一种h2o2稳定性提高的过氧化物酶突变体及其在染料脱色中的应用

文档序号：1932625 发布日期：2021-12-07 浏览：15次 >En<

阅读说明：本技术 一种h2o2稳定性提高的过氧化物酶突变体及其在染料脱色中的应用 (H2O2Peroxidase mutant with improved stability and application thereof in dye decolorization ) 是由荚荣黄文汉于 2021-10-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种H-(2)O-(2)稳定性提高的过氧化物酶突变体及其在染料脱色中的应用。本发明基于真菌IrpexlacteusF17(CCTCC AF 2014020)的染料脱色过氧化物酶Il-DyP4的晶体结构及氨基酸序列,对Il-DyP4的207位Met进行定点突变。实验通过表达菌株的构建、大肠杆菌的异源表达、变性、复性和纯化,得到Il-DyP4的突变体M207V。本发明的突变体M207V对蒽醌染料氧化的酶活力与Il-DyP4相近,并且对H-(2)O-(2)的稳定性明显高于Il-DyP4,为利用生物酶法处理染料工业废水奠定基础。(The invention discloses a method for producing H 2 O 2 Peroxidase mutants with improved stability and their use in dye decolorization. The invention carries out site-directed mutagenesis on the 207-Met of Il-DyP4 based on the crystal structure and amino acid sequence of the dye decolorization peroxidase Il-DyP4 of fungus IrpexlateusF 17(CCTCC AF 2014020). Experiment through constructing expression strain, heterogeneously expressing colibacillus, denaturating, renaturing and purifying, mutant M207V of Il-DyP4 is obtained. The mutant M207V of the invention has enzyme activity on anthraquinone dye oxidation similar to that of Il-DyP4 and on H 2 O 2 The stability of the enzyme is obviously higher than Il-DyP4, and a foundation is laid for treating dye industrial wastewater by using a biological enzyme method.)

一种H2O2稳定性提高的过氧化物酶突变体及其在染料脱色中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种H₂O₂稳定性提高的过氧化物酶突变体及其在染料脱色中的应用。

背景技术

合成染料在工业中被广泛使用，每年有大量的合成染料被生产并以工业废水的方式排出。蒽醌染料是合成染料的主要类型之一，广泛应用于纺织、造纸、印刷、皮革等工业，具有毒性、耐氧化性和抗还原性等特性，不仅污染环境而且威胁人体健康。因此利用酶法脱色和氧化降解染料在染料工业废水治理方面显示出极大的应用前景。

染料脱色过氧化物酶(Dye-decolorizing peroxidase，DyP，EC 1.11.1.19)是一类新型的血红素过氧化物酶，分布于古生菌、细菌和真核微生物。该类酶对多种结构复杂的染料具有高效的脱色和降解能力，尤其是对蒽醌染料。因此，染料脱色过氧化物酶是一种潜在的、环境友好型的能够去除染料的生物酶。

染料脱色过氧化物酶的酶反应是以H₂O₂为电子受体，通过质子、电子转移和自由基的生成，使合成染料脱色和降解。但是，过量浓度的H₂O₂很容易导致酶失活，阻碍了其催化氧化反应的进行。因此，提高染料脱色过氧化物酶的H₂O₂稳定性具有更大的实际应用价值。

发明内容

本发明针对上述现有技术所存在的问题，提供了一种H₂O₂稳定性提高的过氧化物酶突变体及其在染料脱色中的应用。

本发明基于真菌IrpexlacteusF17(CCTCC AF 2014020)的染料脱色过氧化物酶Il-DyP4 的晶体结构及氨基酸序列，对Il-DyP4的207位Met进行定点突变。通过表达菌株的构建、大肠杆菌的异源表达、变性、复性和纯化，得到Il-DyP4的突变体M207V。本发明的突变体 M207V对蒽醌染料氧化的酶活力与Il-DyP4相近，并且对H₂O₂的稳定性明显高于Il-DyP4，为利用生物酶法处理染料工业废水奠定基础。

Il-DyP4晶体结构(PDB:7D8M)及207位Met如图1所示。

染料脱色过氧化物酶Il-DyP4的cDNA序列详见GenBank中Il-DyP4(MG209114)。

本发明过氧化物酶突变体M207V的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。

本发明过氧化物酶突变体M207V的构建方法，包括如下步骤：

步骤1：以质粒pET28a-DyP4为模板，通过PCR获得M207V线性质粒；

步骤2：将线性质粒末端磷酸化并连接，得到重组载体；

步骤3：通过热激法将重组载体转化到表达菌株；

步骤4：表达菌株的培养及突变体蛋白的诱导表达；

步骤5：变性、复性、纯化得到突变酶M207V。

本发明过氧化物酶突变体M207V的应用，是将其用于染料的脱色降解。

所述染料优选为蒽醌染料。

本发明过氧化物酶突变体M207V与不同浓度H₂O₂孵育30min后，在pH 3.5-5.0、温度35℃、H₂O₂浓度为0.4-1.0mmol/L的条件下分别以蒽醌染料Reactive Blue 4(RB4)、Reactive Blue 5(RB5)、Reactive Blue 19(RB19)、Reactive Blue 74(RB74)为底物进行染料脱色，结果表明突变体M207V的H₂O₂稳定性分别是Il-DyP4的6.2、4.8、6.3、6.4倍(酶对H₂O₂稳定性的结果是通过测定残余50％脱色率的H₂O₂浓度)。同时，突变体M207V具有与Il-DyP4相近的酶活力。该突变体在pH 3.5、温度35℃、H₂O₂浓度为0.1mmol/L的条件下对以上四种蒽醌染料氧化的酶活力分别达到81.36、34.38、24.9、74.07U/mg。综上所述，本发明得到的突变体M207V的H₂O₂稳定性相比于未突变的Il-DyP4有明显的提高，而且保持了Il-DyP4原有的酶活力，表明其对染料工业废水的处理具有更大的应用价值。

附图说明

图1本发明重组酶Il-DyP4的晶体结构及突变位点示意图。

图2本发明重组酶Il-DyP4及突变体M207V的SDS-PAGE电泳图。

图3本发明重组酶Il-DyP4及突变体M207V的紫外可见光谱扫描图。

图4突变体对蒽醌染料Reactive Blue 4(4a)、Reactive Blue 5(4b)、ReactiveBlue 19(4c)、 Reactive Blue 74(4d)氧化的酶活力，以未突变酶Il-DyP4为对照。

图5突变体氧化底物Reactive Blue 4(5a)、Reactive Blue 5(5b)、ReactiveBlue 19(5c)、 Reactive Blue 74(5d)的最适H₂O₂浓度，以未突变酶Il-DyP4为对照。

图6突变酶在最适反应条件下对Reactive Blue 4(6a)、Reactive Blue 5(6b)、Reactive Blue 19(6c)、Reactive Blue 74(6d)的H₂O₂稳定性，以未突变酶Il-DyP4为对照。

具体实施方式

下面详细说明本发明突变体的产生及性质研究，并且对实验结果进行分析。

实施例1：突变体M207V的制备

1、以质粒pET28a-DyP4作为模板，通过一步PCR的方法将207位Met(ATG)突变为Val(GTG)。如表1所示，为设计的引物序列(画横线的为突变位点)。

表1定点突变的引物序列

PCR反应体系及条件：总体系50μL，质粒pET28a-DyP4模板1μL，上下游引物各1μL，2×PrimeSTAR Max Premix 25μL，ddH₂O补至50μL。98℃预变性2min；98℃变性10s；55℃退火5s；72℃延伸40s；30个循环后72℃最后延伸10min，降至4℃保存。

PCR产物通过0.8％的DNA凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒对目的基因进行回收及纯化。

采用Blunting Kination Ligation(BKL)Kit对回收产物进行磷酸化和连接。表2所示为磷酸化体系。

表2磷酸化体系

反应液在37℃、70℃各反应10min进行磷酸化；加入5μLLigation Solution I混合，16℃反应1h进行连接。

通过热激法将连接产物转化至50μL体积的Escherichia coliRosetta(DE3)感受态细胞溶液中。

挑取单克隆进行测序，测序成功的菌株保藏于-80℃冰箱。

2、突变体的诱导表达

1)从测序成功的菌种中取出50μL加入到含有卡那霉素(终浓度为50μg/mL)和氯霉素 (终浓度为34μg/mL)的5mL LB液体培养基中活化，220rpm、37℃过夜培养；活化菌体转入到400mL含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)和氯霉素(终浓度为34μg/mL)的LB液体培养基中，220rpm、37℃培养3h至OD₆₀₀＝0.4～0.6，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，终浓度为0.5mM)在37℃诱导3-4h；8000rpm离心10min，弃上清；用50mL的Tris-HCl (50mM，pH 7.5)、0.4mL EDTA(500mM)、10μLPMSF(100mM)将菌体沉淀重悬溶解，超声破碎25min；4℃，12000rpm离心20min弃上清。

2)5mL尿素(8M)、5μL EDTA(500mM)将上述沉淀重悬，置于4℃3h。

3)将变性液加入到配置后的复性液中，使尿素浓度稀释为0.8M，复性液(45mL)：44.65 mL乙酸钠(10mM，pH 6.0)、100μL EDTA(500mM)、250μL氯高铁血红素(1mM)；4℃放置36h。

4)以500mL乙酸钠(10mM，pH 6.0))作为透析液，透析膜选择13-14kDa的孔径，在4℃透析24h；透析液在4℃，12000rpm离心20min，将上清液抽滤(过0.22μm的水系滤膜)，所得即为粗酶液(待进一步纯化)。

5)将上述粗酶液通过Ni-NTA亲和层析重力柱进一步纯化，蛋白上样后，用40mM咪唑洗脱杂蛋白，150mM咪唑洗下目的蛋白，用蛋白胶进行检验。

6)用消光系数法测量蛋白浓度，蛋白消光系数为222196M^-1cm^-1；用乙酸钠(10mM，pH 6.0)稀释成相应的浓度。

纯化结果如图2的SDS-PAGE电泳结果(分子量54kDa)和图3的紫外可见光谱所示。

实施例2：突变酶M207V的酶学性质测定

1、突变酶M207V的酶活力测定

选择四种蒽醌染料Reactive Blue 4、Reactive Blue 5、Reactive Blue 19、Reactive Blue 74 作为底物测定Il-DyP4及突变体酶活力。

酶活计算公式：

其中A代表吸光值的变化。

测定Il-DyP4及突变体M207V的酶活力；实验反应体系(1mL)：0.10mol/L酒石酸钠缓冲液(pH 3.5)875μL，酶(浓度10μg/mL)50μL，0.1mmol/L染料50μL，0.1mmol/LH₂O₂25 μL，以不加酶作为对照组，以H₂O₂启动反应，在35℃反应2min，在分光光度计上测得吸光值。

结果如图4、表3所示，Il-DyP4对Reactive Blue 4、Reactive Blue 5、ReactiveBlue 19、 Reactive Blue 74氧化的酶活力分别为79.5、31.5、26.6、67.1U/mg，而M207V突变体对这四种蒽醌染料氧化的酶活力分别为81.4、34.4、24.9、74.1U/mg；由上述结果可知，M207V的酶活力与Il-DyP4相比无明显差别，这初步说明Il-DyP4的207位Met突变未改变酶的催化氧化能力。

表3 Il-DyP4及突变体M207V对不同染料氧化的酶活力

2、突变体M207V对四种蒽醌染料脱色的最适H₂O₂浓度

以未突变酶作为对照，测定突变体对不同蒽醌染料脱色的最适H₂O₂浓度。H₂O₂浓度设置为0.1、0.4、1.0、4.0、10.0、20.0、60.0、100.0、150.0、200.0、250.0mM。1mL反应体系为：0.10mol/L酒石酸钠缓冲液(pH 3.5)900μL，10μg/mL酶25μL，40mmol/L染料50μL (终浓度为0.1mmol/L)，加入25μL不同浓度的H₂O₂启动反应，实验的对照组不加酶，35℃水浴反应4min后测定吸光值，再计算脱色率。

脱色率计算公式：

表4突变体对四种蒽醌染料脱色的最适H₂O₂浓度及脱色率

如图5及表4所示，Il-DyP4分别在1.0、0.6、0.6、0.6mM的H₂O₂中对Reactive Blue4、 Reactive Blue 5、Reactive Blue 19、Reactive Blue 74具有最高的脱色率，而突变体M207V对四种蒽醌染料脱色的最适H₂O₂浓度分别为0.6、0.6、0.4、1.0mM，M207V对四种蒽醌染料脱色的最适H₂O₂浓度均与Il-DyP4相似，这说明对Il-DyP4的M207突变并没有明显改变酶反应的最适H₂O₂浓度。

3、突变体的H₂O₂稳定性

1)突变体与H₂O₂孵育不同时间的脱色率

以Reactive Blue 19为底物，H₂O₂浓度选择15mM，与酶共同孵育10、20、30、40、50、60min，分别测得突变体对Reactive Blue 19的脱色率；反应体系：0.10mol/L酒石酸钠(pH3.5) 912μL，孵育后的酶蛋白13μL(40μg/mL)，2mmol/LReactive blue 1950μL(终浓度为0.1 mmol/L)，16mmol/LH₂O₂(终浓度为0.4mmol/L)25μL；35℃水浴反应4min，计算其脱色率。

表5 M207V突变体与H₂O₂孵育不同时间对RB19的脱色率

如表5所示，Il-DyP4及M207V突变体在15mM的H₂O₂中孵育不同时间后对ReactiveBlue 19的脱色率，随着孵育时间的延长，Il-DyP4对Reactive Blue 19的脱色率逐渐降低，而 M207V突变体随孵育时间的延长对Reactive Blue 19的脱色率一直保持在90％左右，这说明突变体M207V的H₂O₂稳定性明显优于Il-DyP4。

2)以四种蒽醌染料为底物测定突变体的H₂O₂稳定性

①酶在不同浓度的H₂O₂中进行孵育，H₂O₂浓度设置为0、0.2、0.6、1.0、4.0、10.0、15.0、 20.0、30.0、40.0mM，孵育体系(150μL)：用0.10mol/L酒石酸钠缓冲液(pH 5.5)将H₂O₂(400 mmol/L)稀释成不同浓度，并与60μL酶(100μg/mL)混合，酶与不同浓度H₂O₂在25℃孵育30min。

②用H₂O₂孵育后的酶对四种蒽醌染料脱色，脱色反应体系(1mL)：0.10mol/L酒石酸钠缓冲液(反应pH根据酶对不同底物的最适pH设置：Reactive Blue 4(pH 5.0)、ReactiveBlue 5(pH 3.5)、Reactive Blue 19(pH 4.5)、Reactive Blue 74(pH 5.0))912μL，上述孵育后的酶(40μg/mL)13μL，2mmol/L染料50μL(终浓度为0.1mmol/L)，25μLH₂O₂(浓度见表 4中最适H₂O₂浓度)，加入酶启动反应，实验的对照组不加酶，35℃水浴反应4min后测定吸光值，再计算脱色率。

表6突变体对四种蒽醌染料氧化的H₂O₂稳定性

a孵育30分钟后Il-DyP4残余50％脱色率的H₂O₂浓度；

b孵育30分钟后M207V残余50％脱色率的H₂O₂浓度；

c酶孵育30分钟后对蒽醌染料脱色，M207V残余50％脱色率的H₂O₂浓度除以Il-DyP4残余50％脱色率的H₂O₂浓度。

如表6所示，相比于Il-DyP4，M207V突变体的H₂O₂稳定性均有明显的提高，具体表现为：分别以Reactive Blue 4、Reactive Blue 5、Reactive Blue 19、Reactive Blue 74为底物测定 H₂O₂稳定性，M207V分别是Il-DyP4的6.2、4.8、6.3、6.4倍；如图6所示，在15mM的H₂O₂中孵育30min后，M207V对Reactive Blue 4、Reactive Blue 5、Reactive Blue 19、Reactive Blue 74的脱色率分别达到48.9、77.6、92.7、37.6％，而Il-DyP4对四种蒽醌染料的脱色率分别是13.1、29.8、19.5、6.8％。因此，突变体M207V的H₂O₂稳定性提高明显，增强了该酶的实际应用价值。

SEQ ID NO:1的氨基酸序列：

MHVKRARSTP LIGSFPGQPP LPTIAQVQST SAGNDSLPFE NIQGDILVGM KKDKEKFVFF 60

HINNATAFKS VLKTYAPANI TSVATIIGPV ANQPLAFVNL AFSHAGFGAL NVTDDLQDTA 120

FSDGQFKDSP NLGDDTSTWE EAFKGTNVDG VFLIGSNDES ITAQYRDDLN AKFGDAWTIV 180

YDLDSAARPG NEKGHEHFGY LDGISNPTIP GFGTPHPGQA VVDPGIIFTG RSKDPVVNRP 240

SWALDGSFLV FRKLKQLVPE FNKYVLDNAL QNQAGNLTVE EGAELLGSRM FGRWKSGAPI 300

DLSPDFDDPA LGNDIERNNN FNYSHPGSDL ATDQTRCPFT AHIRKTNPRD LEGQGLFGDT 360

FHAIRAGTPY GPEVTDYEAS SNTTTIDRGL AFVEYQSVIG NGFRFQQQAW ANNPRFPFSK 420

GPSIQLGLDP VIGQGSPRET FGLDPRNASE SFTVPQVIIS NGGEYFFSPS ITAIVEKFAA 480

<110> OrganizationName : 安徽大学

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<120> Title : 一种H2O2稳定性提高的过氧化物酶突变体及其在染料脱色中的应用

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