染料脱色过氧化物酶StDyP用于同时降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的应用
阅读说明：本技术 染料脱色过氧化物酶StDyP用于同时降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的应用 (Application of dye decolorization peroxidase StDyP in simultaneous degradation of aflatoxin and zearalenone ) 是由 秦星 罗会颖 王晓璐 涂涛 苏小运 张�杰 黄火清 柏映国 王苑 王亚茹 姚斌 于 2021-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明涉及农业生物技术领域,具体涉及染料脱色过氧化物酶StDyP用于同时降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的应用。所述染料脱色过氧化物酶StDyP的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明获得了染料脱色过氧化物酶StDyP,将其应用在霉菌毒素脱毒方面,其能够有效降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮。(The invention relates to the technical field of agricultural biology, in particular to a dye decoloration peroxidase St DyP for the simultaneous degradation of aflatoxins and zearalenone. The dye decolorizing peroxidase St DyP is shown in SEQ ID NO 1. The invention obtains the dye decoloration peroxidase St DyP, when the compound is applied to the detoxification of mycotoxin, the compound can effectively degrade aflatoxin B1 and zearalenone.)
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及染料脱色过氧化物酶StDyP用于同时降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的应用。
背景技术
真菌毒素是由曲霉属、青霉属、镰刀属等真菌产生的有毒次级代谢产物，具有致癌性、致畸性、免疫毒性、神经毒性、生殖和发育毒性等特点，能通过粮食、饲料或食品进入到人和动物的体内，从而严重危害人和动物的健康。目前已报道的真菌毒素有400多种，根据毒素的来源，真菌毒素可划分为镰刀菌属真菌毒素、曲霉属真菌毒素、青霉属真菌毒素和麦角菌属真菌毒素，不同来源的真菌毒素又可根据毒素结构进一步细分，其中饲料中常见的真菌毒素包括黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、单端孢霉烯族毒素（脱氧雪腐镰刀菌烯醇）、赭曲霉毒素和伏马毒素。这些常见的真菌毒素不仅降低了饲料品质，而且还间接影响了畜禽的生产性能，对动物组织机能、健康产生了不利的影响，同时也带来了潜在的食品安全问题。
饲料质量安全是保障畜牧业健康发展的重点，解决饲料中真菌毒素污染问题是一个亟待解决的关键问题。真菌毒素普遍存在于国内饲料和原料中，其中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和伏马毒素是主要的真菌毒素。值得注意的是，饲料和原料中真菌毒素的污染往往不是单一毒素的，而是多种真菌毒素的同时污染。相关研究报道表明多种真菌毒素协同作用对动物健康和生长性能的毒害作用比单一真菌毒素作用更大。而大多数已报道的降解酶仅针对单一的毒素分子，无法有效地降解不同类型的毒素，迫切需要挖掘到能同时降解多种毒素至低毒或无毒的降解酶。
发明内容
本发明的目的在于提供染料脱色过氧化物酶StDyP用于同时降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的应用。
本发明的再一目的在于提供降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的方法。
根据本发明的染料脱色过氧化物酶StDyP用于同时降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的应用，其中所述染料脱色过氧化物酶StDyP的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
根据本发明的染料脱色过氧化物酶StDyP用于同时降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的应用，其中，编码上述染料脱色过氧化物酶StDyP的基因序列如 SEQ ID NO:2所示。
其中，该酶包括425个氨基酸，成熟的染料脱色过氧化物酶StDyP的理论分子量为45.5 kDa。
根据本发明的同时降解饲料中黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的方法包括使用染料脱色过氧化物酶StDyP降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的步骤，其中，所述染料脱色过氧化物酶StDyP的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
根据本发明的同时降解饲料中黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的方法，其中，所述方法包括构建含有编码所述染料脱色过氧化物酶StDyP的基因的重组载体的步骤。
根据本发明的同时降解饲料中黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的方法，其中，所述方法包括将所获得重组载体在宿主细胞中表达的步骤。
根据本发明的同时降解饲料中黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的方法，其中，编码所述染料脱色过氧化物酶StDyP的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
本发明提供了染料脱色过氧化物酶StDyP用于降解黄曲霉毒素的应用，其中，所述染料脱色过氧化物酶StDyP的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
本发明提供了染料脱色过氧化物酶StDyP用于降解玉米赤霉烯酮的应用，其中，所述染料脱色过氧化物酶StDyP的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
根据本发明的
具体实施方式
，所述包含上述染料脱色过氧化物酶StDyP编码基因的重组载体，优选为pCold I-StDyP。将本发明的染料脱色过氧化物酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的染料脱色过氧化物酶基因StDyP插入到质粒pColdI上的NdeI-XbaI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于cspA启动子和lac操纵子的下游并受其调控，得到重组大肠杆菌pG-Tf2/BL21质粒pCold I-StDyP。
根据本发明的具体实施方式，包含上述染料脱色过氧化物酶基因StDyP的重组菌株，优选为重组大肠杆菌pG-Tf2/BL21菌株E. coli pG-Tf2/BL21/StDyP。
通过比对NCBI数据库，与StDyP一致性最高的酶是来源于链霉菌属未知种的过氧化物酶EfeB，但是其生化性质未被报道。已验证生化功能的过氧化物酶与本发明的StDyP酶的一致性最高仅为43.1%。
本发明获得了染料脱色过氧化物酶StDyP，将其应用在霉菌毒素脱毒方面，其能够有效降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮。
附图说明
图1显示重组染料脱色过氧化物酶StDyP对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的降解率；
图2显示重组染料脱色过氧化物酶StDyP降解黄曲霉毒素B1的HPLC分析结果；
图3显示重组染料脱色过氧化物酶StDyP降解玉米赤霉烯酮的HPLC分析结果。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、基因及载体：大肠杆菌表达载体pCold I及菌株大肠杆菌pG-Tf2/BL21；
2、酶类及其它生化试剂：内切酶、重组酶、黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮。
3、培养基：大肠杆菌培养基LB (1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1% NaCl，pH 7.0)。
实施例1 染料脱色过氧化物酶StDyP编码基因的克隆
本发明的目的基因来源于链霉菌Streptomyces thermocarboxydus的染料脱色过氧化物酶StDyP。
序列特异性引物：
StDyP-F: SEQ ID NO:3；StDyP-R: SEQ ID NO:4。
以链霉菌Streptomyces thermocarboxydus的基因组DNA为模板进行PCR扩增。在1%琼脂糖凝胶上电泳，切胶得到目的片段，将该片段回收后与NdeI-XbaI双酶切的pCold I载体通过同源重组的方法相连，转化Trans I克隆宿主，测序验证，得到染料脱色过氧化物酶StDyP编码基因。
实施例2 重组染料脱色过氧化物酶StDyP的制备
将获得的含有染料脱色过氧化物酶基因StDyP的重组大肠杆菌表达质粒pCold I-StDyP转化大肠杆菌pG-Tf2/BL21，获得重组大肠杆菌 pG-Tf2/BL21/StDyP。
取E. coli pG-Tf2/BL21/StDyP菌株，接种于50 mL LB培养液中，37 ℃ 200 rpm振荡培养12 h后，按2%比例转接于300 mL LB培养基中，37 ℃ 200 rpm振荡培养约4 h(OD600≈0.6)，而后加入终浓度1 mM的诱导剂 IPTG和10 μM的Hemin溶液，于16 ℃ 200rpm诱导培养12 h后，离心收集菌体。将菌体重悬于平衡缓冲液（20 mM pH 7.4 Na2HPO4-NaH2PO4，500 mM NaCl）中。采取超声破碎法裂解菌体。将破碎后的菌体碎片离心去除，利用Ni亲和层析柱进行纯化，收集电泳纯的洗脱组分并透析至蛋白储存液（20 mM pH 7.4Na2HPO4-NaH2PO4）中。
实施例3 重组染料脱色过氧化物酶StDyP降解黄曲霉毒素B1
将黄曲霉毒素B1溶解到二甲基亚砜中配制成100 mg/L的母液，按如下反应体系：55 μL丙二酸缓冲液（0.2 M，pH 5.0），20 μL黄曲霉毒素B1溶液（100 mg/L），20 μL硫酸锰(10 mM)，100 μL染料脱色过氧化酶(500 U/L)，5 μL过氧化氢(4 mM)。以未加入染料脱色过氧化物酶的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行，72 h后加入等体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱（HPLC）分析黄曲霉毒素B1的降解率。液相色谱为岛津LC-20A高效液相色谱分析系统，色谱分离柱为Waters XBridge C18 column (4.6×150 mm, 5μm)，流动相A（水），流动相B (甲醇)；等梯度洗脱条件45%B洗脱20分钟；采用荧光检测器检测，激发波长360 nm，发射波长440 nm。
结果如图1、图2所示，可见部分黄曲霉毒素已被降解，降解率为21.03%。
实施例4 重组染料脱色过氧化物酶StDyP降解玉米赤霉烯酮
将玉米赤霉烯酮溶解到二甲基亚砜中配制成100 mg/L的母液，按如下反应体系：55 μL丙二酸缓冲液（0.2 M，pH 5.0），20 μL玉米赤霉烯酮溶液（100 mg/L），20 μL硫酸锰(10 mM)，100 μL染料脱色过氧化酶(500 U/L)，5 μL过氧化氢(4 mM)。以未加入染料脱色过氧化物酶的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行，72 h后加入等体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱（HPLC）分析玉米赤霉烯酮的降解率。液相色谱为岛津LC-20A高效液相色谱分析系统，色谱分离柱为Waters XBridge C18 column (4.6×150 mm, 5μm)，流动相A（水），流动相B (乙腈)；等梯度洗脱条件45%B洗脱20分钟；采用荧光检测器检测，激发波长274 nm，发射波长440 nm。
结果如图1、图3所示，可见部分玉米赤霉烯酮已被降解，降解率为45.37%。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 染料脱色氧化物酶StDyP用于同时降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 425
<212> PRT
<213> Streptomyces thermocarboxydus
<400> 1
Met Ala Asp Pro Ser Leu Ser Gln Thr Arg Thr Pro Glu Lys Glu Pro
1 5 10 15
Gln Ala Glu Ala Ala Ala Ser Gly Ile Ser Arg Arg Arg Leu Leu Gly
20 25 30
Thr Ala Gly Ala Thr Gly Leu Val Leu Gly Ala Ala Gly Gly Ala Val
35 40 45
Gly Tyr Ala Ser Ala Pro Thr Gly Ala Thr Pro Leu Thr Ser Val Gly
50 55 60
Ala Thr Lys Val Pro Phe His Val Lys His Gln Pro Gly Ile Thr Asp
65 70 75 80
Pro Leu Gln Ser Arg Gly His Leu Leu Ala Phe Asp Leu Arg Pro Gly
85 90 95
Ala Gly Arg Lys Glu Ala Ala Ala Leu Leu Arg Arg Trp Ser Asp Thr
100 105 110
Ala Arg Arg Leu Met Asp Gly Thr Phe Asp Ala Glu Gly Asp Ser Asp
115 120 125
Val Ala Arg Asp Ala Gly Pro Ser Ser Leu Thr Leu Thr Phe Gly Phe
130 135 140
Gly His Ser Phe Phe Ala Arg Thr Gly Leu Glu Arg Gln Arg Pro Ala
145 150 155 160
Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ala Phe Ser Ser Asp Arg Leu Asp Arg Ala
165 170 175
Arg Ser Asp Gly Asp Leu Trp Val Gln Ile Gly Ala Asp Asp Ala Leu
180 185 190
Val Ala Phe His Ala Leu Arg Ala Val Gln Lys Asp Ala Gly Ala Ala
195 200 205
Ala Arg Val Arg Trp Gln Met Asn Gly Phe Asn Arg Ser Pro Gly Ala
210 215 220
Thr Ala Arg Pro Met Thr Thr Arg Asn Leu Met Gly Gln Val Asp Gly
225 230 235 240
Thr Arg Asn Pro Lys Pro Asp Glu Pro Asp Phe Asp Gln Arg Ile Phe
245 250 255
Val Ala Glu Gln Gly Glu Pro Ala Trp Met Ala Asn Gly Ser Tyr Val
260 265 270
Val Val Arg Arg Ile Arg Met Leu Leu Asp Asp Trp Glu Lys Leu Ser
275 280 285
Leu Arg Glu Gln Glu Gly Val Ile Gly Arg Arg Lys Ala Asp Gly Ala
290 295 300
Pro Leu Ser Gly Gly Asp Glu Thr Thr Glu Met Asp Leu Glu Lys Thr
305 310 315 320
Asp Ala Gln Gly Asn Leu Val Val Pro Phe Asn Ala His Ala Arg Ile
325 330 335
Thr Arg Pro Asp Gln Asn Gly Gly Ala Ala Met Leu Arg Arg Pro Phe
340 345 350
Ser Tyr His Asp Gly Ile Asp Ala Asp Gly Thr Pro Asp Ala Gly Leu
355 360 365
Leu Phe Ile Cys Trp Gln Ala Asp Pro Leu Arg Gly Phe Val Pro Val
370 375 380
Gln Arg Lys Leu Asp Arg Gly Asp Ala Leu Thr Pro Phe Ile Arg His
385 390 395 400
Glu Ala Ser Gly Leu Phe Ala Val Pro Gly Gly Ala Ala Glu Gly Glu
405 410 415
Tyr Val Gly Gln Ala Leu Leu Glu Gly
420 425
<210> 2
<211> 1278
<212> DNA
<213> Streptomyces thermocarboxydus
<400> 2
atggctgacc cttccctgtc gcagacccgc acccccgaga aggagcccca ggcggaagcc 60
gccgcctccg gcatctcgcg gcggcgcctg ctcggcacgg ccggcgccac cgggctcgtg 120
ctcggggcgg ccggcggtgc cgtcgggtac gcgtcggcgc ccaccggagc cactccgctc 180
acctcggtcg gcgccacaaa agtcccgttt cacgtgaaac atcagccggg catcaccgac 240
ccgctccagt cgcgtggcca tctcctcgcc ttcgacctga ggcccggcgc cggacgcaag 300
gaggcggctg cgctgctgcg ccgctggtcc gacaccgccc ggcggctgat ggacgggacg 360
ttcgacgccg agggcgacag tgacgtggcc cgtgacgcgg ggccctcctc gctgaccctg 420
accttcggtt ttgggcacag cttcttcgcg cgcaccgggc tggagaggca gcgtccggcc 480
gccctggagc cgctgcccgc cttctcctcc gaccgcctcg accgggcccg cagcgacggg 540
gacctgtggg tgcagattgg cgccgacgac gccctcgtcg cgttccatgc cctgcgcgcg 600
gtgcagaagg acgcgggcgc ggcggcccgg gtgcgctggc agatgaacgg cttcaaccgg 660
tcgccgggcg ccaccgcccg cccgatgacc acccgcaatc tgatgggcca ggtcgacggc 720
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ctggacgact gggagaagct gtcgctcagg gagcaggagg gtgtcatcgg gcggcgcaag 900
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gacgcccagg gcaatctggt cgtcccgttc aacgcgcacg cacgcatcac ccggcccgac 1020
cagaacggcg gggcggcgat gctgcgccgg ccgttctcgt accacgacgg catcgacgcg 1080
gacgggacgc cggacgcggg gctgctgttc atctgctggc aggccgatcc gctgcgcggc 1140
ttcgtgccgg tgcagcgcaa gctcgaccgg ggcgacgccc tgacgccgtt catccgtcac 1200
gaggcgagcg ggctgttcgc cgtcccgggc ggggcggcgg agggtgagta tgtgggccag 1260
gcgctgctgg aggggtga 1278
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atcatcatat cgaaggtagg catatggctg acccttccct gtcgcagac 49
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttttaagcag agattaccta tctagacccc tccagcagcg cctggccc 48