阅读说明：本技术 Hplc同时测定秃疮花中十种生物碱的检测方法 (Detection method for simultaneously determining ten alkaloids in tinea capitis flowers by HPLC ) 是由 田野 周乐 高金鑫 倪居 张效斌 耿阳 韩忠敏 丁丽 张卫 张雨 童宗博 于 2019-12-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种HPLC同时测定秃疮花中十种生物碱的检测方法,涉及中药制药检测技术领域。本发明包括采用HPLC 525-2707TCM-2489色谱系统,柱型C18,Breeze电脑程序系统,流动相为甲醇-水洗脱体系,用于秃疮花中十种生物碱中任意1～10个化合物的同时测定。本发明建立了罂粟科植物秃疮花和白屈菜中10种生物碱类化合物浓度与峰面积之间的线性回归方程,得出10种生物碱类化合物的保留时间,为进一步定量测定药用植物中单体化合物的含量奠定实验基础,提供理论依据,(1)仪器自控流动相配比,基本消除偶然误差；(2)流动相为甲醇-水洗脱体系；(3)无需添加磷酸二氢钾、冰乙酸、三乙胺等或调节pH；(4)同时测定10种生物碱的线性回归方程和保留时间。(The invention discloses a detection method for simultaneously determining ten alkaloids in tinea capitis flowers by HPLC, and relates to the technical field of traditional Chinese medicine pharmacy detection. The method comprises an HPLC 525-Bi 2707TCM-2489 chromatographic system, a column C18 and a Breeze computer program system, wherein a mobile phase is a methanol-water elution system, and the system is used for simultaneously determining any 1-10 compounds in ten alkaloids in the fagopyrum leptopodum flowers. The invention establishes a linear regression equation between the concentrations of 10 alkaloid compounds in papaveraceae plant fagopyrum trichotomum and chelidonium and the peak area to obtain the retention time of the 10 alkaloid compounds, lays an experimental foundation for further quantitatively determining the content of the monomer compounds in medicinal plants, and provides a theoretical basis, (1) the instrument is automatically controlled to be matched with a mobile phase, and accidental errors are basically eliminated; (2) the mobile phase is a methanol-water elution system; (3) potassium dihydrogen phosphate, glacial acetic acid, triethylamine and the like are not required to be added or the pH is not required to be adjusted; (4) the linear regression equation and retention time of 10 alkaloids were determined simultaneously.)

HPLC同时测定秃疮花中十种生物碱的检测方法

技术领域

本发明属于中药制药检测技术领域，特别是涉及一种HPLC同时测定秃疮花中十种生物碱的检测方法。

背景技术

秃疮花是罂粟科，秃疮花属多年生草本植物，高可达80厘米，全体含淡黄色液汁，被短柔毛，茎多，绿色，基生叶丛生，叶片狭倒披针形，羽状深裂，小裂片先端渐尖，表面绿色，背面灰绿色，叶柄条形，茎生叶少数，生于茎上部，裂片具疏齿，先端三角状渐尖；聚伞花序；花梗无毛；具苞片。分布于中国云南西北部、四川西部、西藏南部、青海东部、甘肃南部至东南部、陕西秦岭北坡、山西南部、河北西南部和河南西北部，生长在海拔400-3700米的草坡或路旁、田埂、墙头、屋顶。秃疮花的根及全草可药用，有清热解毒、消肿镇痛、杀虫等功效，可治风火牙痛、秃疮、痈疽等。秃疮花冬春覆盖率高，可作为果园的保墒植物。

分析方法的建立有助于加快秃疮花有效成分的进一步研究，也为今后秃疮花相关产品的质量控制提供了技术支持。但是由于秃疮花中的生物碱结构、理化性质均比较相近，分离难度较大，现有的检测方法不能很好的分离大多数生物碱以及其他杂质。因此精度不高，实际操作过程中容易出现差错。

发明内容

本发明的目的在于提供一种HPLC同时测定秃疮花中十种生物碱的检测方法，通过采用HPLC色谱系统，柱型C18，Breeze电脑程序系统以及流动相为甲醇-水洗脱体系，解决了现有的仪器检测过程中存在偶然误差、只能单一检测一种生物碱，检测效率低，需要添加多种试剂调节的问题。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明为一种HPLC同时测定秃疮花中十种生物碱的检测方法，包括采用HPLC525-2707TCM-2489色谱系统，柱型C18，Breeze电脑程序系统，流动相为甲醇-水洗脱体系，用于秃疮花中十种生物碱中任意1～10个化合物的同时测定；

血根碱、黄莲碱、白屈菜红碱、白屈菜碱、异紫堇定碱、紫堇碱、小檗碱、黄莲碱、原阿片碱、木兰花碱；

其中，洗脱方法为：0～5min用10％甲醇-水体系溶液平衡柱子，5～35min由10％甲醇水溶液过渡到100％甲醇体系，进行10％甲醇～100％甲醇体系梯度洗脱，45～48min由100％甲醇过渡为10％甲醇-水体系，48～50min用10％甲醇-水体系平衡柱子；

其中，柱温25℃，上样量为1mL，进样体积为10μL，每个样品运行检测时间为50min。

进一步地，所述流动相为：溶剂A：甲醇，溶剂B：水或溶剂A：乙腈，溶剂B：水。

进一步地，所述柱型C18填料粒径为5μm,250mm×4.60mm，流速为1ml/min。

进一步地，其中10个化合物对照品的制备通过以下步骤完成：

步骤一：提取，取药材秃疮花，粗粉碎，置于提取罐中，加入50-99％的乙醇，回流提取2小时，滤过，药渣用50-99％的乙醇，回流提取2小时，滤过，合并两次滤液，65℃减压浓缩成RD1.3-1.35的浸膏；

步骤二：粗分离，浸膏用30-60％的乙醇溶解，加入D101大孔吸附树脂的色谱柱中，用30-60％的乙醇洗脱，洗脱液弃去，换用60-99％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，得到提取物；

步骤三：纯化制备，提取物经拌样，加入填装有硅胶的色谱柱中，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，薄层法检测。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明建立了罂粟科植物秃疮花和白屈菜中10种生物碱类化合物浓度与峰面积之间的线性回归方程，得出10种生物碱类化合物的保留时间，初步建立HPLC同时测定10种生物碱化合物的检测方法，为进一步定量测定药用植物中单体化合物的含量奠定实验基础，提供理论依据，并且该方法存在以下优点：(1)仪器自控流动相配比，基本消除偶然误差；(2)流动相为甲醇-水洗脱体系；(3)无需添加磷酸二氢钾、冰乙酸、三乙胺等或调节pH；(4)同时测定10种生物碱的线性回归方程和保留时间。

2、本发明利用线性回归方程和物质的含量计算公式，计算出5种单体化合物在各自原材料中的含量。

3、本发明为进一步研究和开发秃疮花和白屈菜天然的药理活性和构效关系提供有力的实验数据。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为血根碱(San)的保留时间以及吸光度峰值随浓度变化图；

图2为屈菜红碱(Che)的保留时间以及吸光度峰值随浓度变化图；

图3为紫堇碱(Cor)和异紫堇碱(Iso-Cor)的保留时间以及吸光度峰值；

图4为异紫堇碱(Iso-Cor)的保留时间以及吸光度峰值随浓度变化图；

图5为10种生物碱单体化合物的线性回归方程和保留时间表；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-5所示，本发明为一种HPLC同时测定秃疮花中十种生物碱的检测方法，包括采用HPLC 525-2707TCM-2489色谱系统，柱型C18，Breeze电脑程序系统，流动相为甲醇-水洗脱体系，用于秃疮花中十种生物碱中任意1～10个化合物的同时测定，血根碱、黄莲碱、白屈菜红碱、白屈菜碱、异紫堇定碱、紫堇碱、小檗碱、黄莲碱、原阿片碱、木兰花碱；

其中，洗脱方法为：0～5min用10％甲醇-水体系溶液平衡柱子，5～35min由10％甲醇水溶液过渡到100％甲醇体系，进行10％甲醇～100％甲醇体系梯度洗脱，45～48min由100％甲醇过渡为10％甲醇-水体系，48～50min用10％甲醇-水体系平衡柱子；

其中，柱温25℃，上样量为1mL，进样体积为10μL，每个样品运行检测时间为50min。

流动相为：溶剂A：甲醇，溶剂B：水或溶剂A：乙腈，溶剂B：水。

柱型C18填料粒径为5μm,250mm×4.60mm，流速为1ml/min。

其中10个化合物对照品的制备通过以下步骤完成：

步骤一：提取，取药材秃疮花，粗粉碎，置于提取罐中，加入50-99％的乙醇，回流提取2小时，滤过，药渣用50-99％的乙醇，回流提取2小时，滤过，合并两次滤液，65℃减压浓缩成RD1.3-1.35的浸膏；

步骤二：粗分离，浸膏用30-60％的乙醇溶解，加入D101大孔吸附树脂的色谱柱中，用30-60％的乙醇洗脱，洗脱液弃去，换用60-99％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，得到提取物；

步骤三：纯化制备，提取物经拌样，加入填装有硅胶的色谱柱中，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，薄层法检测。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。