阅读说明：本技术 Egcg在制备预防和/或治疗prv感染制剂中的应用、预防和/或治疗prv感染制剂 (Application of EGCG in preparation of preparation for preventing and/or treating PRV infection and preparation for preventing and/or treating PRV infection ) 是由 郇长超 徐伟音 郭停停 高崧 于 2019-10-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供了表没食子儿茶酚没食子酸酯在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染制剂中的应用和预防和/或治疗猪伪狂犬病毒的制剂,属于猪伪狂犬病毒感染治疗技术领域,所述药物中表没食子儿茶酚没食子酸酯的浓度为10～100μmol/L。本发明中,所述表没食子儿茶酚没食子酸酯抗猪伪狂犬病毒感染效果非常显著：所述表没食子儿茶酚没食子酸酯可以减少猪伪狂犬病毒引起的细胞病变,抑制猪伪狂犬病毒的吸附、入胞和复制,且可直接杀死猪伪狂犬病毒,更为重要的是表没食子儿茶酚没食子酸酯可以预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的小鼠,为临床治疗猪伪狂犬病提供了科学可靠的理论依据。(The invention provides application of epigallocatechin gallate in preparation of a preparation for preventing and/or treating porcine pseudorabies virus infection and a preparation for preventing and/or treating porcine pseudorabies virus, and belongs to the technical field of treatment of porcine pseudorabies virus infection, wherein the concentration of epigallocatechin gallate in the medicine is 10-100 mu mol/L. In the invention, the epigallocatechin gallate has a very significant effect on resisting the infection of the porcine pseudorabies virus: the epigallocatechin gallate can reduce cytopathic effect caused by the porcine pseudorabies virus, inhibit the adsorption, cell entry and replication of the porcine pseudorabies virus, and can directly kill the porcine pseudorabies virus, and more importantly, the epigallocatechin gallate can prevent and/or treat mice infected by the porcine pseudorabies virus, thereby providing a scientific and reliable theoretical basis for clinically treating the porcine pseudorabies.)

EGCG在制备预防和/或治疗PRV感染制剂中的应用、预防和/或 治疗PRV感染制剂

技术领域

本发明属于猪伪狂犬病毒感染治疗技术领域，尤其涉及表没食子儿茶酚没食子酸酯在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染制剂中的应用和预防和/或治疗猪伪狂犬病毒的制剂。

背景技术

猪伪狂犬病毒是线性双链的DNA分子，属于疱疹病毒科、猪疱疹病毒属，病毒粒子外有囊膜包裹，对外界环境较强的抵抗力。伪狂犬病毒具有泛嗜性，能在多种组织培养细胞内增殖，其中以兔肾和猪肾细胞(包括原Ⅰ代细胞和传代细胞系)最为敏感，并且引起明显的细胞病变。猪是伪狂犬病毒的贮存宿主，病猪、带毒猪以及带毒鼠类为本病重要传染源。在猪群中，病毒主要通过鼻分泌物传播，另外，乳汁和***也是可能的传播方式。猪发生伪狂犬病后，其临诊症状因日龄而异，15日龄以内的仔猪病死率可达100％；怀孕母猪***、流产等；公猪表现为睾丸肿胀、萎缩、丧失种用功能等。对养猪业造成巨大的经济损失。

伪狂犬病(Pseudorabies,PR)又称奥耶兹氏病(AujeszKy’s disease)，是由猪疱疹病毒1型(Suid herpesvirus 1,SuHV-1)或称伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的多种家畜和野生动物共患的疾病，以发烧，严重瘙痒(猪除外)，呼吸系统和神经系统疾病以及脑脊髓炎为特征的急性病毒感染性疾病。该病在猪中呈爆发性流行。可引起妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，新生仔猪大量死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞等，是危害全球养猪业的重大传染病之一。自2011年以来，在我国很多地区，爆发了很严重的猪伪狂犬病，且这些猪场接种了Bartha-K61疫苗，新出现的伪狂犬病毒变异株与经典的PRV毒株不同，它对所有年龄段的猪都有很高的致病性，并表现出不同程度的临床症状，这意味着：现有疫苗可能无法应对当前的PRV流行株，不能提供完全的免疫保护。简而言之，生猪养殖业会面临PRV带来的巨大风险。更为重要的是伪狂犬病毒的宿主谱十分广泛，除了感染猪、牛、羊、犬、猫等脊椎动物外，现有报道变异的猪伪狂犬病毒可感染人。因此，防控PRV感染显得尤其迫切和重要。

目前，我国对变异PRV尚未有有效的治疗措施，只能靠前期的预防以及加强卫生管理来控制该病的发生。为了减小养猪业的经济损失，迫切需要研制出有效的预防和治疗变异PRV的药物。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供表没食子儿茶酚没食子酸酯在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的制剂中的应用，所述制剂成本低、无副作用、疗效显著。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了表没食子儿茶酚没食子酸酯在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染制剂中的应用。

优选的，所述表没食子儿茶素没食子酸酯是通过抑制猪伪狂犬病毒吸附、入胞和复制来预防和/或治疗猪伪狂犬病。

优选的，所述表没食子儿茶素没食子酸酯通过直接杀死猪伪狂犬病毒来预防和/或治疗猪伪狂犬病。

本发明提供了一种预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的制剂，所述制剂中表没食子儿茶酚没食子酸酯的浓度为10～100μmol/L。

优选的，所述制剂中表没食子儿茶酚没食子酸酯的浓度为20～80μmol/L。

优选的，所述制剂中表没食子儿茶酚没食子酸酯的浓度为40～60μmol/L。

优选的，所述制剂的溶剂为PBS缓冲液或者DMSO。

优选的，所述PBS缓冲液的浓度为0.05～0.15mol/L。

优选的，所述PBS缓冲液的浓度为0.08～0.12mol/L。

优选的，通过将所述表没食子儿茶酚没食子酸酯溶解于溶剂中获得所述制剂。

本发明的有益效果：本发明提供了表没食子儿茶酚没食子酸酯在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染制剂中的应用；所述表没食子儿茶酚没食子酸酯抗猪伪狂犬病毒感染效果非常显著：所述表没食子儿茶酚没食子酸酯可以减少猪伪狂犬病毒引起的细胞病变，抑制猪伪狂犬病毒的吸附、入胞和复制，且可直接杀死猪伪狂犬病毒，为临床治疗猪猪伪狂犬病提供了科学可靠的理论依据。同时，表没食子儿茶素没食子酸酯，是固体绿茶提取物中发现的含量最丰富的生物活性多酚，具有药源广泛、原料易得、成本低等优点；所述表没食子儿茶素没食子酸酯来源于中药，经动物机体代谢后，对环境污染小，且对动物无毒副作用；所述表没食子儿茶素没食子酸酯在临床上还具有多种生物学意义，具抗氧化、抗动脉硬化、抗血栓形成、抗血管增生以及抗肿瘤等药理作用。

附图说明

图1在显微镜下，观察EGCG对猪伪狂犬病毒感染PK-15B6细胞引起的细胞病变的影响；

图2EGCG在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒感染的影响；其中，A为Westernblot测定EGCG在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒感染的影响；B为TCID50测定EGCG EGCG在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒感染的影响；C为荧光定量PCR测定EGCG在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒感染的影响；

图3为EGCG在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒吸附和入胞的影响，其中A为Westernblot测定EGCG在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒吸附和入胞的影响；B为TCID50测定EGCG在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒吸附和入胞的影响；C为荧光定量PCR测定EGCG在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒吸附和入胞的影响；

图4为EGCG在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒吸附的影响；其中，A为Western blot测定EGCG在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒吸附的影响；B为TCID50测定EGCG在Dulac细胞上对猪伪狂犬病毒吸附的影响；C为荧光定量PCR测定EGCG在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒吸附的影响；

图5为EGCG在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒入胞的影响；其中A为Weatern blot测定EGCG在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒入胞的影响；B为荧光定量PCR测定EGCG在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒入胞的影响；C为TCID50测定EGCG在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒入胞的影响；

图6为Western blot测定EGCG在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒复制的影响；

图7为EGCG在对猪伪狂犬病毒中的直接杀伤作用；其中，A为Western blot测定EGCG对猪伪狂犬病毒中的直接杀伤作用，B为TCID50测定EGCG对猪伪狂犬病毒中的直接杀伤作用；

图8为通过小鼠存活率，验证EGCG对攻毒小鼠的保护率。

具体实施方式

本发明提供了表没食子儿茶酚没食子酸酯在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染制剂中的应用。在本发明中，所述表没食子儿茶酚没食子酸酯抗猪伪狂犬病毒感染效果非常显著：所述表没食子儿茶酚没食子酸酯可以减少猪伪狂犬病毒引起的细胞病变；抑制猪伪狂犬病毒的吸附、入胞和复制；且可直接杀死猪伪狂犬病毒；通过小鼠体内试验，表没食子儿茶酚没食子酸酯可预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的小鼠。本发明对所述表没食子儿茶酚没食子酸酯的来源没有特殊要求，采用本领域常规的市售产品或自行制备均可。

本发明还提供了一种预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的制剂，所述制剂中表没食子儿茶酚没食子酸酯的浓度为10～100mmol/L，优选为20～80mmol/L，更优选为40～60mmol/L，最优选为50mmol/L。在本发明中，所述药物优选为液体制剂，所述药物的溶剂优选为PBS缓冲液或者DMSO；当所述溶剂为PBS缓冲液时，所述PBS缓冲液的浓度优选为0.05～0.15mol/L，更优选为0.08～0.12mol/L，最优选为0.1mol/L。

在本发明中，所述药物优选的通过将所述表没食子儿茶酚没食子酸酯溶解于溶剂中获得。本发明对所述溶解的方法和时间没有特殊限定，能够实现充分溶解即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的制剂，将表没食子儿茶酚没食子酸酯溶解于0.1mol/L的PBS缓冲液中获得，表没食子儿茶酚没食子酸酯的浓度为50mmol/L。

实施例2

一种预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的制剂，将表没食子儿茶酚没食子酸酯溶解于0.15mol/L的PBS缓冲液中获得，表没食子儿茶酚没食子酸酯的浓度为40mmol/L。

实施例3

一种预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的制剂，将表没食子儿茶酚没食子酸酯溶解于0.1mol/L的PBS缓冲液中获得，表没食子儿茶酚没食子酸酯的浓度为100mmol/L。

实施例4

一种预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的制剂，将表没食子儿茶酚没食子酸酯溶解于DMSO中获得，表没食子儿茶酚没食子酸酯的浓度为60mmol/L。

实施例5

表没食子儿茶素没食子酸酯对猪伪狂犬病毒引起的细胞病变的影响

将PK-15B6细胞(购买中国兽医药品监察所)用含4％胎牛血清的营养液稀释并计数，将5×10⁵个/孔的浓度的细胞铺到六孔板中，置于含5％CO₂的37℃培养箱。待细胞长到70～80％的密度(大概16h)后，用PBS溶液将细胞洗两遍，分别用PBS、不同浓度的EGCG(10μM，20μM，50μM，100μM)预处理1h，然后用猪伪狂犬病毒PRV XJ5毒株(0.1MOI)感染细胞，1h后换液，感染24h且药物一直存在，在显微镜下，观察细胞的形态变化及病变情况。根据图1结果所示，EGCG可以减少猪伪狂犬病毒引起的细胞病变。表明EGCG可能减少猪伪狂犬病毒的感染。

实施例6

表没食子儿茶素没食子酸酯在PK-15B6细胞上抑制猪伪狂犬病毒感染的活性(Western blot、荧光定量PCR和TCID50实验)

(1)Western blot测定表没食子儿茶素没食子酸酯在PK-15B6细胞上抑制猪伪狂犬病毒感染的活性

PK-15B6细胞消化用体积浓度4％FBS的DMEM营养液稀释，以5×10⁵/孔的浓度滴加到6孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中待细胞贴壁成单层后(约17～18h)，用PBS溶液将细胞洗三遍，吸尽残留PBS后，加入用1mL无血清的DMEM稀释到相应浓度的EGCG(10μM、20μM、50μM、100μM)，与PK-15B6细胞37℃孵育1h后，用猪伪狂犬病毒感染细胞并有相应浓度的EGCG(10μM、20μM、50μM、100μM)存在，放37℃，5％CO₂培养箱孵育1h后，换成2mL含有2％FBS的DMEM营养液维持且有相应浓度的EGCG(10μM、20μM、50μM、100μM)存在，放37℃，5％CO₂培养箱中培养，感染24h后，收集细胞上清(1mL放-70℃保存为后期TCID50实验做准备)，用PBS洗三遍后吸尽残液，加入2×蛋白loading收集细胞样品，在金属浴96℃煮15min，然后进行Westernblot检测。发现EGCG降低猪伪狂犬病毒gE和UL42蛋白的表达(图2中的A)，初步证实EGCG降低猪伪狂犬病毒的感染。

(2)TCID50测定表没食子儿茶素没食子酸酯在PK-15B6细胞上抑制猪伪狂犬病毒感染的活性

Vero细胞消化用体积浓度8％FBS的DMEM营养液稀释，以2×10³/孔的浓度滴加到96孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中待细胞贴壁成单层后，用PBS洗三遍，吸尽残余液体后，加入用无血清的DMEM稀释的不同浓度的病毒液，每个浓度做8个重复，感染1.5h后，换成含2％FBS的DMEM维持，待感染72h后观察细胞病变的情况。发现EGCG降低猪伪狂犬病毒感染上清的病毒滴度(图2中的B)，证实EGCG降低猪伪狂犬病毒的感染。

(3)荧光定量PCR测定表没食子儿茶素没食子酸酯在PK-15B6细胞上抑制猪伪狂犬病毒感染的活性

PK-15B6细胞消化用体积浓度4％FBS的DMEM营养液稀释，以5×10⁵/孔的浓度滴加到6孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中待细胞贴壁成单层后(约17-18h)，用PBS溶液将细胞洗三遍，吸尽残留PBS后，加入用1mL无血清的DMEM稀释到相应浓度的EGCG(10μM、20μM、50μM、100μM)，与PK-15B6细胞37℃孵育1h后，用猪伪狂犬病毒感染细胞并有相应浓度的EGCG(10μM、20μM、50μM、100μM)存在，放37℃，5％CO₂培养箱孵育1h后，换成2mL含有2％FBS的DMEM营养液维持且有相应浓度的EGCG(10μM、20μM、50μM、100μM)存在，放37℃，5％CO₂培养箱中培养，感染24h后，用PBS洗三遍，然后加上无血清的DMEM营养液1mL，置于-70℃的冰箱，反复冻融3次后，提取DNA，用于实时荧光定量PCR检测。所用的PCR引物：gB94F:5’-ACAAGTTCAAGGCCCACATCTAC-3’(SEQ IDNo.1)；gB94R:5’-GTCCGTGAAGCGGTTCGTGAT(SEQIDNo.2)；gB probe 5'-FAM-ACGTCATCGTCACGACC-TAMRA-3'(SEQ IDNo.3)。所用20μL反应体系中含有DMSO 0.2μL、TaqDNA聚合酶0.5μL、上下游引物各0.8μL、dNTP0.4μL、10×buffer 2μL、DNA 2μL、探针0.4μL、无RNase水12.9μL。扩增参数95℃600s、95℃10s、62℃20s共45个循环。结果如图2中的C所示，EGCG能够降低猪伪狂犬病毒核酸拷贝数，证实EGCG降低猪伪狂犬病毒的感染。

实施例7

表没食子儿茶素没食子酸酯对猪伪狂犬病毒吸附和入胞的影响(Western blot、荧光定量PCR和TCID50实验)

(1)Western blot测定表没食子儿茶素没食子酸酯在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒吸附和入胞的影响

PK-15B6细胞消化用4％FBS的DMEM营养液稀释到适当的密度，以5×10⁵/孔的浓度滴加到6孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中待细胞贴壁成单层后(约17～18h)，用PBS溶液将细胞洗三遍，吸尽残留PBS后，加入用1mL无血清的DMEM稀释到相应浓度的EGCG(10μM、20μM、50μM、100μM)，与PK-15B6细胞37℃孵育1h后，换成冷的无血清的DMEM，4℃感染猪伪狂犬病毒并有相应浓度的EGCG(10μM、20μM、50μM、100μM)存在，孵育1h后，用冷的PBS洗三次，加入含2％FBS的DMEM1mL并有相应浓度的EGCG(10μM、20μM、50μM、100μM)存在，在37℃孵育1h后，用柠檬酸洗三遍后再用PBS洗三遍后吸尽残液，换成2mL含有2％FBS的DMEM营养液维持，放37℃，5％CO₂培养箱中培养，感染24h后，收集细胞上清(1mL放-70℃保存为后期TCID50实验做准备)，加入2×蛋白loading收集细胞样品，在金属浴96℃煮15min，然后进行Westernblot检测。结果如图3中的A所示，发现EGCG降低猪伪狂犬病毒gE和UL42蛋白的表达，初步证实EGCG降低猪伪狂犬病毒的吸附和入胞。

(2)TCID50测定表没食子儿茶素没食子酸酯在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒入胞的影响

Vero细胞消化用8％FBS的DMEM营养液稀释，以2×10³/孔的浓度滴加到96孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中待细胞贴壁成单层后，用PBS洗三遍，吸尽残余液体后，加入用无血清的DMEM稀释的不同浓度的病毒液，每个浓度做8个重复，感染1.5h后，换成含2％FBS的DMEM维持，待感染72h后观察细胞病变的情况。结果如图3中的B所示，发现EGCG降低猪伪狂犬病毒感染的病毒滴度，证实EGCG降低猪伪狂犬病毒的吸附和入胞。

(3)荧光定量PCR测定表没食子儿茶素没食子酸酯在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒吸附和入胞的影响

PK-15B6细胞消化用4％FBS的DMEM营养液稀释，以5×10⁵/孔的浓度滴加到6孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中待细胞贴壁成单层后(约17～18h)，用PBS溶液将细胞洗三遍，吸尽残留PBS后，加入用1mL无血清的DMEM稀释到相应浓度的EGCG(10μM、20μM、50μM、100μM)，与PK-15B6细胞37℃孵育1h后，换成冷的无血清的DMEM，4℃感染猪伪狂犬病毒并有相应浓度的EGCG(10μM、20μM、50μM、100μM)存在，孵育1h后，用冷的PBS洗三遍，加入含2％FBS的DMEM 1mL并有相应浓度的EGCG(10M、20M、50M、100M)存在，在37℃孵育1h后，用柠檬酸洗三遍后再用PBS洗三遍后吸尽残液，换成2mL含有2％FBS的DMEM营养液维持，放37℃，5％CO₂培养箱中培养，感染24h后，用PBS洗三遍后吸尽，加入无血清的DMEM1mL，放入-70℃冰箱，反复冻融三次，提DNA，用于荧光定量PCR的测定。结果如图3中的C所示，发现EGCG降低猪伪狂犬病毒核酸拷贝数，证实EGCG降低猪伪狂犬病毒的吸附和入胞。

实施例8

表没食子儿茶素没食子酸酯对猪伪狂犬病毒吸附的影响(Western blot、荧光定量PCR和TCID50实验)

(1)Western blot测定表没食子儿茶素没食子酸酯在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒吸附的影响

PK-15B6细胞消化用4％FBS的DMEM营养液稀释，以5×10⁵/孔的浓度滴加到6孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中待细胞贴壁成单层后(约17～18h)，用PBS溶液将细胞洗三遍，吸尽残留PBS后，加入用1mL无血清的DMEM稀释到相应浓度的EGCG(10μM、20μM、50μM、100μM)，与PK-15B6细胞37℃孵育1h后，用冷的PBS洗三遍，换成冷的无血清的DMEM，4℃感染猪伪狂犬病毒并有相应浓度的EGCG(10μM、20μM、50μM、100μM)存在，孵育1h后，换成2mL含有2％FBS的DMEM营养液维持，放37℃，5％CO₂培养箱中培养，感染24h后，收集细胞上清(1mL放-70℃保存为后期TCID50实验做准备)，用PBS洗三遍后吸尽残液，加入2×蛋白loading收集细胞样品，在金属浴96℃煮15min，然后进行Western blot检测。结果如图4中的A所示，发现EGCG降低猪伪狂犬病毒gE和UL42蛋白的表达，证实EGCG降低猪伪狂犬病毒的吸附。

(2)TCID50测定表没食子儿茶素没食子酸酯在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒吸附的影响

Vero细胞消化用8％FBS的DMEM营养液稀释，以2×10³/孔的浓度滴加到96孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中待细胞贴壁成单层后，用PBS洗三遍，吸尽残余液体后，加入用无血清的DMEM稀释的不同浓度的病毒液，每个浓度做8个重复，感染1.5h后，换成含2％FBS的DMEM维持，待感染72h后观察细胞病变的情况。结果如图4中的B所示，发现EGCG降低猪伪狂犬病毒感染的病毒滴度，证实EGCG降低猪伪狂犬病毒的吸附。

(3)荧光定量PCR测定表没食子儿茶素没食子酸酯在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒吸附的影响

PK-15B6细胞消化用4％FBS的DMEM营养液稀释到适当的密度，以5×10⁵/孔的浓度滴加到6孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中待细胞贴壁成单层后(约17～18h)，用PBS溶液将细胞洗三遍，吸尽残留PBS后，加入用1mL无血清的DMEM稀释到相应浓度的EGCG(10μM、20μM、50μM、100μM)，与PK-15B6细胞37℃孵育1h后，用冷的PBS洗三遍，换成冷的无血清的DMEM，4℃感染猪伪狂犬病毒并有相应浓度的EGCG(10μM、20μM、50μM、100μM)存在，孵育1h后，用用PBS洗涤后吸尽，加入800μL的PBS用细胞刮将细胞刮下，收取细胞样品(不需要反复冻融)，提取DNA，进行荧光定量PCR的测定。结果如图4中的C所示，发现EGCG降低猪伪狂犬病毒的核酸拷贝数，证实EGCG降低猪伪狂犬病毒的吸附。

实施例9

表没食子儿茶素没食子酸酯对猪伪狂犬病毒入胞的影响(Western blot、荧光定量PCR和TCID50实验)

(1)Western blot测定表没食子儿茶素没食子酸酯在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒入胞的影响

PK-15B6细胞消化用4％FBS的DMEM营养液稀释到适当的密度，以5×10⁵/孔的浓度滴加到6孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中待细胞贴壁成单层后(约17～18h)，用冷PBS溶液将细胞洗三遍，吸尽残留PBS后，加入用1mL无血清的冷DMEM并感染猪伪狂犬病毒，在4℃孵育1h后，用冷PBS细胞洗三遍并将残液吸尽，加入含2％FBS的冷DMEM 1mL并有相应浓度的EGCG(10μM、20μM、50μM、100μM)存在，在37℃孵育1h后，用柠檬酸洗三遍后再用PBS洗三遍后吸尽残液，换成2mL含有2％FBS的DMEM营养液维持，放37℃，5％CO₂培养箱中培养，感染24h后，收集细胞上清(1mL放-70℃保存为后期TCID50实验做准备)，加入2×蛋白loading收集细胞样品，在金属浴96℃煮15min，然后进行Westernblot检测。结果如图5中的A所示，发现EGCG降低猪伪狂犬病毒gE和UL42蛋白的表达，证实EGCG抑制猪伪狂犬病毒的入胞。

(2)TCID50测定表没食子儿茶素没食子酸酯在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒入胞的影响

Vero细胞消化用8％FBS的DMEM营养液稀释，以2×10³/孔的浓度滴加到96孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中待细胞贴壁成单层后，用PBS洗三遍，吸尽残余液体后，加入用无血清的DMEM稀释的不同浓度的病毒液，每个浓度做8个重复，感染1.5h后，换成含2％FBS的DMEM维持，待感染72h后观察细胞病变的情况。结果如图5中的B所示，发现EGCG降低猪伪狂犬病毒感染的病毒滴度，证实EGCG抑制猪伪狂犬病毒的入胞。

(3)荧光定量PCR测定表没食子儿茶素没食子酸酯在PK-15B6细胞上对猪伪狂犬病毒入胞的影响

PK-15B6细胞消化用4％FBS的DMEM营养液稀释，以5×10⁵/孔的浓度滴加到6孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中待细胞贴壁成单层后(约17～18h)，用冷的PBS溶液将细胞洗三遍，吸尽残留PBS后，加入用1mL无血清的冷的DMEM并感染猪伪狂犬病毒，在4℃孵育1h后，用冷的PBS细胞洗三遍并将残液吸尽，加入含2％FBS的DMEM 1mL并有相应浓度的EGCG(10μM、20μM、50μM、100μM)存在，在37℃孵育1h后，用柠檬酸洗三遍后再用PBS洗三遍后吸尽残液，加入800μL的PBS用细胞刮将细胞刮下，收取细胞样品(不需要反复冻融)，提取DNA，进行荧光定量PCR的测定。结果如图5中的C所示，发现EGCG降低猪伪狂犬病毒的核酸拷贝数，证实EGCG抑制猪伪狂犬病毒的入胞。

实施例10

表没食子儿茶素没食子酸酯对猪伪狂犬病毒复制的影响(Western blot)

PK-15B6细胞消化用4％FBS的DMEM营养液稀释，以5×10⁵/孔的浓度滴加到6孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中待细胞贴壁成单层后(约17～18h)，用PBS溶液将细胞洗三遍，吸尽残留PBS后，加入用1mL无血清的DMEM并感染猪伪狂犬病毒，置于37℃，5％CO₂培养箱中孵育1h后，用PBS细胞三遍并将残液吸尽，加入含2％FBS的DMEM2mL并有相应浓度的EGCG(10μM、20μM、50μM、100μM)存在，在感染后4h、6h收取细胞样品，然后进行Westernblot检测。结果如图6所示，发现EGCG降低猪伪狂犬病毒gE和UL42蛋白的表达，证实EGCG抑制猪伪狂犬病毒的复制。

实施例11

表没食子儿茶素-3-没食子酸酯对猪伪狂犬病毒直接杀灭作用

将PBS或EGCG(10μM、20μM、50μM、100μM)溶液与PRV 37℃孵育1h，然后接种PK-15B6细胞1h，用PBS洗三次，换成2％DMEM，24h后收集蛋白样品，用westernblot检测猪伪狂犬病毒蛋白的变化。将上述孵育的病毒做TCID50，检测猪伪狂犬病毒病毒滴度的变化。结果如图7所示，发现EGCG降低猪伪狂犬病毒感染的病毒滴度，证实EGCG可直接杀死猪伪狂犬病毒。

实施例12

表没食子儿茶素没食子酸酯在小鼠体内对猪伪狂犬病毒感染的影响

6周龄雌性小鼠分为七组：健康对照组6只(腹腔注射相应量PBS)、给药对照组6只(腹腔注射高剂量的药物)、攻毒对照组6只(腹腔注射相应量PBS)、提前4天给药组(低剂量6只，高剂量6只)、提前2天给药组(低剂量6只，高剂量6只)、攻毒后1h给药组(低剂量6只，高剂量6只)。EGCG浓度为20mg/ml,低剂量每只小鼠20mg/kg，高剂量每只小鼠40mg/kg。PRV的攻毒剂量为1X10⁴ TCID50，在攻毒前4天开始对给药组和提前4天给药组小鼠腹腔注射EGCG药物，同时其他组老鼠给予相应量的PBS，连续给药4天，4天后攻毒；提前2天给药组在攻毒前2天腹腔给药，给药2天后攻毒，攻毒后接着给2天药物；攻毒后1h给药组，攻毒1h后给药，连续给药4天。攻毒后，统计每组每天小鼠的死亡情况。结果发现攻毒组小鼠第7天时全部死亡，提前4天给药组(低剂量)和提前2天给药组(低剂量)小鼠存活4只，死亡2只，攻毒后1h给药组(低剂量)小鼠存活3只，死亡3只，健康对照组、给药对照组、提前4天给药组(高剂量)、提前2天给药组(高剂量)和攻毒后1h给药组(高剂量)小鼠全部存活(图8)。表明EGCG(40mg/kg)能对猪伪狂犬病毒感染提供完全保护，且发现EGCG(40mg/kg)对猪伪狂犬病毒感染有预防和治疗作用。

由上述实施例可知，所述表没食子儿茶酚没食子酸酯抗猪伪狂犬病毒感染效果非常显著，可以减少猪伪狂犬病毒引起的细胞病变，抑制猪伪狂犬病毒的吸附、入胞和复制，并且可直接杀死猪伪狂犬病毒，更为重要的是表没食子儿茶酚没食子酸酯可以预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的小鼠，。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 扬州大学

<120> EGCG在制备预防和/或治疗PRV感染制剂中的应用、预防和/或治疗PRV感染制剂

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

acaagttcaa ggcccacatc tac 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gtccgtgaag cggttcgtga t 21

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

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