阅读说明：本技术 复式BSA-seq快速鉴定棉花相关性状的主效QTL方法 (Major QTL method for rapidly identifying cotton-related traits through compound BSA-seq ) 是由 葛群 刘爱英 袁有禄 邓晓英 巩万奎 李俊文 商海红 龚举武 张志斌 范*** 于 2019-08-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种复式BSA-seq快速鉴定棉花相关性状的主效QTL的方法,该方法利用遗传背景相近的姊妹系材料综合性状优良的品种中棉所60和以及纤维品质较差的中棉所60选系EZ60作为母本,分别与共同父本中R014121杂交构建2个各含有1000个单株的F<Sub>2</Sub>分离群体,依据相关表型数据分别筛选极端材料,共构建2个群体的纤维长度、强度以及衣分共6组BSA混池,利用高通量重测序技术手段,筛选得到两个群体的共有区段(QTL)qFS-D02-1,其为主效QTL,其在物理图谱上的区间为3.15Mb。因此通过复式BSA-seq可以快速鉴定相关主效位点,挖掘相关基因,为棉花遗传改良奠定基础。(The invention discloses a method for rapidly identifying major QTL (quantitative trait locus) of cotton related traits by compound BSA-seq, which utilizes cotton 60 in a variety with excellent comprehensive traits and cotton 60 selected line EZ60 in a variety with poor fiber quality of sister line materials with similar genetic background as female parents to respectively cross with R014121 in a common male parent to construct 2F containing 1000 individuals 2 Separating populations, respectively screening extreme materials according to related phenotype data, constructing 6 groups of BSA mixed pools of fiber length, strength and clothes classification of 2 populations, and screening by using a high-throughput re-sequencing technical means to obtain a common segment (QTL) qFS-D02-1 of the two populations, wherein the common segment is a main effect QTL and the segment on a physical map is 3.15 Mb. Therefore, the related major effective sites can be rapidly identified through the compound BSA-seq, the related genes are excavated, and a foundation is laid for the genetic improvement of cotton.)

复式BSA-seq快速鉴定棉花相关性状的主效QTL方法

技术领域

本发明属于生物技术应用领域，涉及到复式BSA-seq快速鉴定陆地棉主效QTLs，为棉花主要分子辅助选择鉴定基础。

背景技术

棉花纤维是由胚珠外珠被表皮单细胞发育形成的毛状体，是研究细胞发育、细胞壁和纤维素合成的理想模式材料，纤维品质和产量由纤维发育过程的4个阶段共同调控，即起始期、伸长期、次生壁加厚期和成熟期。棉花纤维强度等品质性状属于受多基因控制的复杂数量性状，极易受到环境因素的影响，其表现型是由基因型与环境相互作用的结果，且纤维品质和产量性状之间存在较大的负相关，因此对数量性状的遗传操纵能力决定了作物育种的效率。传统育种方法需要的群体大、周期长，而且成本高、预见性差等劣势，因此采用常规育种手段难以实现棉花纤维品质与产量的同步改良。近年来，随着生物技术的发展，为作物性状改良提供了新的途径，通过对纤维强度等相关性状位点的定位，分子标记辅助选择，候选基因的筛选与鉴定等分子手段，加快棉花纤维品质改良。国内外对棉花纤维强度性状形成的遗传基础及分子调控机制研究十分重视，在遗传图谱构建与纤维强度性状QTL定位、重要基因克隆与功能鉴定等方面的研究中均取得了重要进展。

为了研究棉花纤维强度性状的遗传机制，并利用标记辅助选择改良纤维强度，以陆陆种内群体、海陆种间群体以及其他群体，在遗传连锁图谱构建的基础上，已经定位了一系列纤维强度相关的QTL。Zhang等利用陆地棉种内(0-153×sGK9708)重组自交系群体在11个环境下的表型数据和包括2394个SNP 标记的遗传图谱，一共检测到63个单个环境下的纤维强度QTL，16个多个环境稳定的纤维强度 QTL (Zhang et al. Construction of ahigh-density genetic map and its application to QTL identification for fiberstrength in Upland cotton. Crop Science,2017, 57(2):774.)；Ma 等利用 F₁₄重组自交系群体(RIL)与母本回交构建BC群体，在该群体内检测到26个QTL，而在重组自交系群体中检测到37个QTL。其中，在两个群体中均能检测到的QTL只有 7个QTL (Ma et al.QTLsanalysis and validation for fiber quality traits using maternal backcrosspopulation in Upland cotton[J]. Frontiers in Plant Science, 2017, 8:2168)；Liu等利用加密后包括2051个SSR标记的高密度遗传图谱和（CCRI35×Yumian 1）重组自交系群体在6个环境下的纤维品质和产量表型数据，一共检测到113个产量和纤维品质QTL，其中，50个QTL 在多个环境下检测到或者该QTL的加性效应值大于环境效应值(Liu etal.Enriching an intraspecifc genetic map and identifying QTL for fiberquality and yield component traits across multiple environments in Uplandcotton (Gossypium hirsutum L.) [J].Mol Genet Genomics,2017,292(6):1281-1306)；Diouf等利用CCRI35×NH F_2:3群体构建包括 5178个GBS-SNP标记的遗传图谱，结合包括纤维品质在内的11个性状表型数据，共检测到110个 QTL，其中，30个QTL 在2个环境中检测到(Diouf et al. QTL mapping of fiber q uality and yield-related traits in anintra-specific upland cotton using genotype by sequencing (GBS).International journal of molecular sciences, 2018, 19(2): 441)；Tan等利用渝棉1号×Acala Maxxa重组自交系群体，通过Cotton SNP80K芯片，结合SSR标记构建陆地棉高密度遗传图谱，获得27个与纤维强度相关的QTL(Tan et al. Genetic Map Constructionand Fiber Quality QTL Mapping Using the CottonSNP80K Array in Upland Cotton.Frontiers inPlant Science, 2018, 9:225. )。Yu等通过陆地棉与海岛棉杂交回交构建的146个BIL 群体，在2个以上环境中检测到的纤维品质相关QTL有2个，１个与纤维强度相关，１个与纤维整齐度相关（Yu et al. 2013. Mapping quantitative trait loci forlint yield and fiber quality across environments in a Gossypium hirsutum×Gossypium barbadense, backcross inbred line population. Theoretical andAppliedGenetics, 126(1):275-287）；Yu等利用棉花陆海F₂、F_2:3和TC等3个群体，分别检测到5、4和5个纤维品质QTL（Yu et al.. Identification of quantitative trait lociacross interspecific F2, F2:3and testcross populations for agronomic andfiber traits in tetraploid cotton. Euphytica, 2013, 191(3):375-389）。Si等利用海岛棉背景下的陆地棉渗入系解析了陆地棉衣分和纤维品质的遗传特性，一共检测到39个QTL，包括4个QTL簇，其中3个QTL簇（纤维长度、比强度和铃重）导入系降低海岛棉品质和产量 (Si et al. Genetic dissection of lint yield and fiber quality traits of G.hirsutum in G. barbadense background[J]. Mol Breeding,2017,37(1):9)。Jia等利用海陆种间重组自交系群体检测到与纤维强度相关的QTL 36个 (Jia et al. QTLdelineation for five fiber quality traits based on an intra-specificGossypium hirsutum L. recombinant inbred line population. Moleculargeneticsand genomics, 2018, 293(4): 831-843)。利用陆地棉背景下的黄褐棉BC₃F₂、 BC₃F_2:3和BC₃F_2:4导入系检测到42个纤维品质QTL，包括15个纤维强度QTL和27个纤维马克隆值QTL(Wanget al. Advanced backcross QTL analysis of fiber strength and fineness ina cross between Gossypium hirsutum and G. mustelinum. Frontiers in PlantScience, 2017, 8:1848。Keerio等利用SLAF-seq对陆地棉与毛棉的107个渐渗系进行分析，共获得3157个高质量的SNP标记，共得到与棉花纤维品质相关的QTLs 30个，与产量性状相关的QTLs 44个（Keerio et al. QTL Mapping for Fiber Quality and Yield TraitsBased on Introgression Lines Derived from Gossypium hirsutum × G. tomentosum[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2018, 19(1):243.）。

混池分组测序（BSA-seq）：针对研究的目标性状，选择表型极端差异的亲本构建混池，对亲本及极端混池进行DNA测序，检测与性状相关联的位点，快速挖掘候选基因的方法。早在1991 年，Michelmore等（1991）首次采用混池分组分析（BSA）方法在莴苣分离群体中成功筛选到 3个与霜霉病抗性基因 Dm5/8紧密连锁的标记(Michelmore et al.Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulkedsegregant analysis: a rapid method to detect markers in specific genomicregions by using segregating populations. Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America, 1991, 88: 9828)；近年来，基于高通量测序技术的BSA 方法，即 BSA-seq技术已被成功用于作物重要农艺性状相关QTL的精细定位和候选基因鉴别（Ogiso et al. Detection of novel QTLs qDTH4.5 and qDTH6.3,which confer late heading under short-day conditions, by SSR marker-based andQTL-seq analysis. Breeding Science, 2017, 67: 101.；Pandey et al. QTL-seqapproach identified genomic regions and diagnostic markers for rust and lateleaf spot resistance in groundnut (Arachis hypogaea L.). Plant BiotechnologyJournal, 2017,15: 927.；Shu et al. QTL-seq for rapid identification ofcandidate genes for flowering time in broccoli×cabbage. Theoretical andApplied Genetics. 2018, 101:1-12）。BSA-seq技术可实现对作物重要性状相关 QTL/关键基因区段高效、准确的精细定位，但是在棉花中主要是与质量性状相关的精细定位报道。Chen 等（2015）利用BSA-seq技术将隐性无限分支基因gb_nb1定位到16号染色体上600 kb左右的2个SNP 标记间(Chen et al. Genetic mapping of the nulliplex-branch gene(gb_nb1) in cotton using next-generation sequencing. Theoretical & AppliedGenetics,2015, 128:539-547)。Zhu等（2017）利用陆BSA-seq技术精细定位芽黄基因virescent-1，成功鉴别候选基因 GhCHL1(Zhu et al. Rapid mapping and cloning ofthe virescent-1 gene in cotton by bulked segregant analysis-next generationsequencing and virus-induced gene silencing strategies. Journal ofExperimental Botany,2017, 68: 4125)。Marina等（2017）利用BSA-seq技术发现了与Li性状完全连锁的SNP位点，群体验证后得到超短纤维Li1基因。利用该技术对棉花纤维强度等数量性状相关 QTL进行定位的研究报道很少，Zhang等（2015）通过BSA方法和SSR标记，构建了陆地棉25号染色体遗传图谱，发掘了棉花纤维长度、强度以及马克隆值的QTL（ZhangZhen, Li Junwen, Muhammad Jamshed, et al. High Resolution Consensus Mappingof Quantitative Trait Loci for Fiber Strength, Length and Micronaire onChromosome 25 of the Upland Cotton (Gossypium hirsutum L.). PLoS ONE, 2015,10(8): e0135430）。通过利用姊妹系为母本构建的分离大群体，根据相关性状构建复试BSA混池，通过高通量重测序技术，快速获得共有区段，确定为候选QTL，还没有报导。

发明内容

棉花纤维强度与长度成正相关，与衣分成负相关，因此结合性状间的相关性，本发明是利用遗传背景相近的姊妹系材料与共同父本分别构建分离大群体，选择各性状的极端材料分别构建高性状值和低性状值的BSA混池，利用高通量测序技术，快速获得主效QTL。

本发明提供的技术方案是：本发明提供一种复式BSA-seq快速鉴定棉花相关性状的主效QTL的方法：利用遗传背景相近的姊妹系材料综合性状优良的品种中棉所60以及纤维品质较差的中棉所60选系EZ60（以下简称EZ60）（国家棉花种质中期库，国家种质统一库编号：M116025，河南省安阳开市发区黄河大道38号，邮编：455000）与共同父本中R014121（国家棉花种质中期库，国家种质统一库编号：ZM115357）分别构建含有1000个单株的F₂分离群体，是研究数量性状遗传的理想材料，可有效消除群体内遗传背景的干扰，可提高复杂农艺性状基因定位的准确性。棉花纤维强度与长度成正相关，与衣分成负相关，因此结合具有相关性状间极端材料分别构建混池，共构建中棉所60×中R014121 F₂群体纤维强度、纤维长度以及衣分混池，和EZ60×中R014121 F₂群体纤维强度、纤维长度以及衣分混池，共6组混池。利用高通量测序技术，快速获得主效QTL。

本发明所述的复式BSA-seq快速鉴定棉花相关性状的主效QTL的方法，该方法包括以步骤：

（1）利用遗传背景相近的姊妹系材料综合性状优良的品种以及纤维品质较差的品系与其共同父本分别构建两个陆地棉的杂交组合，其中，组合Ⅰ：综合性状优良的品种×父本 ，组合Ⅱ：纤维品质较差的品系×父本，获得各包含1000个单株的F₂分离群体以及F_2:3，F_2:4群体，并准确鉴定F₂，F_2:3，F_2:4群体的表型数据；

（2）依据棉花纤维强度与长度成正相关，与衣分成负相关的特点，分别筛选综合性状优良的品种×父本以及纤维品质较差的品系×父本的F₂群体中高强材料单株、低强单株材料；长度较长的单株材料、长度较短单株材料；衣分较高单株材料以及衣分较低单株材料，提取叶片基因组DNA；

（3）将所述两个群体的高强单株、低强单株；长度较长单株、长度较短单株；衣分较高单株以及衣分较低单株的基因组DNA等量混合，构建六组BSA混池；

（4）利用高通量重测序技术对混池DNA进行测序，每个混池的测序深度为棉花基因组DNA的30倍，利用QTL-seqr软件包对结果进行分析，六组BSA混池结果共同指向一个共有区段qFS-chrD02-1，其为陆地棉纤维强度主效基因位点。

所述的复式BSA快速鉴定棉花相关性状的主效QTL的方法，具体地，步骤（1）中，所述综合性状优良的品种是中棉所60，纤维品质较差的品系是中棉所60选系EZ60，共同父本为中R014121，组合Ⅰ：中棉所60×中R014121 ，组合Ⅱ：EZ60×中R014121。本发明方法提供的一个具体实施例如下：

（1）利用遗传背景相近的姊妹系材料综合性状优良的品种中棉所60以及纤维品质较差的品系EZ60与共同父本中R014121分别构建两个陆地棉的杂交组合，其中，组合Ⅰ：中棉所60×中R014121 ，组合Ⅱ：EZ60×中R014121，获得1000个单株的F₂分离群体，并鉴定F₂，F_2:3，F_2:4群体的表型数据；

（2）依据棉花纤维强度与长度成正相关，与衣分成负相关的特点，分别筛选出中棉所60×中R014121 的F₂群体中纤维高强材料、低强材料；长度较长的材料、长度较短材料；衣分较高材料，衣分较低材料各30株； EZ60×中R014121的F₂群体中纤维高强材料、低强材料；长度较长的材料、长度较短材料；衣分较高材料，衣分较低材料各30株；提取其叶片基因组DNA；

（3）将两个群体的高强单株、低强单株；长度较长单株、长度较短单株；衣分较高单株以及衣分较低单株的基因组DNA分别等量混合，构建6组BSA混池；

（4）利用高通量重测序技术对各混池DNA进行测序，每个混池测序深度为棉花基因组DNA的 30×，利用R语言中QTL-seqr软件包对结果进行分析，六组混池结果共同指向一个共有区段（QTL）qFS-chrD02-1（FS表示纤维强度，chrD02 表示D02染色体，QTL）qFS-chrD02-1表示在D02染色体上定位到的第一个与纤维强度相关的QTL），其为陆地棉纤维强度主效基因位点。

本发明的具有如下优点：

本发明中应用的是利用遗传背景相近的姊妹系材料综合性状优良的品种中棉所60以及纤维品质较差的品系EZ60与共同父本中R014121分别构建含有1000个单株的F2分离群体。棉花纤维强度与长度成正相关，与衣分成负相关，因此结合具有相关性状间极端材料分别构建混池，通过复式BSA-seq技术，快速获得共有区段(QTL)。

本发明所用的中棉所60以及品系EZ60是遗传背景相近的姊妹系材料，与共同父本中R014121 构建F₂分离群体，研究数量性状遗传的理想材料，可有效消除群体内遗传背景的干扰，可提高复杂农艺性状基因定位的准确性。

基于姊妹系材料构建分离群体，结合相关性状间极端材料的复式BSA-seq 技术和RNA-seq 数据高效、准确进行纤维强度 qFS-D02-1 的精细定位，本发明方法在棉花数量性状 QTL 定位中尚未报道，属于首创。

附图说明

图1为本发明中棉所60×中R014121F₂长度极端混池G-value值以及SNP-index结果；

图2为本发明中棉所60×中R014121F₂强度极端混池G-value值以及SNP-index结果；

图3为本发明EZ60×中R014121 F₂长度极端混池G-value值以及SNP-index结果；

图4为本发明中棉所60×中R014121 F₂衣分极端混池G-value值以及SNP-index结果；

这些共有的峰值图指向D02染色体。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明：

本发明复式BSA-seq快速鉴定棉花相关性状的主效QTL的方法，具体步骤如下：

（1）用于复式BSA-seq快速鉴定棉花相关性状的主效QTL的F₂群体的培育方法及过程：分别以中国农业科学院棉花研究所培育的陆地棉品种中棉所60及其选系EZ60为母本，以中国农业科学院棉花研究所培育的纤维品质优异的大铃材料中R014121为共同父本，在2015年夏天于中国农业科学院棉花研究所（河南安阳）试验农场分别配制杂交组合，2016年在安阳种植F₁，2017年在安阳种植1000个单株组成的F₂群体，自交后获得F_2:3家系，分别选取中棉所60×中R014121组合的300个F_2:3家系以及EZ60×中R014121组合的200个F_2:3家系，并结合冬季海南加代繁殖，家系内每单株各选一个自交铃，混收直获得F_2:4。F₂群体按单株收花，F_2：3以及F_2:4按家系收花，分别考种获得衣分数据，并取12-15g纤维样品用于纤维品质的测定。对相关表型（强度、长度及衣分），综合考虑F₂，F_2:3，F_2:4群体的极端材料表型数据，极端表型表现一致的单株筛选为目的材料，用于后续的BSA-seq分析。

本发明中，中棉所60选系EZ60和中R014121来源于国家棉花种质中期库（地址：河南省安阳开市发区黄河大道38号，邮编：455000），国家种质统一库编号分别为：M116025、ZM115357。

（2）取F₂群体的叶片样本，采用CTAB法分别提取中棉所60×中R014121组合的1000个单株、EZ60×中R014121组合的1000个单株和三个亲本中棉所60、EZ60以及中R014121的DNA。

（3）将步骤（1）中筛选的极端单株的DNA提取出来，通过琼脂糖凝胶电泳以及NANODROP 2000检测DNA的完整度以及浓度，按照不同的群体不同性状组建混池（中棉所60×中R014121 的F₂群体中纤维高强材料、低强材料；长度较长的材料、长度较短材料；衣分较高材料，衣分较低材料共计3组混池；EZ60×中R014121的F₂群体中纤维高强材料、低强材料；长度较长的材料、长度较短材料；衣分较高材料，衣分较低材料共3组混池），混池中的每份DNA等量混合，共构建6组混池。

（4）利用高通量重测序技术对6组混池DNA以及三个亲本DNA进行测序，利用BWA软件将测序数据比对到参考基因组，利用GATK软件检测SNP以及INDEL位点。

（5）利用QTL-seqr软件包对步骤（4）结果进行分析，六组混池结果共同指向一个共有主效位点qFS-chrD02-1（图1），其在物理图谱上的区间为3.15Mb（表1），该区段也包含了陆地棉纤维长度（图2、图3）、和衣分（图4）主效基因位点。

表1 筛选共有区间信息

注：共有的峰值图所对应的D02染色体上的起始位置，长度等信息，最小的QTL起始位置为17241605bp， 终止位置为20388962bp，大小为3.15MB。