具体实施方式

试验材料和试剂

1、基因及载体：大肠杆菌表达载体pCold I及菌株大肠杆菌pG-Tf2/BL21；

2、酶类及其它生化试剂：内切酶、重组酶、黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮。

3、培养基：大肠杆菌培养基LB (1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1% NaCl，pH 7.0)。

StDyP的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

实施例1 染料脱色过氧化物酶StDyP编码基因的克隆

本发明的目的基因来源于链霉菌Streptomyces thermocarboxydus的染料脱色过氧化物酶StDyP。序列特异性引物： SEQ ID NO:3； SEQ ID NO:4。

以链霉菌Streptomyces thermocarboxydus的基因组DNA为模板进行PCR扩增。在1%琼脂糖凝胶上电泳，切胶得到目的片段，将该片段回收后与NdeI-XbaI双酶切的pCold I载体通过同源重组的方法相连，转化Trans I克隆宿主，测序验证，得到染料脱色过氧化物酶StDyP编码基因。

实施例2 重组染料脱色过氧化物酶StDyP的制备

将获得的含有染料脱色过氧化物酶基因StDyP的重组大肠杆菌表达质粒pCold I-StDyP转化大肠杆菌pG-Tf2/BL21，获得重组大肠杆菌 pG-Tf2/BL21/StDyP。

取E. coli pG-Tf2/BL21/StDyP菌株，接种于50 mL LB培养液中，37 ℃ 200 rpm振荡培养12 h后，按2%比例转接于300 mL LB培养基中，37 ℃ 200 rpm振荡培养约4 h(OD600≈0.6)，而后加入终浓度1 mM的诱导剂 IPTG和10 μM的Hemin溶液，于16 ℃ 200rpm诱导培养12 h后，离心收集菌体。将菌体重悬于平衡缓冲液（20 mM pH 7.4 Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，500 mM NaCl）中。采取超声破碎法裂解菌体。将破碎后的菌体碎片离心去除，利用Ni亲和层析柱进行纯化，收集电泳纯的洗脱组分并透析至蛋白储存液（20 mM pH 7.4Na₂HPO₄-NaH₂PO₄）中。

实施例3 重组染料脱色过氧化物酶StDyP-介体体系降解玉米赤霉烯酮

将玉米赤霉烯酮溶解到二甲基亚砜中配制成100 mg/L的母液，按如下反应体系：55 μL丙二酸缓冲液（0.2 M，pH 4.0），20 μL玉米赤霉烯酮溶液（100 mg/L），20 μL 10 mM介体，使用的介体为：硫酸锰；1-羟基苯并三唑；香豆酸；羟基苯甲酸；香草醛；香草酸；阿魏酸；丁香酸；丁香醛和乙酰丁香酮，，100 μL染料脱色过氧化酶(1 U/mL)，5 μL过氧化氢(4 mM)。以未加入染料脱色过氧化物酶的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行，48 h后加入等体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱（HPLC）分析玉米赤霉烯酮的降解率。液相色谱为岛津LC-20A高效液相色谱分析系统，色谱分离柱为Waters XBridge C18column (4.6×150 mm, 5 μm)，流动相A（水），流动相B (乙腈)；等梯度洗脱条件45%B洗脱20分钟；采用荧光检测器检测，激发波长274 nm，发射波长440 nm。

结果如图1、图2所示，可见部分玉米赤霉烯酮已被降解，当体系中未加入介体物质时，降解率仅为8.17%，而当加入介体物质二价锰离子时，降解率为27.49%；加入介体物质1-羟基苯并三唑时，降解率为98.84%；加入其它介体物质如香豆酸，羟基苯甲酸，香草醛，香草酸，阿魏酸，丁香酸，丁香醛和乙酰丁香酮对链霉菌来源的染料过氧化物酶降解霉菌毒素玉米赤霉烯酮无促进效果。由此可知，当降解体系中加入介体二价锰离子，玉米赤霉烯酮的降解率提高了3.36倍；加入介体1-羟基苯并三唑，玉米赤霉烯酮的降解率提高了12.10倍；介体物质二价锰离子或1-羟基苯并三唑的加入显著提高了染料脱色过氧化物酶对玉米赤霉烯酮的降解率。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种提高染料脱色过氧化物酶的霉菌毒素降解率的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 425

<212> PRT

<213> Streptomyces thermocarboxydus

<400> 1

Met Ala Asp Pro Ser Leu Ser Gln Thr Arg Thr Pro Glu Lys Glu Pro

1 5 10 15

Gln Ala Glu Ala Ala Ala Ser Gly Ile Ser Arg Arg Arg Leu Leu Gly

20 25 30

Thr Ala Gly Ala Thr Gly Leu Val Leu Gly Ala Ala Gly Gly Ala Val

35 40 45

Gly Tyr Ala Ser Ala Pro Thr Gly Ala Thr Pro Leu Thr Ser Val Gly

50 55 60

Ala Thr Lys Val Pro Phe His Val Lys His Gln Pro Gly Ile Thr Asp

65 70 75 80

Pro Leu Gln Ser Arg Gly His Leu Leu Ala Phe Asp Leu Arg Pro Gly

85 90 95

Ala Gly Arg Lys Glu Ala Ala Ala Leu Leu Arg Arg Trp Ser Asp Thr

100 105 110

Ala Arg Arg Leu Met Asp Gly Thr Phe Asp Ala Glu Gly Asp Ser Asp

115 120 125

Val Ala Arg Asp Ala Gly Pro Ser Ser Leu Thr Leu Thr Phe Gly Phe

130 135 140

Gly His Ser Phe Phe Ala Arg Thr Gly Leu Glu Arg Gln Arg Pro Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ala Phe Ser Ser Asp Arg Leu Asp Arg Ala

165 170 175

Arg Ser Asp Gly Asp Leu Trp Val Gln Ile Gly Ala Asp Asp Ala Leu

180 185 190

Val Ala Phe His Ala Leu Arg Ala Val Gln Lys Asp Ala Gly Ala Ala

195 200 205

Ala Arg Val Arg Trp Gln Met Asn Gly Phe Asn Arg Ser Pro Gly Ala

210 215 220

Thr Ala Arg Pro Met Thr Thr Arg Asn Leu Met Gly Gln Val Asp Gly

225 230 235 240

Thr Arg Asn Pro Lys Pro Asp Glu Pro Asp Phe Asp Gln Arg Ile Phe

245 250 255

Val Ala Glu Gln Gly Glu Pro Ala Trp Met Ala Asn Gly Ser Tyr Val

260 265 270

Val Val Arg Arg Ile Arg Met Leu Leu Asp Asp Trp Glu Lys Leu Ser

275 280 285

Leu Arg Glu Gln Glu Gly Val Ile Gly Arg Arg Lys Ala Asp Gly Ala

290 295 300

Pro Leu Ser Gly Gly Asp Glu Thr Thr Glu Met Asp Leu Glu Lys Thr

305 310 315 320

Asp Ala Gln Gly Asn Leu Val Val Pro Phe Asn Ala His Ala Arg Ile

325 330 335

Thr Arg Pro Asp Gln Asn Gly Gly Ala Ala Met Leu Arg Arg Pro Phe

340 345 350

Ser Tyr His Asp Gly Ile Asp Ala Asp Gly Thr Pro Asp Ala Gly Leu

355 360 365

Leu Phe Ile Cys Trp Gln Ala Asp Pro Leu Arg Gly Phe Val Pro Val

370 375 380

Gln Arg Lys Leu Asp Arg Gly Asp Ala Leu Thr Pro Phe Ile Arg His

385 390 395 400

Glu Ala Ser Gly Leu Phe Ala Val Pro Gly Gly Ala Ala Glu Gly Glu

405 410 415

Tyr Val Gly Gln Ala Leu Leu Glu Gly

420 425

<210> 2

<211> 1278

<212> DNA

<213> Streptomyces thermocarboxydus

<400> 2

atggctgacc cttccctgtc gcagacccgc acccccgaga aggagcccca ggcggaagcc 60

gccgcctccg gcatctcgcg gcggcgcctg ctcggcacgg ccggcgccac cgggctcgtg 120

ctcggggcgg ccggcggtgc cgtcgggtac gcgtcggcgc ccaccggagc cactccgctc 180

acctcggtcg gcgccacaaa agtcccgttt cacgtgaaac atcagccggg catcaccgac 240

ccgctccagt cgcgtggcca tctcctcgcc ttcgacctga ggcccggcgc cggacgcaag 300

gaggcggctg cgctgctgcg ccgctggtcc gacaccgccc ggcggctgat ggacgggacg 360

ttcgacgccg agggcgacag tgacgtggcc cgtgacgcgg ggccctcctc gctgaccctg 420

accttcggtt ttgggcacag cttcttcgcg cgcaccgggc tggagaggca gcgtccggcc 480

gccctggagc cgctgcccgc cttctcctcc gaccgcctcg accgggcccg cagcgacggg 540

gacctgtggg tgcagattgg cgccgacgac gccctcgtcg cgttccatgc cctgcgcgcg 600

gtgcagaagg acgcgggcgc ggcggcccgg gtgcgctggc agatgaacgg cttcaaccgg 660

tcgccgggcg ccaccgcccg cccgatgacc acccgcaatc tgatgggcca ggtcgacggc 720

acccgcaacc cgaaacccga cgagcccgac ttcgaccagc ggatcttcgt ggcggagcag 780

ggcgagcccg cctggatggc gaacggctcc tatgtggtcg tccgccggat ccgcatgctg 840

ctggacgact gggagaagct gtcgctcagg gagcaggagg gtgtcatcgg gcggcgcaag 900

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gacgcccagg gcaatctggt cgtcccgttc aacgcgcacg cacgcatcac ccggcccgac 1020

cagaacggcg gggcggcgat gctgcgccgg ccgttctcgt accacgacgg catcgacgcg 1080

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ttcgtgccgg tgcagcgcaa gctcgaccgg ggcgacgccc tgacgccgtt catccgtcac 1200

gaggcgagcg ggctgttcgc cgtcccgggc ggggcggcgg agggtgagta tgtgggccag 1260

gcgctgctgg aggggtga 1278

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcatcatat cgaaggtagg catatggctg acccttccct gtcgcagac 49

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttttaagcag agattaccta tctagacccc tccagcagcg cctggccc 48