基胺(15mg/mL，吡啶溶解)，30℃孵育90分钟，然后加入80μL N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(含1％三甲基氯硅烷)，70℃孵育60分钟即得上机样品。
取保存的肿瘤细胞沉淀，解冻后加入80μL 10mM盐酸充分混匀，-80℃中反复冻融2次，涡旋混匀后加入20μL 5％5-磺基水杨酸，充分混匀；冰浴10分钟后，8000g离心10分钟(4℃)；取100μL上清于1.5mL离心管中，即为上机样品。
采用GC-MS方式进行甘氨酸含量检测。色谱分离采用超高效气相色谱，质谱分析采用四级杆-飞行时间质谱。色谱柱为DB-5ms毛细柱(30m×250μmi.d.，0.25μm)；载气为高纯氦气，流速1.0mL/min；进样量1μL；程序升温：80℃恒温2分钟，80℃-180℃(10℃/min)，180℃-240℃(5℃/min)，240℃-290℃(25℃/min)，290℃恒温9分钟；不分流，进样温度260℃；接口温度270℃；离子源温度200℃；电子能量70eV；采用全扫描模式，扫描质量范围：m/z30-600道尔顿，光谱采集率为20光谱/s。
GC-MS结果显示，甘氨酸在多发性骨髓瘤患者的血清、骨髓上清和肿瘤细胞中均显著升高(图1)，统计学方法采用非参数t检验。
实施例2：甘氨酸类似物对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响
目前已知的甘氨酸类似物有2中，包括N,N-二甲基甘氨酸(Dimethylglycine,DMG)和甜菜碱(Betaine)，二者均为天然化合物，是胆碱分解产生甘氨酸的中间代谢物。
分别购买甜菜碱(CAS:107-43-7,Sigma)和DMG(CAS:1118-68-9,Sigma)粉末，按照产品使用说明书称取适量粉末，配制100mg/ml母液，-80℃保存待用。
选择人源多发性骨髓瘤细胞ARP1(购自全球生物资源中心The GlobalBioresource Center，ATCC)和鼠源多发性骨髓瘤细胞系5TGM1(四川大学郑宇欢课题组赠送)进行表型分析，上述两种细胞系均经细胞STR分型检验鉴定为正确的细胞系。将上述两种细胞密度调整至5000个/100μl，充分混匀后加入96孔板。将甜菜碱和DMG母液解冻后，稀释到8mg/ml、4mg/ml、2mg/ml和1mg/ml，充分混匀后加入细胞悬液，每个浓度设置3个复孔。将细胞悬液与药物充分混匀后，放入37℃、5％CO2细胞培养箱培养48小时。48小时后，避光条件下在每孔中加入10μl细胞计数试剂(Cell Counting Kit-8,CCK-8)，37℃避光孵育2小时后，通过酶标仪在450nm波长处检测吸光度值。吸光度值越高，则细胞活性越好。
分别使用甜菜碱和DMG处理多发性骨髓瘤细胞后，发现DMG对多发性骨髓瘤细胞的增殖并无明显影响，而相同条件下，甜菜碱可以有效抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖，并具有剂量依赖性，浓度越高，抑制效果越强烈(图2)。
实施例3：甜菜碱对细胞内甘氨酸含量的影响
为了证实甜菜碱可以有效抑制多发性骨髓瘤对外源性甘氨酸的摄取，使用高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)检测甜菜碱处理多发性骨髓瘤细胞后，细胞内甘氨酸的含量。
选择人源多发性骨髓瘤细胞ARP1和鼠源多发性骨髓里细胞系5TGM1进行检测。在5x106个细胞中添加/不添加2mg/ml的甜菜碱，48小时后收取相同数量的细胞，离心收取沉淀后进行样品前处理，具体过程为：细胞沉淀加入10mM的盐酸80μl混匀后，-80°反复冻融两次，再加入20μl 5％水杨酸，冰浴10min后，8000rpm离心5min，取上清待测，可于-80℃暂存。
HPLC所需试剂及仪器条件如下：
流动相：A：50mM醋酸钠PH＝6.8；B：275ml甲醇+12.5ml四氢呋喃；C、D纯净水。上述流动相溶液配好后均需使用0.22μm滤膜抽滤，并超声震荡30min。
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
洗脱条件：0.02min 20％B；6min 25％；16min 37％B；25min 59％B；29min 78％B；32min 78％B；35min 25％B；40min 25％B.
检测波长：excitation：338nm；emission：425nm
HPLC操作流程：
1、安装C18液相色谱柱子(Welch)，流动相从下往上走，箭头朝上。
2、开机：打开电脑，依次打开进样器、压力泵、柱温箱、荧光检测器。
3、打开电脑操作界面，检查管道是否连接。
4、排气：拧开排气阀自动排气，结束后拧紧排气阀；
饱和色谱柱：使用100％甲醇冲洗色谱柱；
基线：Solvent B(纯甲醇)调整成初始流动相，跑基线Pump A从0.2慢慢升至1.0mL/min。10min内基线在-1～1之间变化即可。
点击Batch table设置样品号，样品名称，保存位置。
5、样品衍生：称取10mg邻苯二甲醛(O Phthalic Aldehyde，OPA)后加入0.5ml的甲醇、再加入2ml 0.4M的硼酸缓冲液(0.4M的硼酸溶解后加入氢氧化钾调PH至9.4)再加入30μl的巯基乙醇(注意避光)，配制衍生剂。使用100μL衍生剂+10μL样品，室温衍生3min后，进样检测(时间过久会导致荧光淬灭)。
6、结束关机：清洗管路B(管路B为纯甲醇)管道10％+C/D管道90％，冲洗40～50min后，调整甲醇为100％跑20min饱和柱子。
7、关机即可。
图3的HPLC结果显示，添加甜菜碱后，多发性骨髓瘤细胞内甘氨酸含量显著降低，证实甜菜碱可以有效抑制细胞摄取外源性甘氨酸。
实施例4：甜菜碱在小鼠体内对多发性骨髓瘤疾病进展的影响
为了更好地模拟多发性骨髓瘤肿瘤进展，采用C57BL/KaLwRij小鼠构建多发性骨髓瘤动物模型(5TGM1 MM小鼠模型)。将15只小鼠随机分为3组，每组5只，同一天通过尾静脉注射1x106个带荧光素酶报告基因的5TGM1细胞(5TGM1-Luc)；2周后，1组注射生理盐水，1组注射硼替佐米(0.5mg/kg)，1组注射甜菜碱(0.5mg/kg)，给药方式均为腹腔注射，频率为1周2次；在此期间，每2周进行动物活体成像，检测小鼠体内荧光强度；每2周进行面颊采血，-80℃保存血清；并记录小鼠存活时间。
动物实验结果显示，每周2次注射硼替佐米(0.5mg/kg)和甜菜碱(0.5mg/kg)均可有效延缓多发性骨髓瘤的疾病进展(图4)，减轻其肿瘤负荷，并延长小鼠生存时间。并且甜菜碱与硼替佐米的治疗效果基本一致，这一结果为甜菜碱应用于多发性骨髓瘤的临床治疗奠定了基础。
实施例5：甜菜碱与硼替佐米联合作用的效果分析
目前，硼替佐米(Bortezomib，BTZ)是多发性骨髓瘤临床治疗的一线用药，它的应用将多发性骨髓瘤的中位生存期由3-5年提高到5-7年。但是，绝大部分患者最终都会复发，并由于耐药而治疗失败；因此，为更进一步明确甜菜碱与硼替佐米之间的联合效果，进行了药物相互作用分析。
首先分别使用不同浓度的甜菜碱(8mg/ml、4mg/ml、2mg/ml和1mg/ml)和硼替佐米(16nM，8nM，4nM，2nM)处理多发性骨髓里细胞系ARP1，确定其半数致死量，采用半数致死量联合处理ARP1，利用Chou-Talalay数学模型分析其协同指数。
Chou-Talalay(又称中位药效法，median-drug effect analysis；联合指数法，combination index method)是由Chou和Talalay于1984年共同建立的药物联合作用的定量方法。原则上，联用药物在体内相互作用之后必将引起药物自身药动学及药效学参数发生连续的变化，这些参数的变化将从定性及定量的角度反映药物之间的相互作用。该方法正是基于这一原则，通过质量守恒定律中的Median-effect方程作为媒介，将药物之间以及药物代谢一级和多级动力学之间建立起联系。最终，给出的联合指数(combination index，CI)不仅能用于定量描述联合用药的相加作用(additive effect)、协同作用(synergism)以及拮抗作用(antagonism)，同时又能对给定量-效水平下的效应进行定性描述，其结果将分别由抑制率-联合指数图(Fa-CI)以及等效线图(isobologram)表示。
药物联合指数的一般式为：其中两药的联合指数公式为：其中包括抑制率(Fa)、存活率(Fu)、单用剂量(D)、联用剂量(Dx)、半数有效量(Dm)、反应动力学级数(m)以及剂量减小指数(DRI)多个参数。
利用“CompuSyn”软件根据Chou-Talalay建立的数学模型，计算得出Dm，m，CI值。通过CI值的数值大小可以定量判断药物间相互作用的强度以及性质(CI>1为拮抗作用，CI＝1为相加作用，0.7<CI<1为轻微协同作用，0.3<CI<0.7为协同作用，CI<0.3为强协同作用)。
结果显示，高浓度的甜菜碱(4mg/ml)与硼替佐米(7nM)联合使用具有最佳协同作用(图5)，有效抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖，这一结果为多发性骨髓瘤的联合用药治疗提供了科学依据。
实施例6：甜菜碱抑制多发性骨髓瘤细胞增殖的机制分析
为更进一步明确甜菜碱抑制多发性骨髓瘤细胞增殖的作用机制，首先通过KEGG数据库绘制了甘氨酸的代谢通路。甘氨酸在细胞内发挥作用主要包括3种方式：合成谷胱甘肽(Glutathion，GSH)，调节细胞内的氧化还原平衡；参与叶酸循环，合成嘌呤，参与核酸等大分子物质的合成；以及参与甲硫氨酸循环，产生一碳单位，参与其他代谢通路。
甘氨酸合成谷胱甘肽促进多发性骨髓瘤细胞增殖，而甜菜碱能够抑制细胞摄取外源性甘氨酸，进而导致谷胱甘肽的合成受阻，最终抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖。
在上述三种作用方式中，使用不同浓度的甜菜碱和硼替佐米处理多发性骨髓瘤细胞系(ARP1)的同时，选择添加/不添加还原性谷胱甘肽，48小时后通过CCK-8检测细胞活性，结果显示，谷胱甘肽可以有效逆转甜菜碱对多发性骨髓瘤细胞系的抑制作用，同时可以降低甜菜碱和硼替佐米协同产生的细胞毒性，维持多发性骨髓瘤细胞的存活(图6)。
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