阅读说明：本技术 一种辣根过氧化物酶的提取方法 (Extraction method of horseradish peroxidase ) 是由 卓之明 于 2019-12-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及辣根过氧化物酶提取技术领域,具体为一种辣根过氧化物酶的提取方法,包括以下步骤：步骤1：挑选清洗、破碎、离心去渣；挑选新鲜干净的辣根,利用破碎机破碎,首先经过尼龙纱布进行粗过滤,然后利用离心方式进一步去渣；步骤2：一次去杂；步骤1的浊液以3500r/min离心15min,去除沉淀杂蛋白,利用53～72浓度的硫酸铵盐析,沉淀部分在冰冻离心机以12000r/min离心20min；步骤3：去盐；把步骤2沉淀加入冰盐浴中,利用14000分子透析膜透析去盐,取得上清液备用；步骤4：二次去杂；把步骤3中的上清液加入丙酮,在冰冻离心机中以4200r/min离心20min,静置,然后溶于蒸馏水中透析除丙酮,解决现有的辣根过氧化物酶提取技术提纯纯度较低,同时会产生大量的废料的问题。(The invention relates to the technical field of horseradish peroxidase extraction, in particular to a method for extracting horseradish peroxidase, which comprises the following steps: step 1: selecting, cleaning, crushing, centrifuging and removing residues; selecting fresh and clean horseradish, crushing by using a crusher, firstly carrying out coarse filtration by using nylon gauze, and then further removing slag by using a centrifugal mode; step 2: primary impurity removal; centrifuging the turbid solution obtained in the step 1 at 3500r/min for 15min, removing precipitated impurity proteins, salting out by using 53-72 concentration ammonium sulfate, and centrifuging the precipitated part in a freezing centrifuge at 12000r/min for 20 min; and step 3: desalting; adding the precipitate obtained in the step (2) into an ice salt bath, dialyzing by using a 14000 molecular dialysis membrane to remove salt, and obtaining a supernatant for later use; and 4, step 4: secondary impurity removal; and (3) adding acetone into the supernatant obtained in the step (3), centrifuging for 20min at 4200r/min in a refrigerated centrifuge, standing, dissolving in distilled water, dialyzing to remove acetone, and solving the problems that the existing horseradish peroxidase extraction technology is low in purification purity and generates a large amount of waste materials.)

一种辣根过氧化物酶的提取方法

技术领域

本发明涉及辣根过氧化物酶提取技术领域，具体为一种辣根过氧化物酶的提取方法。

背景技术

过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP，EC 1.11.1.7)，通常来源于辣根(Armoracia rusticana)(生长于欧洲和亚洲部分地区的多年生草本植物)，因此称辣根过氧化物酶，该酶是临床检验试剂中的常用酶，不但用于多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类实验检测等，过氧化物酶作为免疫类显色体系的关键成分，对实验结果和相关产品质量的影响至关重要。

辣根过氧化物酶HRP比活性高，性质稳定，分子量小，所以被广泛地应用于生命科学的各个领域。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由至少15同功酶(A1-A3，B1-B3，C1，C2，D，E1-E6)组成，其中以辣根过氧化物酶C(HRP C)含量最高；HRP分子量为40,000，等电点为PH3～9(酸性(A型)，中性(B和C型)，碱性(D和E型))，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm/OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。

早在80年前，HRP已经被纯化，并且被广泛应用在生物学各个领域；传统的生产HRP的方法多是用硫酸铵和乙醇沉淀，这种方法不但产生大量废料污染环境，酶的回收率低，纯度低，而且酶的活性在纯化过程也大大降低；在很多情况下，HRP需要通过亲和吸附或者色谱分离技术进一步纯化，曾经有学者分别用刀豆蛋白A(Con A)和苯氧肟酸(BHA)色谱技术纯化HRP，但是不能有效避免蛋白质的非特异性结合问题(HRP是一种糖蛋白)，生产的HRP纯度不高。

现有的辣根过氧化物酶提取技术提纯纯度较低，同时会产生大量的废料。

发明内容

本发明要解决的技术问题是现有的辣根过氧化物酶提取技术提纯纯度较低，同时会产生大量的废料的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种辣根过氧化物酶的提取方法，包括以下步骤：

步骤1：挑选清洗、破碎、离心去渣；挑选新鲜干净的辣根，利用破碎机破碎，首先经过尼龙纱布进行粗过滤，然后利用离心方式进一步去渣；

步骤2：一次去杂；步骤1的浊液以3500r/min离心15min，去除沉淀杂蛋白，利用53～72浓度的硫酸铵盐析，沉淀部分在冰冻离心机以12000r/min离心20min；

步骤3：去盐；把步骤2沉淀加入冰盐浴中，利用14000分子透析膜透析去盐，取得上清液备用；

步骤4：二次去杂；把步骤3中的上清液加入丙酮，在冰冻离心机中以4200r/min离心20min，静置，然后溶于蒸馏水中透析除丙酮；

步骤5：提纯；步骤4酶液加入硫酸锌离心、水透析去盐。

优选的，所述步骤2中硫酸盐浓度为65％。

优选的，所述步骤4中丙酮采用-20℃丙酮试剂。

优选的，所述步骤5中锌离子浓度为8mol/L。

优选的，所述步骤5中离心转速为4800r/min。

本发明的优点：

1.本发明提纯速度快、精度高，同时节约成本，而且不会产生很多废弃物，而且，与传统方法相比，酶的活性将大大提高。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，进一步阐述本发明。

一种辣根过氧化物酶的提取方法，包括以下步骤：

步骤1：挑选清洗、破碎、离心去渣；挑选新鲜干净的辣根，利用破碎机破碎，首先经过尼龙纱布进行粗过滤，然后利用离心方式进一步去渣；

步骤2：一次去杂；步骤1的浊液以3500r/min离心15min，去除沉淀杂蛋白，利用53～72浓度的硫酸铵盐析，沉淀部分在冰冻离心机以12000r/min离心20min；

步骤3：去盐；把步骤2沉淀加入冰盐浴中，利用14000分子透析膜透析去盐，取得上清液备用；

步骤4：二次去杂；把步骤3中的上清液加入丙酮，在冰冻离心机中以4200r/min离心20min，静置，然后溶于蒸馏水中透析除丙酮；

步骤5：提纯；步骤4酶液加入硫酸锌离心、水透析去盐。

作为本发明的一种具体实施方式，所述步骤2中硫酸盐浓度为65％。

作为本发明的一种具体实施方式，所述步骤4中丙酮采用-20℃丙酮试剂。

作为本发明的一种具体实施方式，所述步骤5中锌离子浓度为8mol/L。

作为本发明的一种具体实施方式，所述步骤5中离心转速为4800r/min。