阅读说明：本技术 一种木薯抗坏血酸过氧化物酶基因及其原核表达载体的构建和应用 (Cassava ascorbic acid peroxidase gene and construction and application of prokaryotic expression vector thereof ) 是由 施海涛 白玉晶 于 2019-11-05 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种木薯抗坏血酸过氧化物酶基因及其原核表达载体的构建和应用,该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,以及由该基因编码的蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。木薯MeAPX原核表达载体的构建：液氮研磨木薯叶片,利用Trirol提取试剂盒完成RNA的提取,并通过反转录获得cDNA；以cDNA为模板,MeAPXET-F和MeAPXET-R为引物进行PCR扩增获得木薯MeAPX基因,并将其与pET-28a原核表达载体连接,完成MeAPX原核表达载体的构建。抗氧化活性的应用：将MeAPX-pET-28a质粒转入BL21感受态细胞,通过原核诱导表达纯化获得MeAPX蛋白,得到自由基清除率达87.37％的高抗氧化物。(The invention provides a cassava ascorbic acid peroxidase gene and construction and application of a prokaryotic expression vector thereof, wherein the nucleotide sequence of the gene is shown as SEQ ID NO.2, and the amino acid sequence of a protein coded by the gene is shown as SEQ ID NO. 1. Constructing a cassava MeAPX prokaryotic expression vector: grinding cassava leaves by using liquid nitrogen, finishing the extraction of RNA by using a Trirol extraction kit, and obtaining cDNA through reverse transcription; and carrying out PCR amplification by taking the cDNA as a template and the MeAPXET-F and the MeAPXET-R as primers to obtain a cassava MeAPX gene, and connecting the cassava MeAPX gene with a pET-28a prokaryotic expression vector to complete the construction of the MeAPX prokaryotic expression vector. The application of antioxidant activity: the MeAPX-pET-28a plasmid is transferred into BL21 competent cells, and the MeAPX protein is obtained through prokaryotic inducible expression and purification, so that the high antioxidant with the free radical clearance rate of 87.37% is obtained.)

一种木薯抗坏血酸过氧化物酶基因及其原核表达载体的构建 和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体而言，涉及一种增强木薯氧化抗性的抗坏血酸过氧化物酶MeAPX基因，同时涉及一种木薯MeAPX基因原核表达载体的构建方法，及木薯MeAPX蛋白抗氧化活性的应用。

背景技术

木薯(Manihot esculenta Crantz)是热带和亚热带地区主要的粮食作物，是105个国家近十亿人口的主食。对比于其它经济作物，木薯较为抗旱、抗贫瘠且淀粉含量丰富。植物超氧阴离子(O₂ ^-)、羟自由基(—OH)等活性氧(reactive oxygen species,ROS)物质经由代谢活动生成，适量ROS可以作为调控植物生长和响应胁迫的信号分子，而过多ROS将引起DNA不可逆损伤，严重时可使细胞死亡。为保持ROS稳态，植物进化出两种活性氧消除体系——酶和非酶抗氧化防御体系，二者通过多种抗氧化酶(如过氧化氢酶,超氧化物歧化酶等)和多种非酶类抗氧化剂(如辅酶,维生素E等)协同中和自由基。然而，当细胞中ROS水平超过该机制的消除范围时，细胞将进入氧化状态，致使其损伤甚至死亡。

面对极端温度、重金属、干旱、营养缺乏及盐胁迫等不利条件，植物体内ROS含量将迅速升高。为维持体内ROS水平稳定，保护机体免受超氧阴离子、羟自由基等过氧化物的损伤，植物细胞及其细胞器(如叶绿体，线粒体和过氧化物酶体)可通过过氧化物防御系统抵御过量活性氧的侵害。研究结果表明，细胞过氧化物防御系统在植物逆境胁迫防御过程中具有十分重要的作用。过氧化物防御系统包括酶促抗氧化剂和非酶促抗氧化剂系统两部分。已知的酶促抗氧化剂包括超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)，过氧化氢酶(Catalase，CAT)，过氧化物酶(Aseorbateperoxidase，APX)，非酶促抗氧化剂包括谷胱甘肽(Glutathione，GSH)，类胡萝卜素和生育酚(脂溶性)等。

APX是非常有效的H₂O₂清除剂，在所有H₂O₂代谢酶中，其与H₂O₂的亲和力最高。植物APX属于Ⅰ型血红素过氧化物酶和铜氧化酶家族，可通过抗坏血酸(ascorbic acid,ASA)-谷胱甘肽(glutathione,GSH)循环，以ASA为电子供体将H₂O₂还原为O₂和H₂O，从而减弱ROS过量而对细胞产生的毒害作用。对植物来说，不同部位、不同组织的APX活性存在明显差异，其总活力顺序依次为，顶芽>叶>根>种子>花瓣。一般认为不同定位的成员所执行的功能也不尽相同，如定位于叶绿体中的APX主要用于保护光合系统免受活性氧危害，而定位于线粒体中的APX主要用于清除脂肪酸氧化产生的过氧化氢。现已证实，增强植物耐逆性的途径之一是提高植物体内抗氧化酶类活性及增强抗氧化代谢的水平。转基因植物中APX的过量表达，已经被证明可以提高转基因植物的抗性。

目前，通过检索国内外现有技术，尚没有文献报道木薯的抗坏血酸过氧化物酶及其抗氧化活性的体外应用。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种增强木薯氧化抗性的抗坏血酸过氧化物酶MeAPX基因以蛋白。

为了完成上述技术目的，本发明通过大量实验探索研究，提供了一种木薯抗坏血酸过氧化物酶，该酶具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。同时，本发明还提供了一种木薯抗坏血酸过氧化物酶的编码基因，该基因编码具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的蛋白质。进一步优选地，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在上述木薯抗坏血酸过氧化物酶的基础上，本发明人构建了APX原核表达载体，因此本发明的第二个目的在于提供一种木薯抗坏血酸过氧化物酶编码基因MeAPX的原核表达载体，以及用于扩增上述编码基因的引物对，该引物对为MeAPXET-F和MeAPXET-R，所述MeAPXET-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述MeAPXET-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第三个目的在于提供一种木薯抗坏血酸过氧化物酶原核表达载体的构建方法，该方法包括如下步骤：

(1)以MeAPX基因CDS区片段作为木薯抗坏血酸过氧化物酶原核表达载体的构建片段，选用酶切位点BamHI和HindIII设计引物MeAPXET-F和MeAPXET-R，所述MeAPX基因CDS区片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述MeAPXET-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述MeAPXET-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(2)以华南124号木薯cDNA为模板进行PCR扩增，将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，将目的片段连接到pEASY-Blunt3载体，得到pEASY-Blunt3-MeAPX质粒，转化并涂板于含有氨苄抗性的LB固体培养基上培养，将PCR检测得到的阳性克隆菌测序；

(3)测序比对正确后，提取pEASY-Blunt3-MeAPX质粒，用BamHI和HindIII酶切，得到的片段胶回收后，采用同源连接的方法，将其连接到经同样双酶切线性化的空载体pET-28a上，转化并涂板于含有卡纳抗性的LB固体培养基上培养，将PCR检测得到的阳性克隆提取质粒，用BamHI和HindIII酶切验证，构建得到MeAPX-pET-28a原核表达载体。

本发明的最后一个目的在于提供木薯MeAPX酶的抗氧化活性的应用，木薯MeAPX酶可通过原核诱导表达获得并且具有高抗氧化活性，可应用于酶促抗氧化因子的工业化研发与生产。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和进步性：

本发明首次克隆提供了木薯抗坏血酸过氧化物酶MeAPX基因及其表达载体MeAPX-pET-28a，并通过原核诱导表达纯化完成木薯MeAPX蛋白的体外表达，获得了上述基因编码的蛋白。同时本发明验证了木薯MeAPX酶的功能，证明MeAPX在体外具有高抗氧化活性，其中MeAPX上清液蛋白对自由基的清除率高达87.37％，从而在工业化研发与生产木薯MeAPX相关的酶促抗氧化因子方面奠定了坚实的基础。

附图说明

图1为木薯MeAPX上清蛋白作为受试物的氧化物质清除率示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出更详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征。并且，在不偏离本发明精神和范围的前提下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：木薯MeAPX原核表达载体的构建

(1)木薯MeAPX基因片段的克隆：

取适量华南124号木薯叶片置于经液氮冷却后的研钵中，加适量液氮，将木薯叶片研磨成细粉状，参照RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书(购自天根生化有限公司，以下相同)，提取木薯总RNA。用蛋白检测仪(DΜ650BECKMAN，ΜSA)分别测定RNA在260纳米和280纳米光吸收值以及RNA浓度，并用1.5％(质量体积比)琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度。根据反转录试剂盒(购自Thermo Fermentas，以下相同)说明书，将RNA反转录为cDNA置于-40℃冰箱保存备用。

根据Phytozome在线数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)获得木薯基因组序列，选用BamHI和HindIII酶切位点设计引物MeAPXET-F和MeAPXET-R，以木薯cDNA为模板进行PCR扩增，用DNA纯化回收试剂盒(购自天根生化有限公司，以下相同)回收并纯化扩增的PCR产物。

MeAPXET-F：GTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGCCGAAGAACTACCCAAA

MeAPXET-R：

TGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTAGCGTAATCTGGTACGTCGTACGCCTCAGCAAATCCGAGCT

PCR反应体系为：5×TransStrat FastPfu Buffer、2.5mM dNTPs 4μl、TransStratFastPfu DNA Polymerase(购自全式金生物技术有限公司)1μl、CAMTA-F 1μl、CAMTA-R 1μl，加无菌水至50μl。反应程序为：95℃变性3min，95℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 1min 32循环，72℃延伸10min(以下相同)。

(2)MeAPX-pET-28a基因原核表达载体的构建

将回收得到的目的片段按以下体系连接到克隆载体pEASY-Blunt3：目的基因DNA片段3μL和0.6μL的

Cloning Vector，短暂离心混匀，置于37℃水浴锅中反应30min，转化到大肠杆菌DH5α(本实验室保存，详见遗传资源表，以下相同)，涂布于含有氨苄抗性的LB固体培养基(配方如下：称取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物和10g氯化钠，定容于1000毫升，分装于200毫升三角瓶中，固体培养基中加入2％的琼脂，121℃，6.859×104Pa下高压灭菌20分钟。4℃冷藏备用，以下相同)，37℃过夜培养，挑选单菌落进行PCR检测，挑选能够扩增出目的大小的条带的对应的阳性单克隆菌落稀释液，加入含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，200rpm，37℃摇床培养过夜。取300μL过夜培养的菌液送往华大基因公司测序，将剩余菌液保存备用。测序比对正确得到克隆载体pEASY-Blunt3-MeAPX，根据质粒提取试剂盒(购自天根生化有限公司，以下相同)提取pEASY-Blunt3-MeAPX质粒和空载体pET-28a质粒(本实验室保存，详见遗传资源表，以下相同)，用BamHI和HindIII酶切pEASY-Blunt3-MeAPX质粒和空载体pET-28a，37℃条件下反应30min，PCR检测后，回收目的片段和线性化的pET-28a载体。采用同源连接的方法，根据质粒和载体浓度计算后，在1.5ml离心管中加入目的片段0.8μL，载体片段3.2μL，Buffer 4μL，酶(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)2μL在37℃条件下连接30min，用冻融法转化到大肠杆菌BL21中，涂布于含有卡纳抗性的LB固体培养基上，37℃过夜培养，挑取单菌落进行PCR检测。PCR检测的得到的阳性克隆提取质粒，用BamHI和HindIII酶切验证，验证正确的质粒命名为MeAPX-pET-28a，即为MeAPX基因的原核表达载体。

实施例2：木薯MeAPX蛋白抗氧化活性的应用

(1)MeAPX蛋白的原核诱导表达纯化

吸取保存的转入MeMT-pET-28a重组质粒和pET-28a空载质粒的BL 21大肠杆菌100μl分别加入5ml含有卡那抗性的培养基中，37℃，180rpm过夜培养，取过夜培养的菌液加入新的卡那抗性LB培养基中，调OD600值到0.2-0.3，37℃，180rpm培养至OD600为0.5-0.6时，加入1mM IPTG和1mM ZnCl2诱导表达，分别收集0h，6h蛋白，6h上清和6h沉淀，进行SDS-PAGE凝胶电泳检测原核表达载体的表达。采用蛋白纯化试剂盒，根据蛋白纯化说明书进行操作，将木薯MeAPX蛋白包涵体溶解液纯化。

加入适量磷酸缓冲液(pH＝7.4)悬浮木薯MeAPX总蛋白，于超声破碎仪进行低温破碎，4℃，8000rpm离心5min，将上清转移至新的离心管中得木薯MeAPX上清液蛋白。沉淀加入10ml包涵体洗涤液(50mmol/LTris-HCl，1mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl，w＝0.5％TritonX-100，PH＝8.0)悬浮，冰上震荡洗涤1～2h。4℃，1000rpm离心30min，弃上清，沉淀中加入包涵体溶解液(6mol/L尿素，50mmol/LTris-HCl，1mmol/L EDTA，50mmol/LNaCl，10mmol/Lβ-ME，PH＝8.0)3ml悬浮，冰上过夜震荡溶解。4℃，1000rpm离心30min，将上清转移至透析袋中，经透析液I(0.2mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，5％甘油，5μmol/L EDTA，PH＝8.5)和透析液II(0.2mol/LTris-HCl，0.5mol/LNaCl，PH＝8.5)透析，获得木薯MeAPX蛋白包涵体溶解液。

采用蛋白纯化试剂盒(购自碧云天生物公司)，根据蛋白纯化说明书进行操作，将上述包涵体溶解液纯化获得木薯MeAPX蛋白。

(2)ABTS工作液的制备

将7.4mmol/L ABTS水溶液与2.6mmol/L过硫酸钾水溶液混合，将混合液在室温避光条件下放置12～16h，形成ABTS储备液；将所述ABTS储备液与乙醇按照约1:40的体积比混合，在734nm下调吸光度为0.700±0.02，即得ABTS工作液。

(3)ABTS自由基清除活性的测定：

以为待检样品溶液，通过Bradford法测得蛋白浓度为0.2mg/mL，并将其稀释10倍得0.02mg/mL木薯MeAPX蛋白溶液。取96孔板，每组测验做三次重复，每孔分别加入20μL上述不同浓度的样品溶液和180μL ABTS工作液，反应体系200μL，反应9s，静置10min；将96孔板放入酶标仪中，在734nm波长处检测样品的吸光度Ai；空白组采用pH＝7.4磷酸缓冲液代替所述样品溶液，其他步骤和参数不变，测得空白吸光度A₀，按照如下公式计算，活性氧清除率＝[(A₀-A_i)/A₀]×100％，A_i为734nm波长处样品反应液的吸光度，A₀为734nm波长处空白组反应液的吸光度，以上数据均采用Tecan

200Pro多功能酶标仪测量。实验结果显示，0.02mg/mL木薯MeAPX蛋白溶液ABTS自由基清除率为16.25％；0.2mg/mL木薯MeAPX蛋白溶液活性氧清除率高达87.37％，ABTS清除效率明显(见图1)。

序列表

<110> 海南大学

<120> 一种木薯抗坏血酸过氧化物酶基因及其原核表达载体的构建和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 257

<212> PRT

<213> 木薯(Manihot esculenta Crantz)

<400> 1

Met Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Val Ser Glu Glu Tyr Gln Lys Ala Ile

1 5 10 15

Asp Lys Ala Arg Arg Lys Leu Arg Gly Phe Ile Ala Glu Lys Gly Cys

20 25 30

Ala Pro Leu Met Leu Arg Ile Ala Trp His Ser Ala Gly Thr Tyr Asp

35 40 45

Val Lys Thr Asn Thr Gly Gly Pro Phe Gly Thr Met Arg His Ala Ala

50 55 60

Glu Gln Gly His Ala Ala Asn Asn Gly Leu Asp Ile Ala Val Arg Leu

65 70 75 80

Leu Glu Pro Ile Lys Glu Gln Phe Pro Ile Leu Ser Tyr Ala Asp Phe

85 90 95

Tyr Gln Leu Ala Gly Val Val Ala Val Glu Ile Thr Gly Gly Pro Asp

100 105 110

Ile Pro Phe His Pro Gly Arg Glu Asp Lys Pro Glu Pro Pro Pro Glu

115 120 125

Gly Arg Leu Pro Asn Ala Thr Lys Gly Ala Asp His Leu Arg Glu Val

130 135 140

Phe Gly Lys Thr Met Gly Leu Thr Asp Lys Asp Ile Val Val Leu Ser

145 150 155 160

Gly Gly His Thr Leu Gly Arg Cys His Lys Glu Arg Ser Gly Phe Glu

165 170 175

Gly Pro Trp Thr Pro Asn Pro Leu Ile Phe Asp Asn Ser Phe Phe Gln

180 185 190

Val Leu Leu Asp Glu Pro Thr Glu Asp Leu Leu Gln Leu Pro Thr Asp

195 200 205

Ser Val Leu Val Thr Asp Pro Val Phe Arg Pro Tyr Val Glu Lys Tyr

210 215 220

Ala Ala Asp Glu Glu Ala Phe Phe Ala Asp Tyr Ala Glu Ser His Met

225 230 235 240

Lys Leu Ser Glu Leu Gly Phe Ala Glu Ala Tyr Asp Val Pro Asp Tyr

245 250 255

Ala

<210> 2

<211> 771

<212> DNA

<213> 木薯(Manihot esculenta Crantz)

<400> 2

atgccgaaga actacccaaa agttagtgaa gagtaccaga aagccattga taaggccagg 60

aggaagctca gaggtttcat cgctgagaaa ggctgcgctc ctctcatgct ccgtatcgca 120

tggcactcag ctggaactta cgacgtgaag acgaacactg gaggtccttt tggaaccatg 180

aggcacgcag cggagcaggg tcatgctgct aacaatgggt tagatattgc tgttagactc 240

cttgagccca tcaaggagca gttccctatc ctctcctacg ccgacttcta tcagctcgct 300

ggtgttgttg ccgttgagat cactggtggg cctgatatcc cattccaccc aggaagagag 360

gacaagcctg aaccgcctcc agaaggtcgt ctccctaatg ctactaaagg tgctgatcac 420

ttgagagagg tctttgggaa aaccatgggt ctcaccgaca aggatattgt tgtcctttct 480

ggtggccaca ccttgggaag gtgccacaag gaacgctctg gttttgaagg tccctggact 540

cctaatcctc tcatctttga caattccttc ttccaggtgc tcttggacga accgacagaa 600

gatcttctac aattgccgac tgacagtgtt cttgtcacgg atcctgtctt ccgcccatat 660

gttgaaaaat atgctgctga tgaagaggca ttctttgctg attatgctga gtcccatatg 720

aagctctctg agctcggatt tgctgaggcg tacgacgtac cagattacgc t 771

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtggacagca aatgggtcgc ggatccatgc cgaagaacta cccaaa 46

<210> 4

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggtgctcga gtgcggccgc aagcttagcg taatctggta cgtcgtacgc ctcagcaaat 60

ccgagct 67