用于检测ntrk基因融合的试剂盒和方法
阅读说明:本技术 用于检测ntrk基因融合的试剂盒和方法 (Kit and method for detecting NTRK gene fusion ) 是由 吴诗扬 许嘉森 彭璨璨 刘志明 刘芳 于 2019-11-14 设计创作,主要内容包括:本发明提供了一种用于检测NTRK基因融合的试剂盒和方法。该试剂盒包括有4管试剂中的至少一管,所述4管试剂中,含有分别针对NTRK基因12种融合类型设计得到特异性引物和探针,且每管检测1种NTRK1融合、1种NTRK2融合、1种NTRK3融合,可排除同一基因各引物间的干扰,从而极大地提高了反应体系的稳定性,提高检测的敏感度和特异性,降低出现假阳性的几率。(The invention provides a kit and a method for detecting NTRK gene fusion. The kit comprises at least one tube of 4 tubes of reagents, wherein the 4 tubes of reagents contain specific primers and probes which are respectively designed according to 12 fusion types of NTRK genes, and each tube detects 1 NTRK1 fusion, 1 NTRK2 fusion and 1 NTRK3 fusion, so that the interference among the primers of the same gene can be eliminated, the stability of a reaction system is greatly improved, the detection sensitivity and specificity are improved, and the probability of false positive is reduced.)
技术领域
本发明属于生物医学技术领域,特别涉及一种用于检测NTRK基因融合的试剂盒和方法。
背景技术
神经营养因子受体络氨酸激酶(NTRK)家族包括原肌凝蛋白受体激酶(TRK)家族的TRKA、TRKB和TRKC三种蛋白,分别由NTRK1、NTRK2和NTRK3基因编码,这些蛋白通常在神经组织中表达,并由神经营养因子(NTs)激活,在神经系统发育和功能的生理学中发挥着重要作用。NTs是指TRKA的特异性配体神经生长因子(NGF),TRKB的特异性配体脑源性生长因子(BDGF)、神经营养因子-4/5(NT-4/5)以及TRKC的特异性配体NT-3。NTs与TRK蛋白结合可诱导受体二聚体化、磷酸化并通过PI3K、RAS/MAPK/ERK和PLC-γ信号转导途径激活TRK下游信号级联通路。TRK信号通路的改变,包括基因融合、蛋白过表达和单核苷酸改变,其中NTRK基因融合在癌症的所有NTRK改变中最具特征。NTRK基因融合将导致NTRK基因家族成员(NTRK1、NTRK2、NTRK3)与另一个不相关的基因融合在一起。TRK将处于持续活跃状态,引发永久性的信号级联反应,驱动TRK融合肿瘤的扩散和生长。
NTRK基因融合有许多不同的融合类型。目前已发现的NTRK1基因融合类型有LMNA-NTRK1、TPM3-NTRK1、CD74-NTRK1、MPRIP-NTRK1、NFASC-NTRK1、SQSRM1-NTRK1、TPR-NTRK1等;NTRK2基因融合类型有AFAP1-NTRK2、NACC2-NTRK2、QKI-NTRK2、TRIM24-NTRK2等;NTRK3基因融合类型有ETV6-NTRK3、EML4-NTRK3、TPM4-NTRK3、ZNF710-NTRK3等。LMNA-NTRK1和TPM3-NTRK1是NTRK1融合的主要类型,其在所有NTRK1融合中的发生频率分别为31%和21%。ETV6-NTRK3是最常见的NTRK3融合类型,其在所有NTRK3融合中的发生频率为88%。
目前NTRK基因融合的检测方法有:新一代测序(NGS)技术、荧光原位杂交(FISH)技术、免疫组织化学(IHC)、荧光PCR法等。NGS也称为高通量测序技术,是检测NTRK基因融合的一种精确的方法,具有高通量、高灵敏度、高特异性等优点。然而NGS技术应用于NTRK基因融合检测的缺点在于:(1)成本较高;(2)操作繁琐;(3)相当耗时,例如基于Ion torrentTM NGS技术平台的检测流程,最快3天才能获得报告。
FISH被认为是检测基因融合的金标准。其具有稳定性高、灵敏度高、特异性好,实验周期短等优点。但是它一次只能检测一个靶标,例如常用的分离式FISH探针只能检测基因融合而无法具体检测融合的类型。此外,设计用于检测NTRK融合伙伴的多重探针,不仅成本高且耗时长,因此不适合在实际高通量检测中应用。
IHC与目前的分子检测方法相比更经济、更快速。但是,在IHC结果判读时总是存在一定的主观性,对弱阳性结果的判断需要进一步用FISH等技术来验证。此外,IHC在NTRK基因融合检测方面应用的重复性仍有待进一步验证。
荧光PCR的优势在于:(1)操作简单易行,检测时间短;(2)灵敏度高、特异性好,检测结果准确可靠;(3)结果判断明确直观,还可对结果进行定量分析;(4)适用范围广,可适用于多种检测样本。但是,该方法目前在NTRK基因融合检测方面的应用仅限于检测某一种基因融合类型;例如,人类LMNA-NTRK1基因融合突变检测引物、探针及检测试剂盒(CN108660193A)仅用于检测LMNA基因11号外显子与NTRK1基因10号外显子的融合,而NTRK1基因其它融合类型如TPM3-NTRK1以及NTRK2和NTRK3基因融合均无法检测。
因此,需要有更优的检测方法来满足以下要求:(1)能鉴别多种不同的NTRK基因融合类型;(2)操作过程简单易行,检测时间短;(3)灵敏度高、特异性好,检测结果准确可靠;(4)结果判断客观可靠;(5)适用于多种类型的样本的检测。
发明内容
基于此,本发明的目的在于提供一种用于检测NTRK基因融合的试剂盒。
为实现上述目的,本发明具体技术方案如下:
一种用于检测NTRK基因融合的试剂盒,包括有4管PCR反应试剂中的至少一管,所述4管PCR反应试剂中,每管PCR反应试剂分别包括有:
针对NTRK1基因融合的A)、B)、C)、D)四种中的一种引物和探针;和/或针对NTRK2基因融合的E)、F)、G)、H)四种中的一种引物和探针;和/或针对NTRK3基因融合的I)、J)、K)、L)四种中的一种引物和探针;所述4管PCR反应试剂中,每管PCR反应试剂之间的引物和探针不重复;其中:
A)为针对LMNA-NTRK1基因融合的NTRK基因外显子E10融合伙伴外显子E2的引物和探针;B)为针对LMNA-NTRK1基因融合的NTRK基因外显子E11融合伙伴外显子E2的引物和探针;C)为针对LMNA-NTRK1基因融合的NTRK基因外显子E11融合伙伴外显子E10的引物和探针;D)为针对TPM3-NTRK1基因融合的NTRK基因外显子E10融合伙伴外显子E7的引物和探针;E)为针对AFAP1-NTRK2基因融合的NTRK基因外显子E12融合伙伴外显子E13的引物和探针;F)为针对NACC2-NTRK2基因融合的NTRK基因外显子E13融合伙伴外显子E4的引物和探针;G)为针对QKI-NTRK2基因融合的NTRK基因外显子E16融合伙伴外显子E6的引物和探针;H)为针对TRIM24-NTRK2基因融合的NTRK基因外显子E15融合伙伴外显子E12的引物和探针;I)为针对ETV6-NTRK3基因融合的NTRK基因外显子E14融合伙伴外显子E4的引物和探针;J)为针对ETV6-NTRK3基因融合的NTRK基因外显子E14融合伙伴外显子E5的引物和探针;K)为针对ETV6-NTRK3基因融合的NTRK基因外显子E15融合伙伴外显子E4的引物和探针;L)为针对ETV6-NTRK3基因融合的NTRK基因外显子E15融合伙伴外显子E5的引物和探针。探针的3’端连接有MGB修饰基团,5’端修饰有荧光报告基团;其中,针对NTRK1基因融合的探针、针对NTRK2基因融合的探针和针对NTRK3基因融合的探针,分别标记有不同颜色的荧光报告基团。
优选地,如上所述的引物和探针中,A)引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示,探针如SEQ ID NO.25所示;B)引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示,探针如SEQ ID NO.26所示;C)引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示,探针如SEQ ID NO.27所示;D)引物如SEQID NO.7和SEQ ID NO.8所示,探针如SEQ ID NO.28所示;E)引物如SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示,探针如SEQ ID NO.29所示;F)引物如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示,探针如SEQ ID NO.30所示;G)引物如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示,探针如SEQ ID NO.31所示;H)引物如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示,探针如SEQ ID NO.32所示;I)引物如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示,探针如SEQ ID NO.33所示;J)引物如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示,探针如SEQ ID NO.34所示;K)引物如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示,探针如SEQ ID NO.35所示;L)引物如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示,探针如SEQ IDNO.36所示。
优选地,所述试剂盒包括有4管PCR反应试剂中的至少一管,其中:
第一管PCR反应试剂包括有:核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示的引物,以及核苷酸序列如SEQID NO.25、SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.33所示的探针;核苷酸序列如SEQ ID NO.25、SEQ IDNO.30和SEQ ID NO.33所示的探针分别标记有不同颜色的荧光报告基团。第二管PCR反应试剂包括有:核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.19和SEQ ID NO.20所示的引物,以及核苷酸序列如SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.29和SEQID NO.34所示的探针;核苷酸序列如SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.34所示的探针分别标记有不同颜色的荧光报告基团。第三管PCR反应试剂包括有:核苷酸序列如SEQID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示的引物,以及核苷酸序列如SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.35所示的探针;核苷酸序列如SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.35所示的探针分别标记有不同颜色的荧光报告基团。第四管PCR反应试剂包括有:核苷酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示的引物,以及核苷酸序列如SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.35所示的探针;核苷酸序列如SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.35所示的探针分别标记有不同颜色的荧光报告基团。
更优选地,所述试剂盒包括有上述4管PCR反应试剂。
优选地,还包括内标引物和内标探针,所述内标引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.37和38所示;所述内标探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.39所示。
更优选地,所述内标探针3’端连接有MGB修饰基团,5’端标记有荧光报告基团;所述内标探针的荧光报告基团的颜色区别于针对NTRK1基因融合的探针的荧光报告基团、针对NTRK2基因融合的探针的荧光报告基团和针对NTRK3基因融合的探针的荧光报告基团。
优选地,所述试剂盒还包括阳性质控品,包括13种质粒DNA中的至少一种,所述13种质粒DNA包括:LMNA-E2-NTRK1-E10基因融合序列、LMNA-E2-NTRK1-E11基因融合序列、LMNA-E10-NTRK1-E11基因融合序列、TPM3-E7-NTRK1-E10基因融合序列、AFAP1-E13-NTRK2-E12基因融合序列、NACC2-E4-NTRK2-E13基因融合序列、QKI-E6-NTRK2-E16基因融合序列、TRIM24-E12-NTRK2-E15基因融合序列、ETV6-E4-NTRK3-E14基因融合序列、ETV6-E5-NTRK3-E14基因融合序列、ETV6-E4-NTRK3-E15基因融合序列、ETV6-E5-NTRK3-E15基因融合序列和β-actin序列。
本发明还提供一种用于检测NTRK基因融合的序列,包括如上所述的至少一组引物和探针。
本发明还提供一种非诊断目的的NTRK基因融合检测方法,包括以下步骤:
(1)配制荧光PCR反应体系,所述荧光PCR反应体系中包括PCR反应试剂、样本;所述PCR反应试剂为:以上任一所述的用于检测NTRK基因融合的试剂盒中的PCR反应试剂;所述PCR反应试剂中还包括有内标引物和内标探针,所述内标引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.37和38所示;所述内标探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.39所示;所述内标探针3’端连接有MGB修饰基团,5’端标记有荧光报告基团;所述内标探针的荧光报告基团的颜色区别于针对NTRK1基因融合的探针的荧光报告基团、针对NTRK2基因融合的探针的荧光报告基团和针对NTRK3基因融合的探针的荧光报告基团;所述PCR反应试剂中还包括PCR反应液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ,其中PCR反应液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ包括PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、MgCl2、dNTP、纯化水中的至少一种,并已预混分装至八联管中;(2)荧光定量PCR反应,检测荧光信号。
其中一些实施方式中,所述PCR反应试剂中还包括有内标引物和内标探针。优选地,所述内标引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.37和38所示;所述内标探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.39所示。更优选地,所述内标探针3’端连接有MGB修饰基团,5’端标记有荧光报告基团。进一步优选地,所述内标探针荧光报告基团的颜色区别于针对NTRK1基因融合探针的荧光报告基团、针对NTRK2基因融合探针的荧光报告基团和针对NTRK3基因融合探针的荧光报告基团。
步骤(2)荧光定量PCR反应,检测荧光信号。
优选地,非诊断目的的NTRK基因融合的检测方法中,所述内标探针的荧光报告基团、针对NTRK1基因融合的探针的荧光报告基团、针对NTRK2基因融合的探针的荧光报告基团和针对NTRK3基因融合的探针的荧光报告基团分别选自FAM、HEX、ROX和CY5,且互不相同。
进一步地,荧光定量PCR反应中,荧光PCR扩增仪的荧光通道选择FAM、HEX、ROX和CY5通道。
优选地,所述荧光定量PCR反应的条件如下:95±1℃预变性5±0.5分钟,1个循环;95±1℃变性30±1秒,60±1℃退火30±1秒,72±1℃延伸30±1秒,40±5个循环;72±1℃延伸10±1分钟。
在其中一些实施方式中,检测结果根据检测到荧光信号的Ct值来判断:
若荧光信号的Ct值为0或大于等于36,则检测结果为NTRK基因融合阴性;
若荧光信号满足0<Ct值<36的条件,则检测结果为NTRK基因融合阳性。
本发明的一种用于检测NTRK基因融合的试剂盒的制备方法,包括以下步骤:(1)设计得到用于检测人类NTRK基因融合的引物和探针;(2)按照如上所述的4管试剂,分别在PCR管中分装引物和探针。
优选地,该制备方法还包括,在步骤(2)之前,在所述PCR管中分装DNA聚合酶,加入熔融状态的石蜡,待石蜡凝固。
更优选地,所述PCR管为八联管。
基于上述技术方案,本发明具有以下有益效果:
(1)检测灵敏度高、特异性好:本发明分别针对NTRK基因12种融合类型设计特异性引物和荧光探针,特异性引物能确保目的序列准确有效的扩增,片段短的带MGB修饰基团的荧光探针能更好地特异性结合靶标序列,从而确保本发明的试剂盒检测灵敏度高、特异性好;此外,12种不同的NTRK基因融合类型分成4组分管进行检测,每组检测1种NTRK1融合、1种NTRK2融合和1种NTRK3融合,可排除同一基因各引物间的干扰,从而极大地提高了反应体系的稳定性,降低检测出现假阳性的几率。
(2)检测操作快速简单:本发明中PCR反应液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ为即用型试剂,均已分装至八联管中,并使用石蜡或有类似特性的化合物在常温或低温状态下将各PCR反应液中的酶与其它组份分隔开来;待加入样本模板进行PCR反应时石蜡液化,酶便可与管内其它物质混匀反应,这一设计大大简化了检测操作过程。整个荧光PCR检测过程不超过2个小时即可完成,并且能一次性检测NTRK基因12种融合类型。
(3)适用的样本类型多样:可用于检测新鲜、冷冻或石蜡包埋组织样本以及血液样本等常规样本。
附图说明
图1为本发明NTRK基因融合阴性样本的PCR反应液Ⅰ检测曲线图;
图2为本发明NTRK基因融合阴性样本的PCR反应液Ⅱ检测曲线图;
图3为本发明NTRK基因融合阴性样本的PCR反应液Ⅲ检测曲线图;
图4为本发明NTRK基因融合阴性样本的PCR反应液Ⅳ检测曲线图;
图5为本发明NTRK基因融合阳性样本的PCR反应液Ⅰ检测曲线图;
图6为本发明NTRK基因融合阳性样本的PCR反应液Ⅱ检测曲线图;
图7为本发明NTRK基因融合阳性样本的PCR反应液Ⅲ检测曲线图;
图8为本发明NTRK基因融合阳性样本的PCR反应液Ⅳ检测曲线图;
图9为本发明阳性质控品的PCR反应液Ⅰ检测曲线图;
图10为本发明阳性质控品的PCR反应液Ⅱ检测曲线图;
图11为本发明阳性质控品的PCR反应液Ⅲ检测曲线图;
图12为本发明阳性质控品的PCR反应液Ⅳ检测曲线图。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述,以下给出了本发明的较佳实施例。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解,下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂,均为市售产品。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1用于检测人类NTRK基因融合的荧光PCR检测试剂盒
一种用于检测人类NTRK基因融合的荧光PCR检测试剂盒,包括PCR反应液Ⅰ、PCR反应液Ⅱ、PCR反应液Ⅲ、PCR反应液Ⅳ、阳性质控品。
试剂盒的制备包括以下步骤:
(1)检测引物与探针的设计及制备:针对NTRK基因12种融合类型分别设计若干对特异性引物和荧光探针,将各个引物和探针进行预实验,比较灵敏度、特异性等性能,最终优选出用于检测人类NTRK基因12种融合类型的引物组合和探针,具体如SEQ ID NO.1至36。优选的检测引物和检测探针以100μM的母液储存,根据检测需求制备成20μM的工作液备用。
(2)内标引物与探针的设计及制备:针对β-actin基因设计1对内标引物和1条内标探针,具体如SEQ ID NO.37至39。将该内标引物组和内标探针分别配制成100μM的母液储存,根据需要制备成20μM的工作液备用。
(3)按照本发明的PCR扩增混合液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ配制方案分别配制PCR扩增混合液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ,保存备用。
(4)PCR反应液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的配制:将DNA聚合酶分装至八联管,2μl/每管;再在分装有酶的八联管中,每管均加入适量已融化的石蜡,待石蜡凝固后加入PCR扩增混合液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ。PCR反应液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ在八联管中的分布如下:
序号
反应液名称
A
PCR反应液Ⅰ
B
PCR反应液Ⅱ
C
PCR反应液Ⅲ
D
PCR反应液Ⅳ
E
PCR反应液Ⅰ
F
PCR反应液Ⅱ
G
PCR反应液Ⅲ
H
PCR反应液Ⅳ
各反应液组如下表所示:
PCR反应液Ⅳ中还包含内标引物及探针,内标引物由β-actin-F1和β-actin-R1组成,依次包括如SEQ ID NO.37和38所示的序列,内标探针为β-actin-P1,其5’端修饰有荧光报告基团CY5,3’端连接有MGB修饰基团,包括如SEQ ID NO.39所示的序列;
所述PCR反应液Ⅰ-Ⅳ中特异性探针依次包括如SEQ ID NO.25至SEQ ID NO.36所示的序列,每条探针的5’端修饰有荧光报告基团FAM、HEX或ROX,3’端连接有MGB修饰基团;
所述PCR反应液Ⅰ-Ⅳ使用八联管分装,分装时加入石蜡或其它类似特性的化合物使PCR反应液中DNA聚合酶和其它组份在常温或低温状态下有效地分隔开来;具体地,分为4个步骤:①将PCR反应液Ⅰ-Ⅳ中除DNA聚合酶之外的其它组份混合配制成PCR扩增混合液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ,②DNA聚合酶分装至八联管中,1个反应/管,③将石蜡融化后加入至分装有酶的八联管中,④待八联管中石蜡凝固后加入PCR扩增混合液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ,每管对应1种PCR扩增混合液,1个反应/管。
所述PCR扩增混合液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ配制方案如下:
试剂名称
每反应(μl)
PCR反应缓冲液
4.3
MgCl<sub>2</sub>(50mM)
2.5
dNTP(10mM)
2.5
目的引物(每条引物20μM)
每条引物加入0.5μl
目的探针(每条探针20μM)
每条探针加入0.5μl
纯化水
补加至21μl
总体积
21μl
以上试剂组份:PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
上述配制体系仅为例证性,在实际应用中可以按照比例扩大或缩小该混合物体积及其中各组分含量。
PCR反应液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ配制方案如下:
引物和探针序列具体如下表所示:
引物和探针
序列(5’-3’)
SEQ ID NO.
LMNA-NTRK1-F1
GCTCTGCTGAACTCCAAGG
1
LMNA-NTRK1-R1
AGAAAGGAAGAGGCAGGCAA
2
LMNA-NTRK1-F2
CTGAAGGACCTGGAGGCTCT
3
LMNA-NTRK1-R2
TGATCCCAAACTTGTTTCTCCG
4
LMNA-NTRK1-F3
GGTTGAGGACGACGAGGATG
5
LMNA-NTRK1-R3
CCGTCCACATTTGTTGAGCA
6
TPM3-NTRK1-F1
AACTCAAGGAGGCAGAGACC
7
TPM3-NTRK1-R1
GCACAAGGAGCAGCGTAGAA
8
AFAP1-NTRK2-F1
CGGCTGTTGTGAAAAGGACG
9
AFAP1-NTRK2-R1
AATCCCACCACAGACGCAAT
10
NACC2-NTRK2-F1
CATCCGCTCGTCCACCAG
11
NACC2-NTRK2-R1
AATCCCACCACAGACGCAAT
12
QKI-NTRK2-F1
ACATTGGCACCAGCTACATC
13
QKI-NTRK2-R1
TGGGGATTTTCAATGACAGGG
14
TRIM24-NTRK2-F1
ACTAATATAGATCATGGCCAGCC
15
TRIM24-NTRK2-R1
TGGTGATGCCAAAGTACTGG
16
ETV6-NTRK3-F1
TTCAGCATATTCTGAAGCAGAGG
17
ETV6-NTRK3-R1
GTGTCCGGCTTGTGGCAG
18
ETV6-NTRK3-F2
GGCTGCATAGGGAAGGGAAG
19
ETV6-NTRK3-R2
CTTGTGGCAGTTGTGTCCCT
20
ETV6-NTRK3-F3
GTGATGTGCTCTATGAACTCCT
21
ETV6-NTRK3-R3
TTTCCAAAGGCTCCCTCACC
22
ETV6-NTRK3-F4
CCATCAACCTCTCTCATCGGG
23
ETV6-NTRK3-R4
GGGCTGAGGTTGTAGCACTC
24
LMNA-NTRK1-P1
FAM-CATGATCTGCGGGGC-GMB
25
LMNA-NTRK1-P2
FAM-CCGCACTGAGCACTG-GMB
26
LMNA-NTRK1-P3
FAM-CACGTCTCGGTGGCT-GMB
27
TPM3-NTRK1-P1
FAM-TGGCCGTCTTTGCCT-GMB
28
AFAP1-NTRK2-P1
HEX-CCGGTCGGGAACAT-GMB
29
NACC2-NTRK2-P1
HEX-CAGCCGGGTCCTGA-GMB
30
QKI-NTRK2-P1
HEX-TCGGAAGGTGGCCC-GMB
31
TRIM24-NTRK2-P1
HEX-GTGTTGGCCCAGCC-GMB
32
ETV6-NTRK3-P1
ROX-CTCAGCCAGCCCACT-GMB
33
ETV6-NTRK3-P2
ROX-CTGTCATCAGTGGTG-GMB
34
ETV6-NTRK3-P3
ROX-CATCGTGCTGAAGCG-GMB
35
ETV6-NTRK3-P4
ROX-CCGCCTGAAGAGCAC-GMB
36
β-actin-F1(内标)
GACTACCTCATGAAGATCCTCA
37
β-actin-R1(内标)
TCTCCTTAATGTCACGCACGATT
38
β-actin-F1(内标)
CY5-CGGCTACAGCTTCAC-GMB
39
(6)阳性质控品的制备:阳性质控品为含有13种质粒DNA的混合液,所述13种质粒DNA分别含有LMNA-E2-NTRK1-E10、LMNA-E2-NTRK1-E11、LMNA-E10-NTRK1-E11、TPM3-E7-NTRK1-E10、AFAP1-E13-NTRK2-E12、NACC2-E4-NTRK2-E13、QKI-E6-NTRK2-E16、TRIM24-E12-NTRK2-E15、ETV6-E4-NTRK3-E14、ETV6-E5-NTRK3-E14、ETV6-E4-NTRK3-E15、ETV6-E5-NTRK3-E15和β-actin序列,该质粒的选择及设计为本领域技术人员熟知,均为2000copies/ml。
(5)试剂盒组装:试剂盒规格为24人份/盒,由12条分装有PCR反应液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的八联管和1管24人份阳性质控品组装而成。
所述试剂盒的扩增反应体系如下:
物料名称
用量(μl)
PCR反应液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ
23
cDNA模板
2
总体积
25
所述试剂盒的扩增反应条件为:95℃预变性5分钟,1个循环;95℃变性30秒,60℃退火30秒,72℃延伸30秒,40个循环;72℃延伸10分钟。荧光PCR扩增仪荧光通道选择:检测选用FAM、HEX、ROX和CY5通道。
所述试剂盒的检测结果根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断:检测反应体系的FAM、HEX、ROX和CY5荧光强度,以CY5达到设定的阈值时表示DNA上样量在允许范围内,FAM、HEX、ROX信号结果可信;以FAM、HEX、ROX达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准,Ct值为0大于等于36:阴性;Ct值小于36:阳性。
所述试剂盒检测的融合类型具体如下表:
实施例2:特异性分析实验
用实施例1制备的一种用于检测人类NTRK基因融合的荧光PCR检测试剂盒对浓度为1250拷贝/μl的NTRK基因野生型质粒、NTRK融合突变型质粒、内标β-actin质粒分别进行检测,上样2μl,2孔。设立1空白对照,根据检测结果分析本发明试剂盒的特异性。
本实施例中所述NTRK基因野生型质粒包括NTRK1-E10、NTRK1-E11、NTRK2-E12、NTRK2-E13、NTRK2-E15、NTRK2-E16、NTRK3-E14、NTRK3-E15共8种NTRK野生型质粒,所述融合突变型质粒包括LMNA-E2-NTRK1-E10、LMNA-E2-NTRK1-E11、LMNA-E10-NTRK1-E11、TPM3-E7-NTRK1-E10、AFAP1-E13-NTRK2-E12、NACC2-E4-NTRK2-E13、QKI-E6-NTRK2-E16、TRIM24-E12-NTRK2-E15、ETV6-E4-NTRK3-E14、ETV6-E5-NTRK3-E14、ETV6-E4-NTRK3-E15、ETV6-E5-NTRK3-E15。
具体融合类型检测结果判断表如下:
检测结果显示8种NTRK基因野生型质粒检测结果皆为阴性,12种NTRK基因融合突变质粒检测结果皆为NTRK融合阳性,不同NTRK融合类型之间没有交叉反应情况,证明了本发明的检测特异性好,阴性符合率为100%,阳性符合率为100%。具体结果见下表:
PCR反应液Ⅰ检测结果
PCR反应液Ⅱ检测结果
PCR反应液Ⅲ检测结果
PCR反应液Ⅳ检测结果
实施例3:灵敏度分析实验
本实施例中取上述12种NTRK融合突变质粒,浓度分别调整至1×109拷贝/μl,再依次分别稀释至1×108、1×107、1×106、1.25×105、1.25×104、1.25×103、1.25×102、12.5、1.25、1、0.5拷贝/μl。
用实施例1中得到的一种用于检测人类NTRK基因融合的荧光PCR检测试剂盒,以上浓度为0.5、1、1.25、12.5、125、1.25×103、1.25×104、1.25×105拷贝/μl的12种NTRK融合突变质粒分别作为模板(上样2μl,3孔)进行检测,设立1空白对照,根据检测结果分析本发明试剂盒的灵敏度。
检测结果显示12种NTRK融合突变型质粒在拷贝数低至1.25拷贝/μl时,检测结果仍为NTRK基因融合阳性(Ct<36),证明了本发明的检测灵敏度高,荧光PCR反应体系中0.1拷贝/μl的融合突变均可检测。具体结果见下表:
实施例4:临床样本检测
用实施例1制备的一种用于检测人类NTRK基因融合的荧光PCR检测试剂盒对待测样本进行检测。
本实施例中收集100例肿瘤患者的FFPE样本,其中21例患者同时提供血液样本;使用市售RNA提取及逆转录试剂盒,按照其试剂盒说明书,从收集的FFPE样本、血液样本中提取RNA,逆转录成cDNA后,用实施例1中得到的一种用于检测人类NTRK基因融合的荧光PCR检测试剂盒检测待检样本的NTRK基因融合情况。
检测结果表明,所检测的100例肿瘤患者FFPE样本中有3例为NTRK基因融合阳性,融合率为3%;对于同时提供FFPE样本和血液样本的21例患者,两种样本检测结果完全相同,符合率为100%,结果如下:
以上结果证明了本发明的试剂盒不仅适用于检测FFPE样本中的NTRK基因融合情况还适用于血液样本的NTRK基因融合情况。
与此同时,对上述100例肿瘤患者FFPE样本进行二代测序检测,二代测序检测委托美吉生物完成。两种检测方法的符合率结果如下:
以上结果显示两种检测方法的符合率为100%,进一步证明了本发明检测的准确性。
以下实施例的检测结果参见图1至图12。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 益善生物技术股份有限公司
<120> 用于检测NTRK基因融合的试剂盒和方法
<160> 39
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<211> 22
<212> DNA
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tgatcccaaa cttgtttctc cg 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aatcccacca cagacgcaat 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tttccaaagg ctccctcacc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cggctacagc ttcac 15