阅读说明：本技术 麦洼牦牛特异性基因、引物组及应用 (Wheat-hollow yak specific gene, primer group and application ) 是由 信金伟 柴志欣 张成福 姬秋梅 钟金城 张强 陈晓英 曹涵文 朱勇 次旦央吉 姜 于 2019-11-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了麦洼牦牛特异性基因、引物组及应用,以解决现有技术中尚未有利用麦洼牦牛特有基因组进行麦洼牦牛品种鉴别、分子育种的问题。本发明的麦洼牦牛特异性基因,包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明引物组包括上引物和下引物,其核苷酸序列分别为：GAGCCCTGAGAACTATCGTGACTT；ATTGGACTCCTGGCGACTTTT。本发明所述的麦洼牦牛特异性基因在鉴别麦洼牦牛品种、分子育种上的应用。利用本发明的特异性基因及引物组,可以从基因水平上进行麦洼牦牛的品种鉴别及分子育种,对于优质牦牛基因资源的保护、优质牦牛资源育种、牦牛近郊品系的亲缘关系鉴定起到极大的推动作用。(The invention discloses a specific gene of a Mailuya yak, a primer group and application thereof, and aims to solve the problem that the unique genome of the Mailuya yak is not utilized to identify the variety of the Mailuya yak and carry out molecular breeding in the prior art. The wheat hollow yak specific gene comprises a nucleotide sequence shown as SEQ ID NO. 1. The primer group comprises an upper primer and a lower primer, and the nucleotide sequences of the primers are respectively as follows: GAGCCCTGAGAACTATCGTGACTT, respectively; ATTGGACTCCTGGCGACTTTT are provided. The wheat-hollow yak specific gene disclosed by the invention is applied to identification of wheat-hollow yak varieties and molecular breeding. By utilizing the specific gene and the primer group, the variety identification and molecular breeding of the wheat-lying yaks can be carried out on the gene level, and the method plays a great promoting role in protecting high-quality yak gene resources, breeding high-quality yak resources and identifying the genetic relationship of suburb strains of the yaks.)

麦洼牦牛特异性基因、引物组及应用

技术领域

本发明属于畜牧技术领域，具体地涉及麦洼牦牛特异性基因、引物组及应用。

背景技术

牦牛是分布于以青藏高原为中心，及其毗邻的高山、亚高山地区的特有牛种，能充分利用高寒草地的牧草资源，对高寒草地的生态环境条件具有极强的适应性。在空气稀薄、牧草生长期短、寒冷、枯草期长的恶劣环境条件下生活自如，繁衍后代，为当地牧民提供肉、奶、毛、燃料、役力等生产生活资料，是当地畜牧业经济中不可或缺的，可称之为“全能”的家畜。牦牛在遗传资源上是一个极为宝贵的基因库。然而，中国牦牛数量和品种类群多，分布广，目前已经被认证的牦牛品种只有19个，未被认证的仍大量存在。目前的牦牛品种认定主要是从牦牛分布区域，外形特征来分类，并未有基因层面的确切认证。这是我国牦牛品种的保护、不同牦牛品种的基因资源开发和遗传育种的一大局限。

泛基因组(pan-genome)是2005年由Tettelin H等人在微生物研究中提出来的一个概念，泛基因组包括特有基因组和共有基因组。其中特有基因组是指仅在某一群体中存在的基因，共有基因组是指在某一物种所有不同群体都存在的基因(Tettelin H,etal.2005)。

这就意味着，如果能得到牦牛这一物种的共有序列，则通过简单的DNA序列测定即可判断目标物是否为牦牛。如果能得到牦牛不同品种的特有序列，则可同样通过DNA序列测定评判目标物是哪种牦牛，归属清楚。对于保护我国优质牦牛基因资源的保护、优质牦牛资源育种、牦牛近郊品系的亲缘关系鉴定等工作都将起到极大的推动作用。

麦洼牦牛主产于四川省红原县和若尔盖县南部地区，在其周边的阿坝、松潘、南坪、壤塘等县也有分布，是中国牦牛品种中最早被人们引起广泛重视的地方品种，因中心产区属于麦洼部落而得名。现有技术中，尚未有利用特有基因组对麦洼牦牛品种鉴别的报道，因此，提供麦洼牦牛特有基因组，用于麦洼牦牛品种鉴别、分子育种，成为了本领域技术人同亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的之一在于，提供麦洼牦牛特异性基因，以解决现有技术中尚未有利用麦洼牦牛特有基因组进行麦洼牦牛品种鉴别、分子育种的问题。

本发明的目的之二在于，提供检测该麦洼牦牛特异性基因的引物组。

本发明的目的之三在于，提供包含所述引物组的试剂盒。

本发明的目的之四在于，提供所述麦洼牦牛特异性基因在鉴别麦洼牦牛品种上的应用。

本发明的目的之五在于，提供所述麦洼牦牛特异性基因在分子育种上的应用。

本发明的目的之六在于，提供一种采用所述引物组鉴别麦洼牦牛品种的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明所述的麦洼牦牛特异性基因，包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明所述的用于检测如权利要求1所述的核苷酸序列的引物组，所述引物组包括上引物和下引物，其核苷酸序列分别为：GAGCCCTGAGAACTATCGTGACTT；

ATTGGACTCCTGGCGACTTTT。

本发明所述的包括如上所述的引物组的试剂盒。

本发明所述的麦洼牦牛特异性基因在鉴别麦洼牦牛品种上的应用。

本发明所述的麦洼牦牛特异性基因在分子育种上的应用。

本发明所述的一种采用上述引物组鉴别麦洼牦牛品种的方法，包括以下步骤：

步骤1.合成引物；

步骤2.制备DNA溶液；

步骤3.配制PCR反应体系；

步骤4.PCR扩增及电泳检测。

作为本发明的一个实施例，所述步骤1中的引物浓度均为10pmol/μL。

本发明的一个实施例中，每20μL扩增反应体系含有以下组分：

作为本发明的一个实施例，所述PCR扩增的条件为：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，共33个循环。

作为本发明的一个实施例，所述电泳检测的条件为将PCR扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶120V电泳20min后凝胶成像分析。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过创造性的劳动，首次提出了麦洼牦牛的特异性基因以及引物组。利用该特异性基因及引物组，可以从基因水平上进行麦洼牦牛的品种鉴别，并进行分子育种，对于优质牦牛基因资源的保护、优质牦牛资源育种、牦牛近郊品系的亲缘关系鉴定起到极大的推动作用。

附图说明

附图1为本发明的文库构建原理图。

附图2为本发明实施例2的PCR电泳结果图，其中M为：D2000 DNA Ladder，1-3分别表示麦洼牦牛、帕里牦牛、斯布牦牛。

附图3为本发明实施例3的PCR电泳结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。

本发明的思路在于，先对帕里牦牛、麦洼牦牛、斯布牦牛3个重要的牦牛品种个体进行泛基因组测序，通过比较分析找到麦洼牦牛的特有基因序列，根据特异性基因设计引物组，并采用已确认了品种的麦洼牦牛进行验证。

实施例1

本实施例提供了从3个牦牛品种中筛选麦洼牦牛的特异性基因序列的方法。

首先利用Illumina X Ten测序平台对帕里牦牛、麦洼牦牛、斯布牦牛3个不同地方牦牛品种进行泛基因组测序数据(每个个体构建350bp，800bp,2Kb，5Kb共4个文库，覆盖度达到100X)。在此基础上，首先进行一个质量控制，过滤掉测序质量较低的数据。

我们利用SOAPDenovo2.0组装软件对每一个牦牛进行单独的组装，每一个不同地方牦牛都会得到一个组装结果。为了确定3个牦牛特有和共有的基因序列，我们需要对每个基因组组装结果进行基因注释，基因注释这样参考两方面的证据，一方面是参考已经测序的牦牛基因组和其他的一些近缘物种进行同源注释，另外一方面是先预测重复序列，对重复序列进行屏蔽之后进行从头预测，最后整合两方面的证据得到每一个牦牛基因组的基因集合。通过全基因比对和reads比对的方法来共同得到牦牛特有和共有的基因序列。

3个牦牛泛基因组测序数据中特有基因序列和共有基因序列筛选的具体步骤如下：

1.提取DNA。

选取牦牛耳组织，75％酒精清洗，去除其毛发，剪碎组织，液氮研磨后，通过酚氯仿法提取全基因组DNA。

2.DNA样本检测。

对DNA样品的检测主要包括3种方法：(1)琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解程度以及是否有RNA及蛋白等污染。(2)Nanodrop法检测DNA的纯度(OD260/280比值)。(3)Qubit法对DNA浓度进行精确定量。根据上述检测结果，采用OD值在1.8～2.0之间，含量在1.5μg/μL以上的DNA样品用来建库。上述琼脂糖凝胶电泳、Nanodrop法、Qubit法均为现有技术。

3.不同片段文库构建

DNA样品检测合格后，使用Covaris超声波破碎仪随机打断，再经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备工作。

取1μg纯化后的基因组DNA，用非接触式打断仪Bioruptor进行超声打断，打断前，将一定量的无甲基化修饰的lambdaDNA加入其中，作为control，评估Bisulfite转换效率，打断的平均长度约为300bp，打断后运用AMPure XP beads磁珠进行纯化。在打断纯化产物管中直接加入如下体系配制末端修复反应体系，充分混匀后轻微离心；

试剂	体积
		打断纯化DNA	26μL
10x Tango Buffer	2μL
		dNTPs	2μL
Klenow fragment(-exo-)	1μL

将离心管放置在PCR仪中37℃孵育30min，然后75℃15min。

在产物离心管中直接加入如下体系配制接头连接反应体系，充分混匀后轻微离心；

试剂	体积
		末端修复产物	31μL
10X T4 DNA Ligation Buffer	4μL
		H2O	12μL
PEG4000(50％)	8μL
		MethyAdaptor(25uM)	2μL
T4 DNA Ligase	3μL

将离心管放置在PCR仪中25℃孵育20min；取0.8X Beads加入新的1.5mL离心管中，将反应产物完全转移至该离心管，混匀室温孵育5min；轻微离心，将离心管放置在磁力架上静置2min使磁珠完全吸附到管壁，小心吸取上清并弃去；保持离心管放置在磁力架上，加入200μL 80％现配乙醇，静置30s，然后小心吸取上清并弃去，重复1次；保持离心管放置在磁力架上，打开管盖，室温下静置5min风干；加入22μL TE，用枪反复吹打混匀，vortex 10s，室温下静置5min；轻微离心2s，将离心管置于磁力架上2min使磁珠完全吸附到管壁，用P10吸头2次小心吸取上清并将其转移至一个新的200μL离心管中。按照EZ DNA Methylation-Gold^TM Kit试剂盒对上一步产物进行Bisulfite转化，最终柱洗脱，溶于14μL M-ElutionBuffer中。

在上一步产物离心管中按照下表配制反应体系，充分混匀后轻微离心；

试剂	体积
		BS处理后的文库DNA	12μL
UniversalPrimer/i5 IndexPrimer(20uM)	1.5μL
		Index Primer/i7 Index Primer(20uM)	1.5μL
KAPA HiFiHotStartUracil+ReadyMix	15μL

按照如下程序进行PCR反应，然后对扩增后产物直接进行Qubit定浓度。

对扩增后产物直接进行Qubit定浓度，并按照1:1质量混合所有未纯化文库，充分混匀。使用0.6-0.8x磁珠进行片段选择，然后用Qubit检测浓度，文库保存在-20℃冰箱。

文库分别经过安捷伦2100和QPCR确定片段长度和浓度，合格后进行高通量测序，高通量测序采用IlluminaHiSeqXten测序仪，测序类型为PE150。

文库构建完成后，先使用Qubit 2.0进行初步定量，稀释文库，随后使用Agilent2100对文库的***片段进行检测，***片段大小符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。文库构建原理如附图1所示。

4.上机测序

文库检测合格后，按照有效浓度及目标下机数据量的需求将不同文库pooling至flowcell，cBOT成簇后使用Illumina高通量测序平台(HiSeq)进行测序。

5.数据分析

获得原始测序序列(Sequenced Reads)后，基于参考基因组(BosGru_v2.0)进行信息分析流程，大致包括以下几个部分：

1)测序数据质量评估：主要对数据量、碱基质量、比对率、覆盖率、捕获率、均一性等指标进行统计，评估建库测序是否达到了标准(测序得到的原始数据中每个碱基位置的测序错误率都应该低于0.5％)，符合标准则进行后续分析；

2)基因组组装：每个牦牛都有不同的insertsize的文库，利用reads之间的overlap和双末端文库的insertsize，使用SOAPDenovo2.0来对各个牦牛基因组进行组装；

3)基因组注释：基因组的注释主要参考两个方面：一个方面是以已经完成的牦牛基因注释结果及其他近缘物种(山羊、绵羊、骆驼)为参考，需要用到blast和exonerate两个软件；另一方面是先预测各个牦牛的重复序列，将重复序列屏蔽之后再使用Augustus、GlimmerHMM来进行从头预测。重复序列注释是结合了基于RepBase库(http://www.girinst.org/repbase)的同源预测方法(软件：RepeatMasker和RepeatProteinMask)和基于自身序列比对(RepeatModeler、Piler、RepeatScount)及重复序列特征(软件：Trf和LTR-FINDER)的de novo从头预测方法。最终使用MAKER整合这两方面的数据得到每个牦牛最终的基因集合。

4)共有和特有基因组序列确定：利用mummer将各个牦牛的基因组组装结果与参考基因组进行全基因组比对，基于比对结果提取参考基因组(BosGru_v2.0)中没有的DNA序列；另一方面，将各个牦牛的原始测序数据直接比对到参考基因组(BosGru_v2.0)上，提取unmap的reads进行局部组装；对于每个个体来说，为了获得更准确的结果将全基因组比对和readsmapping两种方法得到的特有序列来取交集，得到了每个牦牛相对于参考基因组而言的特有序列。为了得到每个个体特有的序列，对每个牦牛相对参考基因组来说特有的序列进行一个alltoall的比对，如果没有跟其他牦牛比对上，则认为是该牦牛的特有序列。而所有牦牛的共有序列采取跟各个牦牛特有序列相反的操作，如果参考基因组上能被所有3个牦牛通过全基因组比对和reads mapping两种方法覆盖的区域，则认为是所有牦牛共有的序列。

筛选出的麦洼牦牛的特异基因组结果如下：

从上表中可见麦洼牦牛特有基因序列有100个，针对特有基因序列设计PCR引物，将特异引物分别在3个牦牛群体中利用PCR技术进行验证实验，最终得到核苷酸序列如SEQID NO.1所示麦洼牦牛特异性基因。

针对该特异性基因的PCR引物组的序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，具体为：

上游引物GAGCCCTGAGAACTATCGTGACTT；

下游引物ATTGGACTCCTGGCGACTTTT。

实施例2

本实施例提供了对实施例1的引物组的特异性进行验证的实验。

随机选取已经确认了品种的麦洼牦牛、帕里牦牛及斯布牦牛个体各20个，分别提取DNA后，利用实施例1的引物组进行PCR扩增，进行电泳检测，具体的操作步骤如下：

1.制备DNA溶液：按照实施例1中的酚氯仿法提取全基因组DNA；DNA溶液中含量大于等于1.5μg/μL；

2.配制PCR反应体系；每20μL扩增反应体系含有以下组分：

将扩增反应体系置于bio-rad伯乐PCR仪(S1000^TM)中，设置如下反应程序为：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，共33个循环。

3.PCR扩增及电泳检测；配0.5×TBE电泳缓冲液，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶溶液中含有万分之一体积Gold View，电泳条件：120V/20min，8μL PCR产物电泳，同时选取D2000 DNA Ladder(Solarbio)指示PCR产物大小。电泳完成后利用凝胶成像分析系统对电泳条带进行分析。

结果如附图2所示，利用序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物组，只在麦洼牦牛的DNA样品中扩增得到特异性大小为941bp的DNA片段；而帕里牦牛、斯布牦牛的DNA样品中无此特异性片段，呈现阴性结果。表明该引物是麦洼牦牛特有的，可用于不同牦牛类群的鉴别。

实施例3

本实施例提供了本发明的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示麦洼牦牛特异性基因的验证实验。

随机选取已经确认了品种的麦洼牦牛、斯布牦牛、帕里牦牛各20个个体，用核苷酸序列如分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物组进行小群体样本PCR结果验证。具体操作过程及条件同实施例2。

由图3可知，在麦洼牦牛20个样本中均有特异性大小为941bp的DNA片段，呈现阳性结果；而帕里牦牛和斯布牦牛中均无条带，呈现阴性结果。

从该结果可看出，实施例1中得到的麦洼牦牛基因序列及其引物可特异性的检测出麦洼牦牛，可用于品种选育、群体鉴定等工作中。

上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上做出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所

西南民族大学

<120> 麦洼牦牛特异性基因、引物组及应用

<130> 20191030

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1440

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgcacttcc tctcaggcgt gagccctgag aactatcgtg acttcacata ccaattaaag 60

agatttaacg tcggagaggc aacagactgc ccagtgttcg acggcctgta cgtgttccag 120

cagtcctgca gcggtgcatc catcgacgca gcacacagac tcaacaacca gcaggcagat 180

atatgtgtga actggtcggg aggcctgcat cacgcaaaaa ggtcagaagc gtcaggattc 240

tgttatttaa acgacatagt gctgggaatc ctggagctcc tgaagtacca cgccagagtc 300

atgtacattg acatcgacgt ccaccacggc gacggcgtcg aggaggcgtt ctacgtaaca 360

cacagggtga tgacggtcag ttttcacaaa tttggcaact tcttcccggg aacgggggac 420

gtgacagacg tgggcgtctc gtcaggcaag tactactccg tcaacgtgcc gctgaacgac 480

ggaatggacg acgacagctt cgtggagctc ttcaaggtgg tgatcggaaa gtgcgtggac 540

gtctattgcc caggagcaat agtgctccag tgcggagccg actcgctgac gggcgacagg 600

ctgggcaggt tcaacctgac gataaagggg cacgcggcct gcgtgcagtt cgtgcggagc 660

ctgaacatcc ccctgctggt gctgggcggg ggcggctaca ccatcaggaa cgtggccagg 720

tgctgggcct acgagacggg cgtcatcctc aacaaacacg aagacatgtc gaaccaaatc 780

tcactcaacg actactacga ctactacgca cccgattttc aacttcacct cacaccatca 840

caaatgacca actacaacac accagagcac ctcgaaaaga ttaaaattaa aattctcgac 900

aacctgcggt tcgtggaaaa gtcgccagga gtccaattcg cgcacgtacc tccggacttt 960

ttaaccaggg acgacgacga ggacgagtcg ctgcagaacc aggttttcga cgagggcggc 1020

ggcctcaacg ccatcaagaa gcggcagtcg tcctactcgg gcacgcacaa gctgcggagg 1080

cgggacaacc ggggggagct ctacgacctc cctgacaggg acgagcaggt gccaatatga 1140

acggcataag atatacattt tttacattta atatatatat ctttaaaata tataatatta 1200

tcgtatttgg ccactaatgt gtgttaggag gagcaaaaac gggcgcgatc gggggagtgg 1260

gacgactagt cctcactgac gtcattgtcc tcctcgatgc tgctggaata gttcggattg 1320

ttgtttttca aaagtgccta aaattaaaat taatatcgga aaaataaagg ggcttaacta 1380

taccttttcg aggatgaact tgcccttttt atacttctga gactcctcag tggcctcctc 1440

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gagccctgag aactatcgtg actt 24

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

attggactcc tggcgacttt t 21