一种适用于图位克隆的基因型快速鉴定方法
阅读说明：本技术 一种适用于图位克隆的基因型快速鉴定方法 (Rapid genotype identification method suitable for map-based cloning ) 是由 关海英 汪黎明 刘铁山 何春梅 刘春晓 董瑞 刘强 王娟 于 2018-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明属于基因遗传学技术领域,具体涉及一种适用于图位克隆的基因组DNA快速提取和基因型快速鉴定方法。本发明所述适用于图位克隆的基因型快速鉴定方法,利用作物苗为验证样本,以一般的提取DNA方法进行验证,通过设计合理的引物进行PCR扩增,可快速完成基因组DNA的快速提取和基因型的快速鉴定,大大减少了重复劳动,节约了成本和时间,加速工作进展,该方法同样可以在其他作物中予以借鉴。(The invention belongs to the technical field of genetic genetics, and particularly relates to a method for quickly extracting genome DNA and quickly identifying a genotype, which is suitable for map-based cloning. The rapid genotype identification method suitable for map-based cloning, provided by the invention, is characterized in that crop seedlings are used as verification samples, a general DNA extraction method is used for verification, PCR amplification is carried out through reasonably designed primers, rapid genome DNA extraction and rapid genotype identification can be rapidly completed, repeated labor is greatly reduced, cost and time are saved, and work progress is accelerated.)
技术领域
本发明属于基因遗传学技术领域，具体涉及一种适用于图位克隆的基因组DNA快速提取和基因型快速鉴定方法。
背景技术
2008年2月玉米基因组草图的获得使得玉米成为继水稻之后第二种成功测序的农作物。2009年美国科学家完成了玉米自交系B73的基因组测序工作，其覆盖度更达到95％(Schnable et al.2009)。经预测，玉米基因组大小约为2500MB，基因数量约为5万-6万个，测序小组已经将玉米基因组草图信息存入互联网基因测序公共数据库maizeGDB，并且还在不断地更新数据。
玉米基因组的大规模测序，有利于我们利用基因组序列信息发展足够多的分子标记，同时玉米的基因组信息及大量分子标记的开发为玉米基因的图位克隆提供了很大的便利，大大加速了我们基因定位的进程。目前，玉米基因的图位克隆工作如火如荼，国内外众多实验室都在利用图位克隆的方法克隆玉米重要基因。
图位克隆(Map-based cloning)又称定位克隆(positional cloning)，1986年首先由剑桥大学的Alan coulson提出，用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息，只需一个根据目的基因的有无建立起来的遗传分离群体，如F、DH、BC、RI等。用该方法分离基因其原理是根据功能基因在基因组中都有相对稳定的基因座，再利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建目的基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步移逐步逼近目的基因或通过染色体登陆的方法，最终克隆目的基因并通过遗传转化实验可以研究目的基因的功能。
图位克隆需要构建作图群体，主要有F2、BC1、DH(Doubled haploid)、RIL(Recombinant inbred lines)和NIL(Near-isogenic lines)等多种类型，群体大小一般来说群体越大越好。目前，玉米中通过图位克隆的方法克隆目标基因的群体一般在3000-5000数量。有的目标基因位于靠近着丝粒区，重组率低，需要大的作图群体(10000甚至更多)寻找重组个体。基因组DNA提取和基因型鉴定是一件重复性的辛苦劳动，因此，寻找一种快速进行DNA提取和基因型鉴定的方法即节省劳力又节省时间，还能加速实验进展，具有非常重要的意义。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种适用于图位克隆的基因组DNA快速提取和基因型快速鉴定方法，以解决现有技术中基因组DNA提取和基因型鉴定方法重复且耗时的问题。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种适用于图位克隆的基因型快速鉴定方法，包括如下步骤：
(1)种子发芽：选取作物种子用湿毛巾法进行培养发芽；
(2)混合取样：发芽后，于每棵作物苗生长点以上进行取样；
(3)基因组提取：将所得作物苗样品进行破碎，采用CTAB法提取基因组DNA，并进行PCR扩增；
(4)PCR扩增后，将所得DNA产物经电泳检测，经检测发生重组的样品利用其备份样品分单株重新按照步骤(3)的方法提取其DNA，以寻找发生重组的个体。
所述步骤(4)中，设计如下引物P1和/或P2进行PCR扩增：
P1-F：GTGCTCGATCGCCTCTGTAA；
P1-R：AAAGCTTGGTGGAGAGACCG；或者，
P2-F：GCACAACCTGATTCTCCCCA；
P2-R：ATAGGACGAGCCGACCAAAC。
所述步骤(1)中，所述发芽步骤的培养条件为25℃光照培养，保持16小时光照，8小时黑暗进行培养发芽。
所述步骤(1)中，所述湿毛巾法具体包括：先将毛巾在沸水中煮15-20分钟，凉透后捞出，将一半毛巾铺在培养盒底部，并将以超纯水浸洗后的种子均匀地平铺在毛巾上，并以毛巾的另一半盖在种子上。
所述步骤(2)中，所述样品取自发芽7-10天的作物苗。
所述步骤(2)中，所述取样为选取作物苗生长点以上1cm处的样本。
所述步骤(3)中，所述CTAB法提取基因组DNA的步骤具体包括：向破碎后的样品中加入500ulCTAB，置于恒温水浴锅于65℃温浴30分种；随后加入500ul氯仿震荡混匀，随后离心取上清液并加入预先加入800ul无水乙醇的离心管中静置，将析出的白色絮状沉淀DNA挑出，即得。
所述步骤(3)中，所述氯仿中还含有体积比24：1的三氯甲烷和异戊醇。
所述步骤(3)中，还包括将挑出的絮状沉淀DNA加入75％的乙醇洗涤，并7500rpm离心5分钟的步骤，随后倒掉上清液，取沉淀晾干后加入200ulddH2O混匀，备用进行PCR扩增。
所述作物为玉米作物。
所述玉米作物种子为分离群体中胚乳皱缩籽粒。
本发明所述适用于图位克隆的基因型快速鉴定方法，利用作物苗为验证样本，以一般的提取DNA方法进行验证，通过设计合理的引物进行PCR扩增，可快速完成基因组DNA的快速提取和基因型的快速鉴定，大大减少了重复劳动，节约了成本和时间，加速工作进展，该方法同样可以在其他作物中予以借鉴。
本发明所述方法采用湿毛巾法培养种子，采用塑料盒发芽法比直接种在土里要省时省力，节约空间和时间，而且一般一次可以种两个塑料盒，省事省力。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为实施例1中P1引物检测样品的电泳图，其中，图1中A为10个混合样品的电泳图，1-10对应10个混合样品，11为突变体，12为F1株，13为B73株；图1中B为混合样品9对应的10个单株个体的电泳图，1-10对应10个混合样品，11为突变体，12为F1株，13为B73株；
图2为实施例2中P2引物检测样品的电泳图，其中，图2中A为10个混合样品的电泳图，1-10对应10个混合样品，11为突变体，12为F1株，13为B73株；图2中B为混合样品2对应的10个单株个体的电泳图，1-10对应10个混合样品，11为突变体，12为F1株，13为B73株；
图3为实施例3中P1和P2引物检测样品的电泳图，其中，图3中A为P1引物检测10个混合样品的电泳图，1-10对应10个混合样品，11为突变体，12为F1株，13为B73株；图3中B为P1引物检测混合样品5对应的10个单株个体的电泳图，1-10对应10个混合样品，11为突变体，12为F1株，13为B73株；图3中C为P2引物检测10个混合样品的电泳图，1-10对应10个混合样品，11为突变体，12为F1株，13为B73株；图3中D为P2引物检测混合样品5对应的10个单株个体的电泳图，1-10对应10个混合样品，11为突变体，12为F1株，13为B73株。
具体实施方式
实施例1
本实施例所述适用于图位克隆的基因型快速鉴定方法，包括如下步骤：
(1)把毛巾先在沸水中煮15分钟，凉透后捞出，一半铺在长约25cm，宽约18cm的塑料盒底；胚乳皱缩籽粒先用超纯水浸洗2-3遍，然后将种子(约500粒左右)均匀地平铺在毛巾上；毛巾的另一半盖在种子上。将塑料盒放在光照培养箱里培养(25℃，16小时光照，8小时黑暗)；
(2)于发芽7-10天取样，每棵玉米苗取生长点以上长度约1cm左右放入2ml离心管中(预先编好号；装好不锈钢珠，直径6mm)，每个离心管放10棵玉米苗样品(依次编号1-10)；取一个重复，以后备用；
(3)先用组织破碎仪将样品破碎，采用CTAB法提取基因组DNA：样品中加入500ulCTAB；放入恒温水浴锅65℃温浴30分种；加入500ul氯仿(三氯甲烷：异戊醇＝24:1)，低速摇床上震荡10-15分钟；12000rpm离心10分钟，取上清液400ul加入预先加入800ul无水乙醇的离心管中(吸上清液的200ul枪头不要丢弃，直接放入上述离心管中(1000ul枪头价格偏贵)；静置10-15分钟，用上述枪头将析出的白色絮状沉淀DNA挑出，将离心管中的溶液倒掉后将沉淀DNA放入，加入75％的乙醇洗涤，7500rpm离心5分钟，倒掉上清液，晾干后加入200ulddH2O，备用；
(4)将上述基因组DNA进行PCR扩增，设计如下引物：
P1-F：GTGCTCGATCGCCTCTGTAA；
P1-R：AAAGCTTGGTGGAGAGACCG。
PCR扩增体系包括：
ddH2O 6.75ul；
10x Easy Taq Buffer 1ul；
引物P1-F(10uM)0.4ul；
引物P1-R(10uM)0.4ul；
dNTPS(2.5mM)0.25ul；
EasyTaq 0.2ul；
基因组DNA 1ul；
所用试剂都是购自全式金公司。
所述PCR扩增条件：95℃5min，95℃30s，65℃30s，72℃30s，共30个循环，最后72℃10min，4℃forever。
PCR扩增后，将扩增产物经电泳检测，并以玉米籽粒胚乳皱缩突变体、F1株及B13株样品为对照，结果见图1中A所示(从左至右依次对应跑道1-13，下同)。可见，样品9为重组样品。
按照上述步骤(3)-(4)的操作，取样品9的备份样品单株10个，依次标号为9-1～9-10重新进行提取DNA及PCR扩增操作，结果见图1中B所示。可见，样品9-4为重组个体。
实施例2
本实施例所述适用于图位克隆的基因型快速鉴定方法，包括如下步骤：
(1)把毛巾先在沸水中煮15分钟，凉透后捞出，一半铺在长约25cm，宽约18cm的塑料盒底；胚乳皱缩籽粒先用超纯水浸洗2-3遍，然后将种子(约500粒左右)均匀地平铺在毛巾上；毛巾的另一半盖在种子上。将塑料盒放在光照培养箱里培养(25℃，16小时光照，8小时黑暗)；
(2)于发芽7-10天取样，每棵玉米苗取生长点以上长度约1cm左右放入2ml离心管中(预先编好号；装好不锈钢珠，直径6mm)，每个离心管放10棵玉米苗样品(依次编号1-10)；取一个重复，以后备用；
(3)先用组织破碎仪将样品破碎，采用CTAB法提取基因组DNA：样品中加入500ulCTAB；放入恒温水浴锅65℃温浴30分种；加入500ul氯仿(三氯甲烷：异戊醇＝24:1)，低速摇床上震荡10-15分钟；12000rpm离心10分钟，取上清液400ul加入预先加入800ul无水乙醇的离心管中(吸上清液的200ul枪头不要丢弃，直接放入上述离心管中(1000ul枪头价格偏贵)；静置10-15分钟，用上述枪头将析出的白色絮状沉淀DNA挑出，将离心管中的溶液倒掉后将沉淀DNA放入，加入75％的乙醇洗涤，7500rpm离心5分钟，倒掉上清液，晾干后加入200ulddH2O，备用；
(4)将上述基因组DNA进行PCR扩增，设计如下引物：
P2-F：GCACAACCTGATTCTCCCCA；
P2-R：ATAGGACGAGCCGACCAAAC。
PCR扩增体系包括：
ddH2O 6.75ul；
10x Easy Taq Buffer 1ul；
引物P2-F(10uM)0.4ul；
引物P2-R(10uM)0.4ul；
dNTPS(2.5mM)0.25ul；
EasyTaq 0.2ul；
基因组DNA 1ul；
所用试剂都是购自全式金公司。
所述PCR扩增条件：95℃5min，95℃30s，65℃30s，72℃30s，共30个循环，最后72℃10min，4℃forever。
PCR扩增后，将扩增产物经电泳检测，并以玉米籽粒皱缩突变体、F1株及B13株样品为对照，结果见图2中A所示。可见，样品2为重组样品。
按照上述步骤(3)-(4)的操作，取样品2的备份样品单株10个，依次标号为2-1～2-10重新进行提取DNA及PCR扩增操作，结果见图2中B所示。可见，样品2-8为重组个体。
实施例3
本实施例所述适用于图位克隆的基因型快速鉴定方法，包括如下步骤：
(1)把毛巾先在沸水中煮15分钟，凉透后捞出，一半铺在长约25cm，宽约18cm的塑料盒底；胚乳皱缩籽粒先用超纯水浸洗2-3遍，然后将种子(约500粒左右)均匀地平铺在毛巾上；毛巾的另一半盖在种子上。将塑料盒放在光照培养箱里培养(25℃，16小时光照，8小时黑暗)；
(2)于发芽7-10天取样，每棵玉米苗取生长点以上长度约1cm左右放入2ml离心管中(预先编好号；装好不锈钢珠，直径6mm)，每个离心管放10棵玉米苗样品(依次编号1-10)；取一个重复，以后备用；
(3)先用组织破碎仪将样品破碎，采用CTAB法提取基因组DNA：样品中加入500ulCTAB；放入恒温水浴锅65℃温浴30分种；加入500ul氯仿(三氯甲烷：异戊醇＝24:1)，低速摇床上震荡10-15分钟；12000rpm离心10分钟，取上清液400ul加入预先加入800ul无水乙醇的离心管中(吸上清液的200ul枪头不要丢弃，直接放入上述离心管中(1000ul枪头价格偏贵)；静置10-15分钟，用上述枪头将析出的白色絮状沉淀DNA挑出，将离心管中的溶液倒掉后将沉淀DNA放入，加入75％的乙醇洗涤，7500rpm离心5分钟，倒掉上清液，晾干后加入200ulddH2O，备用；
(4)将上述基因组DNA进行PCR扩增，分别设计如下引物P1或P2进行PCR扩增：
P1-F：GTGCTCGATCGCCTCTGTAA；
P1-R：AAAGCTTGGTGGAGAGACCG；或者，
P2-F：GCACAACCTGATTCTCCCCA；
P2-R：ATAGGACGAGCCGACCAAAC。
PCR扩增体系包括：
ddH2O 6.75ul；
10x Easy Taq Buffer 1ul；
引物P1-F(10uM)0.4ul；
引物P1-R(10uM)0.4ul；或者，
引物P2-F(10uM)0.4ul；
引物P2-R(10uM)0.4ul；
dNTPS(2.5mM)0.25ul；
EasyTaq 0.2ul；
基因组DNA 1ul；
所用试剂都是购自全式金公司。
所述PCR扩增条件：95℃5min，95℃30s，65℃30s，72℃30s，共30个循环，最后72℃10min，4℃forever。
PCR扩增后，将扩增产物经电泳检测，并以突变体玉米胚乳收缩突变体、F1株及B13株样品为对照，结果见图3所示。
图3中A为P1引物检测10个混合样品的电泳图，可见，样品5为重组样品。图3中C为P2引物检测10个混合样品的电泳图，同样可见，样品5为重组样品。
按照上述步骤(3)-(4)的操作，取样品5的备份样品单株10个，依次标号为5-1～5-10重新进行提取DNA及PCR扩增操作，结果见图3所示。
图3中B为P1引物检测样品5对应的10个单株个体的电泳图，可见，样品5-7为重组样品。图3中D为P2引物检测样品5对应的10个单株个体的电泳图，可见，样品5-3为重组样品。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。