草菇过氧化氢酶vcat及其编码基因和应用
阅读说明：本技术 草菇过氧化氢酶vcat及其编码基因和应用 (Volvariella volvacea (Volvariella volvacea) catalase VCAT as well as coding gene and application thereof ) 是由 赵妍 杨焕玲 陈明杰 游华芳 余昌霞 李正鹏 奚莉萍 冯爱萍 于 2019-09-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种草菇过氧化氢酶VCAT及其编码基因和应用。所述的草菇过氧化氢酶VCAT的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将草菇过氧化氢酶VCAT的核苷酸序列转入适合的宿主体内,通过使宿主表达过氧化氢酶,能够提高宿主的耐热性及耐冷性。本发明以大肠杆菌为模式生物,实验结果表明,转入草菇过氧化氢酶VCAT基因的大肠杆菌过量表达过氧化氢酶后获得了耐热性及耐冷性。本发明的草菇过氧化氢酶VCAT来源于真菌,能够转入适合的微生物宿主中,提高宿主的耐温度胁迫能力。(The invention discloses straw mushroom catalase VCAT and an encoding gene and application thereof. The amino acid sequence of the straw mushroom catalase VCAT is shown in SEQ ID NO.1, and the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO. 2. The nucleotide sequence of straw mushroom catalase VCAT is transferred into a proper host body, and the heat resistance and the cold resistance of the host can be improved by enabling the host to express the catalase. The invention takes escherichia coli as a model organism, and experimental results show that heat resistance and cold resistance are obtained after the escherichia coli with the straw mushroom catalase VCAT gene is transferred over to express catalase. The straw mushroom catalase VCAT is derived from fungi, can be transferred into a suitable microbial host, and improves the temperature stress resistance of the host.)
技术领域
本发明属于抗氧化酶技术领域，涉及一种草菇过氧化氢酶VCAT及其编码基因和应用。
背景技术
草菇[Volvariella volvacea(Bull.)Singer]隶属于担子菌纲、伞菌目、光柄菇科、小包脚菇属，原产于中国热带、亚热带地区，味道鲜美，市场广阔。草菇属于高温型食用菌，其菌丝体的最适生长温度为32-35℃，菌丝体或子实体在常规0-4℃的冷藏条件下会出现低温自溶现象，表现为组织***、液化、腐烂等。草菇的不耐低温的特性，严重影响了其菌种的低温保藏、子实体的采后贮藏与运输，阻碍了草菇产业的快速发展。
过氧化氢酶(catalase，CAT)是一种广泛存在于动植物体内的抗氧化酶之一，是由4个相同肽链亚基组成的四聚体血红素酶，具有保守的活化中心和铁血红蛋白结合位点，主要存在于细胞的过氧化物酶体、乙醛酸循环体和细胞质中，部分分布于线粒体和叶绿体内。
在植物中，CAT主要清除线粒体电子传递、β-脂肪酸氧化以及光呼吸等过程中产生的过氧化氢(H2O2)，以防止活性氧自由基对植物造成的伤害。植物在遭受生物或非生物胁迫时，细胞膜上的受体物质接收并传递胁迫信号，促发活性氧(ROS)。H2O2作为主要的活性氧物质，在植物中具有双重作用。适量的H2O2可以作为信号分子，参与响应各种胁迫信号途径，从而启动相关基因的表达，使植物产生耐受性；而当H2O2浓度过高时，则会导致氧化损伤，引起细胞程序性死亡。CAT作为H2O2专一清除剂，在植物抗逆性上起重要作用。
研究表明，CAT在植物生长发育、逆境胁迫防御应答、氧化衰老等生理过程中起着重要作用，且CAT属多基因家族，其表达活性受诸多生物和非生物因素的影响，如光照、温度、高盐、干旱、植物激素以及其他病原微生物。
通过增强抗氧化酶活性及增强活性氧代谢来提高植物的耐受性，已在农业生产领域广泛应用。蔡永智等将过氧化氢酶基因KatG转入棉花中，转基因棉花表现较好的抗旱性(蔡永智,祝建波,郝晓云等.转过氧化氢酶基因KatG棉花的抗旱性[J].西北农业学报,2013,22(12):56-61.)。葛菲等将火龙果CAT转化烟草，发现转基因烟草能够抵抗干旱和低温胁迫(葛菲.火龙果CAT基因在烟草中的遗传转化及功能分析[D].)。李恩义将小麦CAT基因导入水稻中，发现其具有较高CAT活性，提高了水稻的耐低温能力，可用于培育低温水稻(导入小麦过氧化氢酶培育耐低温水稻[J].生物技术通报,2001(3):48-49.)。POLIDOROSAN等在烟草中转入玉米CAT2能够减轻除草剂对烟草的毒性(Polidoros A N,Mylona P V,Scandalios J G.Transgenic tobacco plants expressing the maize Cat2 gene havealtered catalase levels that affect plant-pathogen interactions andresistance to oxidative stress[J].Transgenic Research,2001,10(6):555-569.)。上述方法均是通过过表达CAT提高植物的抗逆性，培育优质抗性的作物品种，只适用于植物体系中，目前未见对食用菌过氧化氢酶的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种草菇过氧化氢酶VCAT及其编码基因和应用。该草菇过氧化氢酶VCAT的核苷酸序列转入宿主体内，通过使宿主表达过氧化氢酶，提高宿主的耐热性及耐冷性，适用于微生物的品种培优。
本发明的草菇过氧化氢酶VCAT，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的草菇过氧化氢酶VCAT的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明提供含草菇过氧化氢酶VCAT基因的表达载体。
在本发明的
具体实施方式
中，所述的含草菇过氧化氢酶VCAT基因的表达载体为pBAR GPE1/VCAT，通过将含草菇过氧化氢酶VCAT基因的核苷酸片段与经BamH I和EcoRI双酶切后的pBAR GPE1质粒连接构建得到。
本发明还提供上述草菇过氧化氢酶VCAT在提高微生物耐热性及耐冷性中的应用。本发明中所述的微生物可以为真菌或者细菌。在本发明具体实施方式中，采用的微生物为大肠杆菌。
具体地，通过将含草菇过氧化氢酶VCAT基因的表达载体转入到微生物宿主细胞中，提高微生物的耐热性及耐冷性。在本发明的具体实施方式中，通过将含草菇过氧化氢酶VCAT基因的表达载体pBAR GPE1/VCAT转入到大肠杆菌中，提高大肠杆菌的耐热性及耐冷性。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明以草菇菌株V23为材料，获得了草菇过氧化氢酶VCAT基因的核苷酸序列及草菇过氧化氢酶VCAT的氨基酸序列。将草菇过氧化氢酶VCAT的核苷酸序列转入适合的宿主体内，通过使宿主表达过氧化氢酶，能够提高宿主的耐热性及耐冷性。本发明以大肠杆菌为模式生物，实验结果表明，转入草菇VCAT基因的大肠杆菌过量表达过氧化氢酶后获得了耐热性及耐冷性。本发明的草菇过氧化氢酶VCAT来源于真菌，由于真菌和细菌共使用同一套密码子，将其转入合适的微生物宿主中，能够提高宿主的耐温度胁迫能力。
附图说明
图1为过表达载体pBAR GPE1图谱；
图2为草菇过氧化氢酶VCAT的信号肽预测结果图；
图3为草菇过氧化氢酶VCAT的磷酸化位点预测结果图；
图4为草菇过氧化氢酶VCAT的跨膜结构预测结果图；
图5为pBAR GPE1/VCAT重组质粒PCR鉴定电泳图；
图6为pBAR GPE1/VCAT重组表达蛋白产物的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道1是经IPTG诱导后，含有pBAR GPE1/VCAT重组质粒的大肠杆菌蛋白的电泳图谱；泳道2是未用IPTG诱导，含有pBAR GPE1/VCAT重组质粒的大肠杆菌蛋白表达电泳图谱；泳道3是蛋白Marker；泳道4是经IPTG诱导后，含有pBAR GPE1空载体对照组大肠杆菌表达蛋白产物的电泳图谱；泳道5是未经IPTG诱导后，含有pBAR GPE1空载体对照组大肠杆菌表达蛋白产物的电泳图谱；
图7为热胁迫(50℃)下，转入草菇VCAT基因前后的大肠杆菌生长速率比较图；
图8为冷胁迫(4℃)下，转入草菇VCAT基因前后的大肠杆菌生长速率比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明以草菇菌株V23为材料，通过草菇基因组构建本地数据库，经本地Blast找到草菇过氧化氢酶VCAT基因保守序列，使用CE Design V1.04设计草菇VCAT基因的引物，从草菇基因组DNA中扩增出VCAT全基因片段，经PCR鉴定后，将目的片段与pBAR GPE1载体连接后转化到大肠杆菌中，送交生工生物工程(上海)有限公司测序，片段长度为2274bp，如SEQID NO.2所示，编码757个氨基酸，如SEQ ID NO.1所示。
由生物信息学分析得知，草菇过氧化氢酶VCAT氨基酸数量为757，蛋白的分子量约为84kDa，等电点(pI,isoelectric point)为6.40；不稳定系数为29.88，属于稳定蛋白；疏水性系数为-0.370，表明该蛋白具有亲水性。经NetPhos 3.1软件预测得知(图3)，草菇过氧化氢酶VCAT蛋白的Ser磷酸化位点为30个，Thr磷酸化位点为23个，Tyr磷酸化位点为8个。利用SignalP 5.0对草菇VCAT进行了信号肽的预测(图2)，结果表明该蛋白信号肽的概率为0.0017，其他的概率为0.9983，因此可判断草菇过氧化氢酶VCAT不存在信号肽，不属于分泌蛋白。经EMBnet Tmpred跨膜结构预测可知(图4)，从N端开始没有跨膜区，蛋白位于膜外概率为100％，因此草菇过氧化氢酶VCAT不是跨膜蛋白。
l.试验材料
1.1大肠杆菌菌株：Stbl3菌株。
1.2载体
表达载体为pBAR GPE1(购买于吉满生物科技有限公司)，全长5518bp，携带有氨苄青霉素(Amp)抗性基因。
2.试剂
表1 试剂及来源
3.仪器
表2 仪器及来源
仪器名称
仪器来源
稳压电泳仪
Bio-Rad
凝胶成像仪
海门市其林贝尔仪器制造有限公司
细菌摇床
上海一恒科学仪器有限公司
细菌培养箱
上海一恒科学仪器有限公司
PCR仪
Eppendorf
高速离心机
Thermo
一次性平皿
上海前尘生物
50ml聚丙烯管
Corning
移液器
Gilson
4.常用溶液的配制
4.1氨苄青霉素储存液：
将l g氨苄青霉素溶解于10mL去离子水中，使终浓度达到100mg/mL，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃储存备用。
4.2 IPTG：
将IPTG配制成24mg/mL(100mM)的水溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃储存备用。
4.3PBS缓冲液：
NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L，KH2PO4 1.76mmol/L，加蒸馏水定容至1000mL，调pH值至7.2-7.4。
4.4电极缓冲液(Running Buffer):
Tris 3.1g，甘氨酸18.8g，SDS l g，加蒸馏水定容至1L。
实施例1草菇V23中过氧化氢酶VCAT表达载体pBAR GPE1/VCAT的构建
首先通过目的片段草菇过氧化氢酶VCAT基因两端所含酶切位点将目的片段切出，将其连入同样经过酶切后的过表达载体pBAR GPE1上。然后将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落进行测序，比对正确的克隆即为构建成功的含草菇过氧化氢酶VCAT基因的过表达载体。
1.pBAR GPE1载体的双酶切
(1)将含有pBAR GPE1载体的Stbl3菌液过夜培养，并取新鲜菌液3-5mL提取质粒。具体方法参考QIAGEN质粒小抽说明书。
(2)取1μg新鲜质粒，用限制性内切酶BamH I和EcoRI进行双酶切。酶切体系如下：
载体
1μg
green Buffer
3μL
BamH I
1.5μL
EcoRI
1.5μL
ddH<sub>2</sub>O
补足30μL
于37℃酶切约3h。
(3)将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，进行胶回收，步骤如下：在紫外灯下，切下包含目的片段的胶条。用天平称量总重量并减去空管的重量算出凝胶的重量，按100mg＝100μL来计算凝胶的体积，并加入1倍凝胶体积的Binging Solution置于65℃水浴锅内将凝胶彻底融化。期间适当摇晃EP管，加快凝胶的溶解。
(4)将上述液体全部转移到滤柱内，13000rpm离心30S(重复一次)。然后弃掉管内液体，向柱内加入500μL的WA Solution，13000rpm离心30S。弃掉管内液体，再向柱内加入500μL的Wash Solution，13000rpm离心30S(重复一次)。然后空离3min。将滤柱放置在一个新的1.5mL EP管中，室温晾干。最后在柱子内加入35μL的ddH2O，静置5min，13000rpm离心1.5min。为了提高回收率，可将溶解的DNA再次加入柱子内离心1min。弃掉柱子，即为回收的载体片段，并测定浓度。
2.含草菇过氧化氢酶VCAT基因的质粒的酶切
(1)将含草菇过氧化氢酶VCAT基因的质粒用限制性内切酶BamH I和EcoRI进行双酶切，酶切体系如下：
VCAT质粒
0.7μg
green Buffer
5μL
BamH I
2.5μL
EcoRI
2.5μL
ddH<sub>2</sub>O
补足50μL
于37℃酶切约1h。
(2)将酶切产物进行琼脂糖电泳并回收目的片段，方法同上。
3.过表达载体与目的片段的连接
(1)测定回收pBAR GPE1载体和目的片段草菇过氧化氢酶VCAT的浓度，并按载体：目的片段＝1:7的摩尔比例计算载体和目的片段所需的体积比。
(2)过表达载体pBAR GPE1与目的片段草菇过氧化氢酶VCAT的连接。连接体系如下：
回收载体
70ng
目的片段
计算值
T4 DNA连接buffer
2μL
T4 DNA连接酶
1μL
ddH<sub>2</sub>O
补足20μL
于22℃连接60min。
4.转化
(1)将感受态细胞Stbl3置于冰上(4℃)待其自然解冻后，取10μL连接产物加入感受态细胞中于冰上(4℃)放置30min。
(2)之后于42℃水浴中热激90S。然后迅速置于冰上(4℃)放置2-3min。
(3)加入500μL不含抗生素的LB培养基于37℃、225rpm振荡培养45min。
(4)3000rpm离心2min，弃掉900μL的上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有载体上对应抗性(氨苄)的培养平板中，用灭菌的涂布器涂匀，倒置于37℃恒温培养箱内过夜培养。
5.测序
(1)挑取若干个单菌落，进行小量摇菌培养。
(2)进行PCR验证，挑选3个阳性克隆送公司测序。
引物序列如下：
VCAT-F(SEQ ID NO.3):5'-ATGAGCGGTGTAGCCTCTACTGC-3'；
VCAT-R(SEQ ID NO.4):5'-TTAGTACGCGACACCACTAGTCAAT-3'。
(3)经测序正确的菌液，按1:1的比例，向无菌的EP管加入浓度为15％的甘油和菌液，然后在-80℃的条件下保存。
实施例2草菇过氧化氢酶VCAT基因原核表达
1.接种含有pBAR GPE1/VCAT的大肠杆菌Stbl3单菌落于100mL含有50μg/mL Amp的LB液体培养基中，在220rpm 37℃下培养至OD600达到0.6-0.8，然后使用浓度为1mM的IPTG加入到100mL液体LB中，在220rpm、37℃下继续培养4h，以达到优化诱导培养条件的目的。同时将空载体pBAR GPE1转化Stbl3作为对照。
2.提取原核表达蛋白质进行SDS-PAGE电泳
①蛋白样品制备
(1)取1mL步骤1的菌液加到100mL含有Amp的LB液体培养基中，37℃，220r/min培养2.5-3h，用紫外分光光度计检测待OD600达到0.4-0.6时，加入浓度为1mM的IPTG进行诱导；
(2)加入IPTG后，继续培养6h，将菌液转移到50mL无菌的离心管中，在4℃，5000r/min的条件下，离心10min；
(3)向无菌离心管中加入3mL的PBS，然后用枪头将菌体吸打混匀，加入2.4μLProtease Inhibitor Cocktail，保护蛋白免受损伤；加入200μL裂解液，-4℃静置30min；将破碎后的菌体，在4℃、8000r/min下离心10min；
(4)取离心后的上清50μL于无菌离心管中，加入12.5μL的5×蛋白LoadingBuffer，金属水浴100℃中煮10min，放于-80℃中保存。
②SDS-PAGE凝胶电泳
(1)准备好玻璃板、电泳架、电泳槽等用清水冲洗干净，用滤纸将玻璃板擦拭干净，然后安装好电泳装置；
(2)确定凝胶的浓度，按照试剂盒配制胶，配制浓度为8％的分离胶和3％的浓缩胶；待凝固后***梳子，置于37℃的恒温培养箱，30min，***时应小心以免产生气泡；
(3)待浓缩胶固定后，将梳子拔出，然后用双蒸水清洗胶板，将胶板固定在电泳槽中，向上下电泳槽中注入现配制的电泳缓冲液，检验电泳槽是否有泄漏；
(4)按照次序，依次在上样孔中注入20μL的蛋白样品；
(5)在浓缩胶时，电压为80V；分离胶电压为120V；
(6)电泳结束后，将胶置于干净的盒子中，加入考马斯亮蓝染液，染色60min；
(7)染色完毕后，将考马斯亮蓝染液置于回收瓶中；
(8)加入脱色液，覆盖凝胶表面，1h换次脱色液，直至凝胶透明，能够观察到清晰的蛋白质条带；
(9)对蛋白质凝胶拍照，然后进行结果分析。
电泳结果如图6所示，在接近84kDa处出现一条明显的蛋白条带，其表达量显著高于空载体对照组，表明草菇过氧化氢酶VCAT在大肠杆菌中异源表达成功。
实施例3草菇VCAT蛋白耐热功能的研究
1.吸取50μL验证正确的菌液，接种到含有Amp的50mL LB液体培养基中，37℃，150r/min培养2.5-3h，用紫外分光光度计检测待OD600达到0.4-0.6时，加入1mM的IPTG进行诱导；
2.置于50℃的培养箱中，热胁迫0h、2h、4h、6h、8h、10h；
3.每隔2h取热激处理后的菌液3mL，用紫外分光光度计检测600nm下的吸光度，并记录数据。每个实验梯度设置3个重复。
4.分别以处理0h菌液OD600的吸光度作为对照组，计算其大肠杆菌生长速率，制作热胁迫后生长速率折线图，如图7所示(注：生长速率＝处理大肠杆菌OD600/对照组OD600)。
由图7可以看出，在热胁迫2h、4h、6h、8h、10h时，含有pBAR GPE1/VCAT的大肠杆菌生长速率，分别比含pBAR GPE1空载体对照组大肠杆菌的生长速率提高了16.10％、9.71％、12.05％、13.52％和13.55％，在热胁迫过程中含有pBAR GPE1/VCAT的大肠杆菌生长速率明显高于含pBAR GPE1的大肠杆菌，表明草菇过氧化氢酶VCAT基因的导入及表达确实提高了大肠杆菌Stbl3的耐热性。
实施例4草菇VCAT蛋白耐冷功能的研究
1.吸取50μL验证正确的菌液，接种到含有Amp的50mL LB液体培养基中，37℃、150r/min培养2.5-3h，用紫外分光光度计检测待OD600达到0.4-0.6时，加入1mM的IPTG进行诱导；
2.置于4℃的培养箱中，冷胁迫2d、4d、6d、8d、10d；
3.每隔2天取冷处理后的菌液3mL，用紫外分光光度计检测600nm下的吸光度，并记录数据。每个实验梯度设置3个重复。
4.分别以处理2d菌液OD600的吸光度作为对照组，计算其大肠杆菌生长速率，制作冷胁迫后生长速率折线图，如图8所示(注：生长速率＝处理大肠杆菌OD600/对照组OD600)。
由图8可以看出，冷胁迫4d、6d、8d、10d时，含有pBAR GPE1/VCAT的大肠杆菌生长速率，分别比含pBAR GPE1空载体对照组大肠杆菌的生长速率提高了11.51％、5.33％、9.57％和13.15％，在冷胁迫过程中含有pBAR GPE1/VCAT的大肠杆菌生长速率明显高于含pBARGPE1的大肠杆菌，表明草菇过氧化氢酶VCAT基因的导入及表达确实提高了大肠杆菌Stbl3的耐冷性。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 草菇过氧化氢酶VCAT及其编码基因和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 757
<212> PRT
<213> Volvariella volvacea
<400> 1
Met Ser Gly Val Ala Ser Thr Ala Lys His Ala Phe Glu Gly Leu Thr
1 5 10 15
Ser Thr Ala Lys Val Ala Asp Leu Gln Lys Asp Thr Val Glu Ala Asp
20 25 30
Lys Thr Lys Leu Thr Thr Asp His Gly Val Lys Ile Pro Asn Thr Asp
35 40 45
Asp Trp Leu Lys Val Thr Lys Gly Asn Ala Gly Pro Ser Leu Leu Glu
50 55 60
Asp Gln Ile Ser Arg Glu Lys Ile His Arg Phe Asp His Glu Arg Ile
65 70 75 80
Pro Glu Arg Val Val His Ala Arg Gly Ala Gly Ala His Gly Tyr Phe
85 90 95
Lys Val Phe Asp Asp Arg Ala Ser Lys Tyr Thr Tyr Ala Pro Val Leu
100 105 110
Thr Asp Pro Ser Arg Thr Thr Pro Val Phe Val Arg Phe Ser Thr Val
115 120 125
Gln Gly Ser Lys Gly Ser Ala Asp Thr Val Arg Asp Val Arg Gly Phe
130 135 140
Ala Val Lys Leu Tyr Thr Gln Glu Gly Asn Trp Asp Ile Val Gly Asn
145 150 155 160
Asp Ile Pro Val Phe Phe Ile Gln Asp Ala Val Lys Phe Pro Asp Ile
165 170 175
Ile His Ala Val Lys Pro Glu Pro Asn Asn Glu Val Pro Gln Gly Gln
180 185 190
Ser Ala His Asn Asn Phe Trp Asp Phe Ala Gly Leu Gln Pro Glu Thr
195 200 205
Ala His Met Val Met Trp Val Met Ser Asp Arg Gly Ile Pro Arg Ser
210 215 220
Phe Arg Met Met Gln Gly Phe Gly Val Asn Thr Phe Thr Leu Ile Asn
225 230 235 240
Ala Gln Gly Lys Arg His Phe Val Lys Phe His Trp Ile Pro Glu Leu
245 250 255
Gly Val His Ser Leu Met Trp Asp Glu Ala Leu Lys Ile Gly Gly Gln
260 265 270
Asp Pro Asp Phe His Arg Lys Asp Leu Gln Glu Ala Ile Glu Asn Gly
275 280 285
Cys His Pro Lys Trp Thr Phe Ala Ile Gln Val Ile Asp Glu Ala His
290 295 300
Glu His Asp Phe Asp Phe Asp Ile Leu Asp Ala Thr Lys Val Trp Pro
305 310 315 320
Glu Glu Leu Val Pro Leu Gln Pro Ile Gly Glu Met Val Leu Asn Arg
325 330 335
Thr Val Asp Glu Phe Phe Pro Glu Val Glu Gln Ala Ala Phe Cys Thr
340 345 350
Ser His Val Val Pro Gly Ile Gly Phe Ser Asp Asp Pro Leu Leu Gln
355 360 365
Gly Arg Asn Phe Ser Tyr Phe Asp Thr Gln Ile Thr Arg Leu Gly Val
370 375 380
Asn Trp Glu Gln Leu Pro Ile Asn Arg Pro Val Cys Pro Val Met Asn
385 390 395 400
His His Arg Gly Gly Gln Gln Gln His Arg Ile Val Pro Gly Ser Ile
405 410 415
Asn Tyr Trp Pro Asn Arg Arg Gly Trp Gly Ala Pro Gln Pro Thr Ser
420 425 430
Glu Gly Gly Tyr Tyr Glu Ser Ala Asn Tyr Ser Ser Ile Asn Tyr Arg
435 440 445
His Ile Asp Ile Tyr Pro Glu Asn Val Ser Gly Val Lys Gln Arg Ala
450 455 460
Arg Gly Ala Lys Phe Gln Glu His Phe Asn Gln Ala Gln Leu Phe Tyr
465 470 475 480
Asn Ser Leu Ser Gln His Glu Lys Glu His Leu Val Gly Gly Ile Ser
485 490 495
Phe Glu Leu Ser His Cys Asp Asp Pro Gln Val Tyr Lys Thr Tyr Thr
500 505 510
Lys Ile Leu Asn Asn Ile Asp Phe Asp Leu Ala Lys Arg Val Ala Leu
515 520 525
Arg Ile Asp Gly Thr Val Pro Glu Ser Pro Ala Arg Pro Asn His Gly
530 535 540
Lys Thr Ser Ala Ala Leu Ser Gln Val Tyr Tyr Thr Pro Lys Lys Pro
545 550 555 560
Thr Ile Val Ser Arg Arg Ile Ala Ile Leu Val Ala Asp Gly Phe Asn
565 570 575
Ala Thr Glu Val Glu Gly Val Arg Ala Ala Leu Ser Ser Ala Lys Ala
580 585 590
Leu Thr Phe Ile Ile Gly Pro Arg Arg Gly Lys Val Gln Ser Ala Gly
595 600 605
Gly Thr Lys Leu Gly Met Gly Glu Ala Ala Leu Val Ala Asp Tyr Pro
610 615 620
Tyr Glu Gly Gln Arg Ser Thr Leu Phe Asp Ala Ile Phe Val Pro Ser
625 630 635 640
Gly Ala Asp His Ala Lys Ala Leu Thr Ala Asn Gly Arg Ala Val His
645 650 655
Trp Ile Arg Glu Ala Phe Gly His Cys Lys Thr Ile Gly Ala Ile Gly
660 665 670
Glu Gly Ala Thr Phe Val Gln Gln Val Leu Ser Leu Ser Glu Ile Lys
675 680 685
Thr Ala Ala Asp Leu Thr Ser Asn Glu Val Val Thr Ser His Gly Val
690 695 700
Val Thr Thr Gly Lys Tyr Asp Leu Ala Ala Ala Ala Thr Asp Val Leu
705 710 715 720
Ser Ile Ala Arg Gly Ser Asp Lys Gly Phe Val Ala Asn Phe Ala Tyr
725 730 735
Glu Val Ser Gln His Arg Cys Trp Glu Arg Glu Met Lys Gly Leu Thr
740 745 750
Ser Gly Val Ala Tyr
755
<210> 2
<211> 2274
<212> DNA
<213> Volvariella volvacea
<400> 2
atgagcggtg tagcctctac tgccaagcac gccttcgaag gcttaacctc cacagcgaaa 60
gtcgctgatt tacaaaagga cacagttgag gctgataaaa ccaagcttac cacggatcat 120
ggcgtaaaaa taccaaatac cgatgactgg ctcaaagtga ccaagggcaa tgcaggtcct 180
tctctcctcg aggaccaaat ttccagagaa aaaatccatc gatttgacca tgagcgcatc 240
cctgaacgag tggtccacgc tcgtggcgct ggtgctcatg gctatttcaa ggtgttcgac 300
gatcgagcat ccaagtatac ttacgctccg gtcttgactg acccgagccg gacgactcct 360
gttttcgtcc gcttcagtac tgttcagggg tcaaagggca gtgctgacac tgtacgcgat 420
gtccgcggct tcgcagtcaa gttgtacacg caagaaggga actgggacat cgtagggaac 480
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