一种1,5-脱水山梨醇检测试剂盒及其制备方法
阅读说明：本技术 一种1,5-脱水山梨醇检测试剂盒及其制备方法 (1, 5-sorbitan detection kit and preparation method thereof ) 是由 袁嘉扬 张凤 于 2019-11-01 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种1,5-脱水山梨醇检测试剂盒,包括试剂R1和试剂R2,试剂R1的各组分及浓度包括：20-100mmol/L的第一缓冲液、1-20KU/L的葡萄糖激酶、0.5-5KU/L的丙酮酸激酶、0.2-1mmol/L的三磷酸腺苷、1-3mmol/L的磷酸烯醇式丙酮酸钾、0.5-2mmol/L的4-氨基安替比林、1-5ml/L的表面活性剂、0.5—10g/L的谷胱甘肽、0.8-2.0ml/L的防腐剂、5-20mmol/L的氯化镁。试剂R2的各组分及浓度包括：20-100mmol/L的第二缓冲液、20-125KU/L的吡喃糖氧化酶、15-60KU/L的过氧化物酶、1-10mmol的色原、1-5ml/L的表面活性剂、0.8-2.0ml/L的防腐剂。本发明的优点是：灵敏度高、稳定性好、线性范围宽。(The invention relates to a 1, 5-sorbitan detection kit, which comprises a reagent R1 and a reagent R2, wherein the reagent R1 comprises the following components in percentage by weight: 20-100mmol/L of first buffer solution, 1-20KU/L of glucokinase, 0.5-5KU/L of pyruvate kinase, 0.2-1mmol/L of adenosine triphosphate, 1-3mmol/L of potassium phosphoenolpyruvate, 0.5-2mmol/L of 4-aminoantipyrine, 1-5ml/L of surfactant, 0.5-10 g/L of glutathione, 0.8-2.0ml/L of preservative, and 5-20mmol/L of magnesium chloride. The components and concentrations of the reagent R2 include: 20-100mmol/L of second buffer solution, 20-125KU/L of pyranose oxidase, 15-60KU/L of peroxidase, 1-10mmol of chromogen, 1-5ml/L of surfactant and 0.8-2.0ml/L of preservative. The invention has the advantages that: high sensitivity, good stability and wide linear range.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种1,5-脱水山梨醇试剂盒及其制备方法。
背景技术
1,5-AG(1,5-脱水山梨醇)与现有的糖尿病指标均呈现出显著的负相关，血液中1，5-AG的减少程度与糖尿病的严重程度显著相关。1,5-AG可以反映近几天至1周的平均血糖水平，因此1,5-脱水山梨醇检测效果受到了越来越多的重视。
已有的检测1,5-脱水山梨醇的试剂和检测方法存在着灵敏度和重复性差、准确性低的缺陷，限制了它的应用。因此，应该提供一种新的技术方案解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是：提供一种可明显改善重复性和灵敏度的1,5-脱水山梨醇检测试剂盒及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种1,5-脱水山梨醇检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1的各组分及浓度包括：
所述试剂R2的各组分及浓度包括：
进一步的技术方案：
所述试剂R1中的第一缓冲液和试剂R2中的第二缓冲液分别为磷酸钾缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的一种或两种以上的混合物。
所述试剂R1、R2中的防腐剂分别为叠氮钠、Proclin950、Proclin300、硫柳汞中的一种或两种以上的混合物。
所述试剂R1、R2中的表面活性剂为吐温20、曲拉通X-100、聚乙烯吡咯烷酮、辛基苯基聚氧乙烯醚中的一种或两种以上的混合物。
所述试剂R2中的色原为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸中的一种。
一种1,5-脱水山梨醇检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤，
(1)、试剂R1制备
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至200-300rpm，使搅拌保持匀速状态，按照以上浓度要求，边搅拌边投入第一缓冲液，搅拌至物料完全溶解、配液罐底部无沉淀，之后投入葡萄糖激酶、丙酮酸激酶、三磷酸腺苷、磷酸烯醇式丙酮酸钾、4-氨基安替比林，待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入谷胱甘肽、氯化镁、表面活性剂和防腐剂，投料完成后，继续搅拌至全部物料完全溶解，配液罐底部无沉淀，调整PH值在6.50-8.00之间，并定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
(2)、试剂R2制备
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至200-300rpm，使搅拌保持匀速状态，按照以上浓度要求，边搅拌边投入第二缓冲液，搅拌至物料完全溶解、配液罐底部无沉淀，之后投入吡喃糖氧化酶、过氧化物酶，待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入色原，表面活性剂和防腐剂，投料完成后，继续搅拌至全部物料完全溶解，配液罐底部无沉淀，调整PH值并定容至最终体积。
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识。
由于上述技术方案的应用，本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、本发明的1,5-脱水山梨醇检测试剂盒，在R1试剂中同时添加氯化镁，谷胱甘肽和曲那通X-100可有效提高酶的活性和去干扰性能，从而提高了试剂的分析灵敏度、稳定性，保证检测结果的准确性。
2、本发明具有操作简单、快速检测、灵敏度高、稳定性好、线性范围更宽优势，适合于在各大中小型医院推广使用。
附图说明
图1校准品定标曲线图。
其中：X轴表示校准品浓度，Y轴表示吸光度。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述：
实施例1：
一种1,5-脱水山梨醇检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括：浓度为20mmol/L的Tris缓冲液、浓度为1KU/L的葡萄糖激酶、浓度为0.5KU/L的丙酮酸激酶、浓度为0.2mmol/L的三磷酸腺苷、浓度为1mmol/L的磷酸烯醇式丙酮酸钾、浓度为0.5mmol/L的4-氨基安替比林、浓度为1ml/L的曲拉通X-100、浓度为0.5g/L的谷胱甘肽、浓度为0.8ml/L的Proclin-300以及浓度为5mmol/L的氯化镁。
所述试剂R2包括：浓度为20mmol/L的Tris缓冲液、浓度为20KU/L的吡喃糖氧化酶、浓度为15KU/L的过氧化物酶、浓度为1mmol/L的N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、浓度为1ml/L的曲拉通X-100以及浓度为0.8ml/L的Proclin-300。
以上对1,5-脱水山梨醇的检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤，
(1)、试剂R1制备
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至200rpm，使搅拌保持匀速状态，按照以上的浓度要求，边搅拌边投入Tris缓冲液，搅拌至物料完全溶解、配液罐底部无沉淀，之后投入葡萄糖激酶、丙酮酸激酶、三磷酸腺苷、磷酸烯醇式丙酮酸钾、4-氨基安替比林，待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入谷胱甘肽、氯化镁、曲拉通X-100和Proclin-300，投料完成后，继续搅拌至全部物料完全溶解，配液罐底部无沉淀，调整PH值为6.50，并定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
(2)、试剂R2制备
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至200rpm，使搅拌保持匀速状态，按照上述浓度要求，边搅拌边投入Tris缓冲液，搅拌至物料完全溶解、配液罐底部无沉淀，之后投入吡喃糖氧化酶、过氧化物酶，待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，曲拉通X-100和Proclin-300，投料完成后，继续搅拌至全部物料完全溶解，配液罐底部无沉淀，调整PH值为7.4，并定容至最终体积。
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识。
实施例2
一种1,5-脱水山梨醇检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括：浓度为60mmol/L的MES缓冲液、浓度为10KU/L的葡萄糖激酶、浓度为2.5KU/L的丙酮酸激酶、浓度为0.6mmol/L的三磷酸腺苷、浓度为2mmol/L的磷酸烯醇式丙酮酸钾、浓度为1.2mmol/L的4-氨基安替比林、浓度为3ml/L的吐温20、浓度为5g/L的谷胱甘肽、浓度为1.4ml/L的Proclin-950以及浓度为12mmol/L的氯化镁。
所述试剂R2包括：浓度为60mmol/L的MES缓冲液、浓度为83KU/L的吡喃糖氧化酶、浓度为40KU/L的过氧化物酶、浓度为6mmol/L的3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸、浓度为3ml/L的吐温20以及浓度为1.4ml/L的Proclin-950。
以上对1,5-脱水山梨醇的检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤，
(1)、试剂R1制备
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至250rpm，使搅拌保持匀速状态，按照以上的浓度要求，边搅拌边投入MES缓冲液，搅拌至物料完全溶解、配液罐底部无沉淀，之后投入葡萄糖激酶、丙酮酸激酶、三磷酸腺苷、磷酸烯醇式丙酮酸钾、4-氨基安替比林，待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入谷胱甘肽、氯化镁、吐温20和Proclin-950，投料完成后，继续搅拌至全部物料完全溶解，配液罐底部无沉淀，调整PH值为7.20，并定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
(2)、试剂R2制备
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至250rpm，使搅拌保持匀速状态，按照上述浓度要求，边搅拌边投入MES缓冲液，搅拌至物料完全溶解、配液罐底部无沉淀，之后投入吡喃糖氧化酶、过氧化物酶，待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸，吐温20和Proclin-950，投料完成后，继续搅拌至全部物料完全溶解，配液罐底部无沉淀，调整PH值为8.8，并定容至最终体积。
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识。
实施例3
一种1,5-脱水山梨醇检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括：浓度为100mmol/L的HEPES缓冲液、浓度为20KU/L的葡萄糖激酶、浓度为5KU/L的丙酮酸激酶、浓度为1mmol/L的三磷酸腺苷、浓度为3mmol/L的磷酸烯醇式丙酮酸钾、浓度为2mmol/L的4-氨基安替比林、浓度为5ml/L的聚乙烯吡咯烷酮、浓度为10g/L的谷胱甘肽、浓度为2ml/L的硫柳汞以及浓度为20mmol/L的氯化镁。
所述试剂R2包括：浓度为100mmol/L的HEPES缓冲液、浓度为125KU/L的吡喃糖氧化酶、浓度为60KU/L的过氧化物酶、浓度为10mmol/L的N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、浓度为5ml/L的聚乙烯吡咯烷酮以及浓度为2ml/的硫柳汞。
以上对1,5-脱水山梨醇的检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤，
(1)、试剂R1制备
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至300rpm，使搅拌保持匀速状态，按照以上的浓度要求，边搅拌边投入HEPES缓冲液，搅拌至物料完全溶解、配液罐底部无沉淀，之后投入葡萄糖激酶、丙酮酸激酶、三磷酸腺苷、磷酸烯醇式丙酮酸钾、4-氨基安替比林，待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入谷胱甘肽、氯化镁、聚乙烯吡咯烷酮和硫柳汞，投料完成后，继续搅拌至全部物料完全溶解，配液罐底部无沉淀，调整PH值为8，并定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
(2)、试剂R2制备
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至300rpm，使搅拌保持匀速状态，按照上述浓度要求，边搅拌边投入HEPES缓冲液，搅拌至物料完全溶解、配液罐底部无沉淀，之后投入吡喃糖氧化酶、过氧化物酶，待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，聚乙烯吡咯烷酮和硫柳汞，投料完成后，继续搅拌至全部物料完全溶解，配液罐底部无沉淀，调整PH值为10，并定容至最终体积。
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识。
下面通过具体的实验，结合表格和曲线图，对本发明一种1,5-脱水山梨醇检测试剂盒的几个重要指标进行说明，具体如下：
1.1、定标
使用校准品进行定标，结果如表1所示，定标曲线如图1所示。
表1、校准品定标结果
1.2精密度CV检测：
选取低值阳性待测样本用生理盐水进行稀释，产生接近于方法线性范围低限浓度水平的样本，一般为4个浓度水平，分别为：1.36umol/L、2.03umol/L、3.05umol/L和4.58umol/L。每个浓度水平样本重复测定10次。以CV≤8％为可接受界值，由数据中选取CV值等于或小于可接受界值的最低浓度水平做为检测范围低限。
当样本浓度低于2.03umol/L时，CV＞8％。当样本浓度高于3.05umol/L时，CV＜8％。故线性范围低限定为3.05umol/L。
选取高值样本用生理盐水进行稀释，产生接近于方法线性范围高限浓度水平的样本，一般为4个浓度水平，分别为：279.00umol/L、310.00umol/L、341.00umol/L和372.00umol/L。每个浓度水平样本重复测定10次。以CV≤8％为可接受界值，由数据中选取CV值等于或小于可接受界值的最高浓度水平做为检测范围高限。
当样本浓度高于310.00umol/L时，CV＞8％。当样本浓度低于310.00umol/L时，CV＜8％。故线性范围高限定为310.00umol/L。
结论：该发明的线性范围可做到3.05-310.00umol/L。
1.3重复性CV检测：
1
4.87
79.98
143.00
301.37
2
4.73
73.82
145.42
301.20
3
4.84
82.07
155.43
282.06
4
4.65
74.53
150.65
304.22
5
4.76
74.74
151.49
296.44
6
4.90
77.20
154.56
306.56
7
4.26
78.58
151.33
293.74
8
4.86
74.35
145.19
289.19
9
4.56
81.38
150.21
306.69
10
4.64
77.97
155.22
282.93
均值
4.71
77.46
150.25
296.44
SD
0.194
3.045
4.403
9.214
CV％
4.11％
3.93％
2.93％
3.11％
结论：检测临床血清样本，重复性CV均较小，5％以内。
1.4、灵敏度检测：
将已知浓度的临床血清样本用生理盐水稀释至＜3.05umol/L,重复测试10遍，计算SD和CV。变异系数(CV)应不大于10％。
1
2.66
2
2.44
3
2.72
4
2.65
5
2.31
6
2.43
7
2.17
8
2.41
9
2.16
10
2.56
均值
2.45
SD
0.198
CV％
8.08％
结论：血清样本浓度＜3.05umol/L时，重复性不大于10％。
1.5、热稳定性检测：
将该发明试剂盒放入电热恒温培养箱中，37℃加速10天，分别于第0天、2天、4天、6天、8天、10天进行检测，观察试剂盒的热稳定性变化。
结论：分别于第0天、2天、4天、6天、8天、10天进行检测时，其相对偏差均在±5％以内，说明试剂盒热稳定性较好，37℃条件下至少可稳定保存10天。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进或替换，这些改进或替换也应视为本发明的保护范围。
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