毛竹抗坏血酸过氧化物酶基因PeAPX4及其应用
阅读说明：本技术 毛竹抗坏血酸过氧化物酶基因PeAPX4及其应用 (Phyllostachys pubescens ascorbic acid peroxidase gene PeAPX4 and application thereof ) 是由 李雪平 杨旸 宋笑龙 李夷骞 于 2021-07-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了毛竹抗坏血酸过氧化物酶基因PeAPX4及其应用。PeAPX4基因及其编码蛋白质的序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。本发明首次从毛竹中克隆得到PeAPX4基因并通过在拟南芥中过表达该基因验证了其生物学功能。PeAPX4基因具有调控植物抗逆性的功能,能够为毛竹转基因研究提供有力支持,为毛竹分子育种提供有价值的候选基因。(The invention discloses a moso bamboo ascorbic acid peroxidase gene PeAPX4 and application thereof. The sequences of the PeAPX4 gene and the protein coded by the gene are respectively shown as SEQ ID NO. 1 and SEQ ID NO. 2. The invention clones the PeAPX4 gene from the moso bamboo for the first time and verifies the biological function by over-expressing the gene in arabidopsis thaliana. The PeAPX4 gene has the function of regulating and controlling plant stress resistance, can provide powerful support for moso bamboo transgenic research, and provides valuable candidate genes for moso bamboo molecular breeding.)
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地说，涉及毛竹抗坏血酸过氧化物酶基因PeAPX4及其应用。
背景技术
毛竹(Phyllostachys edulis)是禾本科(Gramminales)竹亚科(Bambusoideae)刚竹属(Phyllostachys)散生竹种。毛竹具有成材快，可再生等多种优势，更在生物能源开发，防治水土流失等方面具有巨大潜力。在影响毛竹生长的诸多因素中，水分是对其正常生长发育影响最大的因素之一。近年来，受全球气候变暖的影响，毛竹的主要生长地年降水量逐年减少，干旱问题频发，大大影响了竹子的生长状况，也降低了毛竹的经济收益。在南竹北移工作中，最难克服的也是引种地降水少，土地盐碱度高的问题。因此，进行毛竹的竹种改良，培育抗早、抗盐性强的毛竹新品种非常必要。研究逆境条件下毛竹体内相关基因的功能则是进行新品种培育的分子基础工作，对于揭示竹子的抗逆分子机制，进而突破常规育种的局限性，加快竹子育种进程具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供毛竹抗坏血酸过氧化物酶基因PeAPX4及其应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供毛竹抗坏血酸过氧化物酶基因PeAPX4，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：
(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。
毛竹PeAPX4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明采用如下方法克隆得到PeAPX4基因：
⑴以毛竹叶和根为材料提取总RNA，并将提取得到的总RNA反转录为cDNA。本发明中，可以采用本领域常用的提取细胞总RNA的方法进行毛竹总RNA的提取，例如Trizol法。
⑵将提取得到的毛竹总RNA反转录合成cDNA。本发明中，可以采用本领域常规的cDNA合成方法，例如可采用Promega公司的cDNA合成试剂盒进行cDNA的合成。
(3)在得到cDNA之后，进行PeAPX4基因的PCR扩增，得到目的片段。
本发明中，PeAPX4基因PCR扩增的体系优选为：10×PCR Buffer 2.0μL，2.5mMdNTP Mix 2.0μL，上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，cDNA模板2.0μL，LA Taq DNA聚合酶0.2μL，ddH2O 11.8μL。PCR扩增反应程序优选为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸53s，35个循环；72℃10min；4℃保存。
用Oligo7软件设计引物扩增PeAPX4基因。引物序列如下：
上游引物：5′-ATGGCGGCTCCGGTGGTGG-3′
下游引物：5′-TTACTTGCTCCTCTTGGAAG-3′
⑷PCR扩增得到目的片段后，对目的片段进行测序，得到PeAPX4基因。在PCR扩增后对目的片段进行纯化，对于纯化的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的DNA纯化试剂盒进行即可。
⑸纯化完成后，将纯化后的目的片段连接到pGEM-T Easy载体，导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经菌落PCR验证为阳性克隆后进行测序。
第二方面，本发明提供含有毛竹PeAPX4基因的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌、转基因细胞系或非可再生的植物部分。
第三方面，本发明提供毛竹PeAPX4基因或含有该基因的生物材料在植物抗逆调控(提高植物抗逆性)中的应用。其中，所述抗逆是指抗干旱、耐盐和耐低温。
本发明所述植物包括但不限于拟南芥、毛竹。
第四方面，本发明提供毛竹PeAPX4基因或含有该基因的生物材料在制备转基因植物中的应用。
第五方面，本发明提供本发明还提供毛竹PeAPX4基因或含有该基因的生物材料在植物育种中的应用。
所述育种目的是为提高植物抗胁迫能力。PeAPX4基因参与毛竹干旱、盐、低温胁迫应答，逆境胁迫可诱导该基因的表达。
第六方面，本发明提供一种提高植物抗旱抗盐能力的方法，包括：利用基因工程手段，在植物中过量表达毛竹PeAPX4基因。
所述过表达的方式选自以下1)～5)，或任选的组合：
1)通过导入具有所述基因的质粒；
2)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；
3)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列；
4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接；
5)通过导入增强子。
本发明中，携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中。
进一步地，可采用农杆菌介导法将毛竹PeAPX4基因转入到拟南芥植株中，获得该基因过表达的转基因植株。
优选地，将毛竹PeAPX4基因构建到植物表达载体pCAMBIA2300上，转化农杆菌，然后浸染拟南芥花序，筛选转基因植株。
在本发明的一个
具体实施方式
中，植物表达载体pCAMBIA2300-PeAPX4的构建方法如下：
以反转录合成的cDNA为模板，进行PCR反应，在PeAPX4基因的上、下游分别引入EcoRI和KpnI酶切位点；将扩增产物连接到pGEM-T Easy载体，转化DH5α感受态细胞，进行序列测定；提取质粒，经EcoRI和KpnI双酶切的PeAPX4基因片段与pCAMBIA2300-CaMV35S连接，转化，提取质粒，进行序列测定，植物表达载体pCAMBIA2300-PeAPX4构建完成。
转基因拟南芥的制备方法如下：
将构建的植物表达载体pCAMBIA2300-PeAPX4转化农杆菌菌株GV3101感受态；选取阳性克隆摇菌，花序浸染及纯合子种子筛选；提取拟南芥阳性苗叶片RNA，反转录成cDNA，用引物PeAPX4-F(5′-CGGAATTCATGGCGGCTCCGGTGGTGG-3′)和PeAPX4-R(5′-GGGGTACCTTACTTGCTCCTCTTGGAAG-3′)进行PCR鉴定。
第七方面，本发明提供按照上述方法获得的转基因植物在植物育种中的应用。
育种方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。
本发明首次揭示了毛竹PeAPX4基因的生物学功能，通过构建PeAPX4基因表达载体，结合农杆菌介导的遗传转化法，异源转化拟南芥，考察PeAPX4对转基因拟南芥抗逆性的影响，并同时检测PeAPX4对毛竹干旱和盐胁迫的响应，为毛竹转基因研究提供有力工具，为毛竹抗性分子育种提供有价值的候选基因。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中PeAPX4基因克隆PCR产物电泳图(A)以及PCAMBIA2300-PeAPX4酶切产物电泳图(B)；其中，A中泳道1-2为PeAPX4基因克隆PCR产物，B中泳道1-2为PCAMBIA2300-PeAPX4酶切产物，M为DNAMarker。
图2为本发明较佳实施例中转PeAPX4基因拟南芥和野生型拟南芥在干旱胁迫下的表型分析。其中，A为将7d大小的拟南芥幼苗移栽至含不同浓度甘露醇培养基上；B为A中幼苗生长至苗龄14d。
图3为本发明较佳实施例中盐胁迫下PeAPX4基因在毛竹根和叶中的表达分析。
图4为本发明较佳实施例中干旱胁迫下PeAPX4基因在毛竹根和叶中的表达分析。
图5为本发明较佳实施例中低温胁迫下PeAPX4基因在毛竹根和叶中的表达分析。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1毛竹抗坏血酸过氧化物酶基因PeAPX4的克隆
以毛竹叶片为材料，按照Trizol RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书方法提取叶片总RNA，取1ng RNA按照反转录试剂盒(Promega，USA)反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物。根据毛竹基因组数据库http://www.forestrylab.org/db/PhePacBio/ExtractSeq/phe/index.php，用Oligo7软件设计引物扩增PeAPX4基因。
上游引物：5′-ATGGCGGCTCCGGTGGTGG-3′
下游引物：5′-TTACTTGCTCCTCTTGGAAG-3′
聚合酶链式反应：
20μL反应体系：10×PCR Buffer 2.0μL，2.5mM dNTP Mix 2μL，上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，cDNA模板2.0μL，LA Taq DNA聚合酶0.2μL，ddH2O 11.8μL。
PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸53s，35个循环；72℃10min；4℃保存。
回收产物连接到pGEM-T Easy载体，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆进行菌斑PCR检测，阳性克隆进行测序(上海生工生物工程公司)，测序结果准确无误。PeAPX4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例2植物表达载体pCAMBIA2300-PeAPX4的构建
设计引物(PeAPX4-F和PeAPX4-R)进行聚合酶链式反应，在目的基因PeAPX4的上下游分别引入EcoRI和KpnI双酶切位点，产物连接到pGEM-T Easy载体(Promega公司)，转化DH5α感受态细胞，进行序列测定，提取质粒，经EcoRI和KpnI双酶切的PeAPX4基因片段与经同样的酶酶切的pCAMBIA2300-CaMV35S载体连接，转化，提取质粒，进行序列测定。
上游引物PeAPX4-F：5′-CGGAATTCATGGCGGCTCCGGTGGTGG-3′
下游引物PeAPX4-R：5′-GGGGTACCTTACTTGCTCCTCTTGGAAG-3′
⑴以毛竹叶片cDNA为模板进行PCR反应
20μL反应体系：10×PCR Buffer 2.0μL，2.5mM dNTP Mix 2μL，上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，cDNA模板2.0μL，LA Taq DNA聚合酶0.2μL，ddH2O 11.8μL。
PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸53s，35个循环；72℃10min；4℃保存。
⑵扩增产物回收及连接
回收片段连接到pGEM-T Easy载体，转化DH5α感受态细胞，进行序列测定，测序结果准确无误。
(3)表达载体pCAMBIA2300-CaMV35S-PeAPX4的构建
用EcoRI和KpnI双酶切连接有PeAPX4片段的pGEM-T Easy(图1，A)，与EcoRI和KpnI双酶切的表达载体pCAMBIA2300-CaMV35S(Promega公司，美国)构建重组质粒，酶切体系如下(50μL)：
37℃酶切4h；产物经过琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒(Axygen)回收质粒pCAMBIA2300-CaMV35S大片段和PeAPX4小片段。用T4 DNA连接酶连接两个回收产物，连接反应体系如下(20μL)：
4℃过夜连接反应。将连接产物全部转化DH5α感受态细胞。37℃过夜培养，挑选单克隆，菌落PCR验证后，扩大培养，提取质粒pCAMBIA2300-PeAPX4，进行测序和酶切验证(图1，B)，植物重组表达质粒构建成功。
实施例3植物表达载体pCAMBIA2300-PeAPX4转化拟南芥
⑴冻融法转化农杆菌GV3101菌株
将1ng重组表达载体质粒，加入100μL感受态细胞GV3101中，冰浴10min后，将感受态细胞在液氮中速冻5min，迅速转移至37℃恒温水浴锅中水浴5min，然后置于冰上5min，于离心管中加入600μL的LB液体培养基，在28℃摇床中震荡培养2-3h，复苏菌体。吸取60μL菌液涂布在含有Kan抗性(50mg/mL)和Rif(50mg/mL)抗性的YEP固体培养基中，于28℃恒温摇床中倒置平板培养2-3d左右，至长出白色菌落。挑取单克隆菌落PCR检测后，选取阳性克隆摇菌培养。
⑵拟南芥花序浸染
将上述阳性克隆接种于10mL YEP(含有50μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素)液体培养基中，28℃培养箱震荡培养(160rpm)12h，取2mL培养液转移至200mL YEP(含有50μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素)中，进行大量培养，28℃培养箱震荡培养(160rpm)12h，培养液浓度OD600达到1.8-2.2μg/mL，取50mL培养液，用50mL离心管，4℃5000rpm离心5min，用转化液(含5％蔗糖的MS培养基2.2g，调pH至5.8，加0.2％SilwetL-77混合)剧烈悬浮，将沉淀稀释至1.0μg/mL，得到侵染液。取约200mL侵染液。将刚开花的拟南芥地上部浸泡于侵染液中3min，用保鲜膜包裹植株，暗培养12-16h后，去除保鲜膜，将植株置于培养箱中培养，待采收种子。
(3)纯合子筛选
将T0代拟南芥种子置于离心管中，加1mL 70％酒精消毒5min后，再用2.6％次氯酸钠溶液1mL，消毒10min，然后用无菌水清洗5遍。将种子均匀播种于筛选培养基(1/2MS+100mg/L卡那霉素)上，经4℃低温纯化2d后置于人工气候培养箱中培养至长出4片子叶，将绿色的、正常生长的阳性植株移栽至土壤中栽培，待成熟后分单株收取T1代种子，应用同样的方法筛选T1代幼苗，统计T1代各株系阳性植株与非阳性植株的比例，并将比例约为3:1的株系的阳性植株移栽至土壤中培养，获得T2代种子。应用同样方法筛选T2代幼苗，获得T3代种子。
⑷阳性植株的PCR鉴定
提取阳性拟南芥叶片RNA，反转录成cDNA，用引物PeAPX4-F、PeAPX4-R进行PCR鉴定。发现阳性植株中均含有PeAPX4，表明PeAPX4成功转入拟南芥。
实施例4转PeAPX4基因拟南芥抗逆性分析
干旱胁迫下，观察转基因植株的表型。在含有50mmol·L-1和100mmol·L-1甘露醇培养基上生长7天后，PeAPX4转基因植株和野生型生长差异不明显，但在含有150mmol·L-1和200mmol·L-1甘露醇培养基上，PeAPX4转基因植株与野生型植株相比，侧根数量和根的长度明显高于野生型，植株的整体长势也好于野生型。尤其是在含有200mmol·L-1甘露醇培养基上生长7天后，野生型植株叶片几乎全部失绿，转基因植株长势良好(图2)。
实施例5干旱、盐、低温胁迫下毛竹PeAPX4基因表达量分析
⑴材料处理
毛竹种子采集于广西壮族自治区，置于恒温光照培养箱中，昼夜温度是25℃/18℃，光周期为光/暗16h/8h，培养至三个月左右，用200mM NaCl、20％PEG6000、4℃分别模拟高盐、干旱和低温胁迫，取处理后0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、120h的幼嫩的主根和须根以及相同部位的叶片，在液氮中迅速冷冻，-80℃冷冻保存。
⑵cDNA模板的合成
利用Trizol Reagent试剂提取毛竹实生苗根、幼茎及叶片中的总RNA，使用无RNA酶的DNase I(TIANDZ)去除基因组DNA，用紫外分光光度计测量A260与A280的比值及RNA浓度，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA扩增条带的亮度和完整性，通过Promega公司的反转录试剂盒合成cDNA第一条链，合成产物置于-20℃冰箱保存。
(3)实时荧光定量PCR
通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)，检测目的基因表达情况。将TIP41基因(GenBank:FP092936.1)作为内参基因，TIP41-F：5'-AAAATCATTGTAGGCCATTGTCG-3'，TIP41-R：5'-ACTAAATTAAGCCAGCGGGAGTG-3'；
PeAPX4 5-F:5'-CTAAGGAGCCTCTGAAGTTTG-3'
PeAPX4 5-R:5'-CGTACAGGTAGCCCACGATA-3'。
10μL反应体系如下：
反应程序：95℃1min；95℃10s，62℃10s，72℃20s，45个循环。
其他反应参数均为系统默认设置，每个反应设置3个生物学重复，用Roche Light480仪分析数据，利用2-ΔΔCT法分析3次生物学实验数据，用Excel进行作图。
⑷实验结果与分析
干旱、盐、低温胁迫处理后，分别检测PeAPX4基因在毛竹实生苗根和叶片中的表达情况，结果如图3～图5所示：在盐处理后，PeAPX4在叶片和根中的表达量明显上调，处理72h表达水平达到峰值，分别为对照组的7.1倍和9.3倍；在干旱处理后，PeAPX4在叶片和根中的表达量大致呈先上升后下降趋势，处理48h表达水平达到峰值，分别为对照组的12.3倍和22.3倍；在低温处理后，PeAPX4在叶片受到明显诱导表达，但在根中的表达量变化不大。表明PeAPX4基因可能参与毛竹干旱、低温和盐胁迫应答过程。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 国际竹藤中心
<120> 毛竹抗坏血酸过氧化物酶基因PeAPX4及其应用
<130> KHP211118397.3
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 876
<212> DNA
<213> 毛竹(Phyllostachys edulis)
<400> 1
atggcggctc cggtggtgga cgccgagtac ctgcgccagg tcgacagggc gcgccgcgac 60
ctccgcgccc tcatctcctc caagggctgc gcgcccataa tgctccgcct cgcatggcat 120
gatgctggca catacgatgt gagcacaaaa actggtggtg caaatggttc aatcagattt 180
gaggaagagt acacccatgg ttcaaatgct ggtttaaaaa tatctattga tctcctcgag 240
cctattaaag caaagaatcc aaggattaca tatgcagacc tttatcagct ttctggagtg 300
attgcagttg aagttactgg gggcccaacc attgagttca ttccaggaag acgtgattca 360
tcggtttgcc cccgtgaagg gcgtctacct gatgctaaga aaggtgcacc acatctgagg 420
gacatctttt atcggatggg cttaacagac aaagatattg tagctttatc tgggggccac 480
actctgggaa gggcgcatcc tgaaaggtct ggatttgaag gtgtatggac taaggagcct 540
ctgaagtttg acaactcata ctttcttgag ctactgaagg gggaatctga ggggcttctg 600
aagcttccta ctgataaagc attgttggaa gatcctgaat ttagacgcta tgtggagctt 660
tatgcaaagg atgaggatgc cttcttcaag gactatgctg aatcacacaa gaaactttct 720
gaacttggct tcactccacg gagcagcggc ccagcatcta caaaatcaga tctttcaact 780
gttgttgtac tcgcacagag tgccgtcggg gtagcagttg ctgcagctgt agttatcgtg 840
ggctacctgt acgaggcttc caagaggagc aagtaa 876
<210> 2
<211> 291
<212> PRT
<213> 毛竹(Phyllostachys edulis)
<400> 2
Met Ala Ala Pro Val Val Asp Ala Glu Tyr Leu Arg Gln Val Asp Arg
1 5 10 15
Ala Arg Arg Asp Leu Arg Ala Leu Ile Ser Ser Lys Gly Cys Ala Pro
20 25 30
Ile Met Leu Arg Leu Ala Trp His Asp Ala Gly Thr Tyr Asp Val Ser
35 40 45
Thr Lys Thr Gly Gly Ala Asn Gly Ser Ile Arg Phe Glu Glu Glu Tyr
50 55 60
Thr His Gly Ser Asn Ala Gly Leu Lys Ile Ser Ile Asp Leu Leu Glu
65 70 75 80
Pro Ile Lys Ala Lys Asn Pro Arg Ile Thr Tyr Ala Asp Leu Tyr Gln
85 90 95
Leu Ser Gly Val Ile Ala Val Glu Val Thr Gly Gly Pro Thr Ile Glu
100 105 110
Phe Ile Pro Gly Arg Arg Asp Ser Ser Val Cys Pro Arg Glu Gly Arg
115 120 125
Leu Pro Asp Ala Lys Lys Gly Ala Pro His Leu Arg Asp Ile Phe Tyr
130 135 140
Arg Met Gly Leu Thr Asp Lys Asp Ile Val Ala Leu Ser Gly Gly His
145 150 155 160
Thr Leu Gly Arg Ala His Pro Glu Arg Ser Gly Phe Glu Gly Val Trp
165 170 175
Thr Lys Glu Pro Leu Lys Phe Asp Asn Ser Tyr Phe Leu Glu Leu Leu
180 185 190
Lys Gly Glu Ser Glu Gly Leu Leu Lys Leu Pro Thr Asp Lys Ala Leu
195 200 205
Leu Glu Asp Pro Glu Phe Arg Arg Tyr Val Glu Leu Tyr Ala Lys Asp
210 215 220
Glu Asp Ala Phe Phe Lys Asp Tyr Ala Glu Ser His Lys Lys Leu Ser
225 230 235 240
Glu Leu Gly Phe Thr Pro Arg Ser Ser Gly Pro Ala Ser Thr Lys Ser
245 250 255
Asp Leu Ser Thr Val Val Val Leu Ala Gln Ser Ala Val Gly Val Ala
260 265 270
Val Ala Ala Ala Val Val Ile Val Gly Tyr Leu Tyr Glu Ala Ser Lys
275 280 285
Arg Ser Lys
290
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种转氨酶突变体及其编码基因与应用