阅读说明：本技术 葡萄籽原花青素在制备预防或治疗氟化物肾脏毒性方面药物或保健食品中的应用 (Application of grape seed procyanidin in preparation of medicine or health food for preventing or treating fluoride nephrotoxicity ) 是由 王二辉 刘永峰 翟德胜 卜勇军 席金彦 于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了葡萄籽原花青素在制备预防或治疗氟化物肾脏毒性方面药物或保健食品中的应用,更进一步地说是在制备抑制因氟化物暴露所致肾组织MDA含量增多、GSH水平下降、CAT活性和SOD活性下降的药物中的应用。以氟化钠为代表,研究了葡萄籽原花青素对因氟化钠暴露所致肾毒性的的预防和治疗作用,证明原花青素能抑制有氟化钠所致的肾毒性,作用强于维生素C有较好的效果,从而提出原花青素作为活性物质在制备因有氟化物暴露所致的肾毒性药物中的应用。本发明为原花青素发掘了新的医疗用途,开拓了一个新的应用领域,对于解决氟化物暴露引起的肾毒性提供了有意义的参考。(The invention discloses application of grape seed procyanidin in preparation of a medicine or health food for preventing or treating fluoride nephrotoxicity, and further relates to application in preparation of a medicine for inhibiting increase of MDA content of kidney tissues, reduction of GSH level, and reduction of CAT activity and SOD activity caused by fluoride exposure. The prevention and treatment effects of grape seed procyanidin on nephrotoxicity caused by sodium fluoride exposure are researched by taking sodium fluoride as a representative, and the procyanidin can inhibit the nephrotoxicity caused by the sodium fluoride and has a better effect than vitamin C, so that the application of procyanidin as an active substance in the preparation of nephrotoxicity medicaments caused by the fluoride exposure is provided. The invention explores new medical application for procyanidine, develops a new application field, and provides meaningful reference for solving nephrotoxicity caused by fluoride exposure.)

葡萄籽原花青素在制备预防或治疗氟化物肾脏毒性方面药物 或保健食品中的应用

技术领域

本发明属于葡萄籽原花青素的医药新用途技术领域，具体涉及葡萄籽原花青素在制备预防或治疗氟化物肾脏毒性方面药物或保健食品中的应用。

背景技术

地方性氟中毒是严重危害人类身体健康的一种疾病，除造成氟骨症和氟斑牙外，还引起非骨相性系统和器官的广泛损害。在我国多数省区有严重的氟中毒病区，主要存在着饮水型和燃煤型两类慢性氟中毒。据统计，我国除上海和海南外，其它29个省、自治区和直辖市均存在地方性氟中毒流行病区。总病区(县、市和旗)多达1308个，其中燃煤型氟中毒200个，受威胁人口3430万人，氟斑牙患者1801万人，氟骨症患者高达151万人；饮水型氟中毒1108个，受威胁人口8000多万人，氟癍牙患者2149万人，氟骨症患者136万人。迄今为止，氟中毒的发病机制尚未完全阐明清楚，因而对该病的防治带来较大的困难。当前，地方性氟中毒已列为我国现有地方病中的重点疾病，进一步深入研究氟中毒的发病机制及寻找早期诊断指标已提到一定的战略高度。大量动物研究实验已证实慢性氟中毒除了导致氟骨症和氟斑牙、引起骨代谢紊乱外，对其它非骨性器官(如脑、肝、肾、心等)也产生了严重的影响，特别是亚细胞结构的病理改变和多种代谢变化。因此，对非骨性器官或组织进行深入研究，利于全面探讨氟中毒性全身影响的发生机制。本研究对于明确氟化钠对肾损伤的效应、寻找敏感的诊断指标及进一步防治地方性氟中毒具有重要的指导意义。

原花青素(Procyanidins，分子式C₃₀H₂₆O₁₂)是一种有着特殊分子结构的生物类黄酮。一般为红棕色粉末，气微、味涩，溶于水和大多有机溶剂。原花青素分布广泛，存在于许多植物的皮、壳、籽、核、花、叶中，葡萄籽中原花青素含量最高，种类丰富。一般为葡萄籽提取物或法国海岸松树皮提取物。原花青素(葡萄籽提取物)是一种新型高效抗氧化剂，该类化合物具有多种生物活性，其以高效、低毒、高生物利用度和强抗氧化能力而著称，是目前国际上公认的清除人体自由基最有效的抗氧化剂。实验证明，原花青素的抗自由基氧化能力是维生素E的50倍，维生素C的20倍，并吸收迅速完全，口服20分钟即可达到最高血液浓度，代谢半衰期达7小时之久。研究表明原花青素具有改善血液循环、保护视力、消除水肿、减肥降低胆固醇及抗病毒等多种功效。

如公开号为CN102600127A的专利文献公开了原花青素或含其的植物提取物在制备预防或治疗脂质代谢紊乱性疾病的药物或保健食品中的应用。公开号为CN102940624A的专利文献公开了中药肉桂水提物中的原花青素在制备治疗糖尿病药物中的应用，研究发现肉桂原花青素能够以抗胰岛淀粉样多肽聚集为靶点，在制备治疗2型糖尿病药物中具有极大的应用价值。公告号为CN1745747B的专利文献公开了一种原花青素在制备治疗结肠炎药物的用途，尤其公开了原花青素在制备治疗溃疡性结肠炎药物的用途。公开号为CN107213147A的专利文献公开了原花青素在预防和治疗黄病毒感染方面的应用，尤其是其抗寨卡病毒方面的作用。

近年来大量发现给予抗氧化剂如原花青素干预可对化学物质和药物氧化损伤损伤具有保护作用。研究发现原花青素对氟、镍、镉等重金属以及氨基脲、玉米赤霉烯酮、三氧化二砷、顺铂和反式脂肪酸等所致的睾丸氧化损伤损伤均具有一定保护作用。此外，有研究报道了原花青素对氟化钠所致的肝脏氧化损伤也具有很强的保护作用，其对氟化钠所致的肾脏损伤是否有保护作用未见报道。

本研究已经证实氧化应激以及由此诱发的肾脏细胞过度凋亡是氟化钠肾脏损伤的重要机制。目前，对于原花青素用途的研究开展较为深入，但对原花青素保护氟化物肾脏毒性的功效尚未有专利文献报道。本发明开拓了原花青素一个新的应用领域，对于缓解高氟地区和氟化物接触人员肾脏毒性提供了参考。本发明将为开发用于治疗或预防氟化物肾脏毒性的功能食品和药品提供一定的科学依据。

发明内容

本发明的目的是提供了葡萄籽原花青素在制备预防或治疗氟化物肾脏毒性方面药物或保健食品中的应用，进一步拓展了原花青素的应用领域。

本发明为实现上述目的采用如下技术方案，葡萄籽原花青素在制备预防或治疗氟化物肾脏毒性方面药物或保健食品中的应用。

进一步限定，所述葡萄籽原花青素在制备抑制因氟化物暴露所致肾组织MDA含量增多、GSH水平下降、CAT活性和SOD活性下降药物中的应用，其中氟化物为氟化钠。

本发明所述的预防或治疗氟化物肾脏毒性的药物可为任何适用的常规剂型，其中所含葡萄籽原花青素的用量在有效量以上，可根据具体情况选择，一般为50～500mg/kg/天，优选为100～300mg/kg/天。

本发明通过大鼠实验证明：葡萄籽原花青素对氟化钠喂养大鼠肾脏毒性具有明显的降低作用，改善肾脏氧化应激损伤，保护肾脏结构，减少肾脏细胞的过度凋亡，保护肾脏结构和功能。

本发明具有以下有益效果：1、本发明为葡萄籽原花青素发掘了新的医药用途，开拓了花青素一个新的应用领域；本发明通过动物实验发现葡萄籽原花青素对治疗氟化物肾脏毒性所需的浓度较低，无毒副作用。

本发明以氟化钠为代表，研究了葡萄籽原花青素对因氟化钠暴露所致肾毒性的的预防和治疗作用，证明原花青素能抑制有氟化钠所致的肾毒性，作用强于维生素C有较好的效果，从而提出原花青素作为活性物质在制备因有氟化物暴露所致的肾毒性药物中的应用。

本发明为原花青素发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域，对于解决氟化物暴露引起的肾毒性提供了有意义的参考。

附图说明

图1是实施例1中各试验组大鼠肾脏组织病理学改变情况；

图2是各实验组大鼠肾脏细胞凋亡情况；

图3是各实验组大鼠肾脏肾脏Bax和Bcl-2蛋白表达水平(*p<0.05，**p<0.01与HFD相比)。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

原花青素减轻氟化钠所致肾脏毒性

1材料与方法

1.1材料

葡萄籽原花青素(天津尖峰天然产物研究开发有限公司，纯度≥95％)。

1.2实验动物及分组

SPF级SD大鼠，体重200-250g，雄性，饲养与SPF级饲养环境中，室内温度控制在23±2℃，自由饮食和摄水。动物总数32只。实验对照组(control)：给予5wt％DMSO灌胃7天后，正常饲养。氟化钠暴露组(model)：给予5wt％DMSO灌胃7天后，将饮用水换成含氟化钠(600ppm)的高氟水并继续干预21天。GSPE组(GSPE)：给予100mg/kg GSPE灌胃7天后，将饮用水换成含氟化钠(600ppm)的高氟水并继续干预21天。维生素C组(Vitmin C)：给予100mg/kg维生素C灌胃7天后，将饮用水换成含氟化钠(600ppm)的高氟水并继续干预21天。上述各组动物8只，每日一次灌胃给药，连续28天。脏器系数：大鼠处死前测定体重，5wt％戊巴比妥钠按1mg/kg剂量腹腔注射麻醉，实施安乐死。按相关标准操作规程操作，摘除肾，仔细剔除无关组织，用D-Hanks液洗涤2～3次，洗去血液，沥干水分称量，-80℃保存备用。

1.3肾脏氧化损伤

取肾脏组织加入适量的冰PBS，在冰浴条件下用玻璃匀浆器研磨制成肾脏组织匀浆，然后在低温(4℃)条件下以10000rpm，离心10min，静置片刻，取上清液，参照试剂盒说明书，检测睾丸匀浆液中MDA、GSH含量及SOD和CAT活力。

1.4肾脏病理学

各组动物经上述处理后，取睾丸等相关脏器称重；经4wt％甲醛固定后，常规石蜡包埋，制作病理切片，HE染色后，于显微镜下观察肾脏的组织结构。

1.5肾脏细胞凋亡水平

TUNEL检测细胞凋亡：按照TUNEL试剂盒说明进行操作。光学显微镜下细胞核中有棕黄色颗粒者为凋亡细胞。凋亡指数(AI)计算：每张切片选取5个视野(×200)，计数500个细胞，AI＝凋亡细胞数/500×100％。

1.6Western blot检测肾脏Bax和Bcl-2蛋白表达水平

1.6.1组织总蛋白提取与蛋白定量

将约40mg肝组织或肾组织置于1～2mL匀聚器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎；加400μL RIPA裂解液(每1mL裂解液中含10μL PMSF)于匀浆器中，进行匀浆，然后置于冰上。几分钟后重复匀浆，使组织尽量碾碎，置于冰上裂解30min后，用移液器将裂解液移至1.5mL Eppendorf管中，4℃，12000rpm离心5min，取部分上清分装至200μL的Eppendorf管中，按照BCA试剂盒的说明书测定总蛋白浓度。其余的加入5×loading buffer，沸水中煮10min，-20℃保存备用。

根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。取10μL标准品用PBS稀释至100μL(标准品一般可用PBS稀释)，使终浓度为0.5mg/mL。将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μL加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足到20μL。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，补加PBS到20μL。各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置30分钟。冷却到室温，用酶标仪测定OD值，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

1.6.2凝胶电泳与转膜

根据待测蛋白分子量的不同，配制10wt％的分离胶和4wt％的压缩胶，灌制SDS-PAGE凝胶。加入适量提前预冷的1×电泳缓冲液后，开始上样(预染蛋白Maker和样品)。80V稳压电泳约30min，待样品进入分离胶后，调整电压为120V继续电泳。待目的条带到达合适位置时(参照预染蛋白Maker的位置)，结束电泳。按照目的蛋白的大小切下相应位置的凝胶，切下的凝胶放入转膜缓冲液中，其余凝胶弃去。比照凝胶大小剪PVDF膜，置于甲醇中活化1min，随后放入转膜缓冲液中浸泡，滤纸一并放入转膜缓冲液中浸泡15min。按照PVDF膜≥凝胶≥滤纸的原则制作转膜“三明治”，确保去除气泡后开始恒压转膜。转完成后，用丽春红s染液染膜5，随后TBST清洗2次，观察膜上的蛋白。

1.6.3免疫印记与显影

将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液(5wt％脱脂奶粉TBST溶液)的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h，以封闭PVDF膜的免疫球蛋白结合位点。用TBST将膜上的残余液体洗干净，然后用封口机将膜置于自封袋中，封好三边后，加入用TBST稀释至适当浓度的一抗(Bcl2(1:500)，Bax(1:500)，尽可能排出气泡，封闭袋口，4℃过夜。剪开自封袋，用TBST洗膜3次，每次10min。然后将膜置于封闭袋中，加入适量适当浓度的二抗，封闭袋口，室温下孵育1h。剪开自封袋，用TBST洗膜3次，每次10min。等体积混合化学发光试剂A液和B液，将膜蛋白面向下与此混合液充分接触；5min后用Tanon 6600发光成像工作站进行检测，并使用Image Pro Plus 6.0软件对光密度值进行分析。

1.7统计学方法

采用SPSS 180软件进行统计学分析。计量资料实验数据均以进行表示，多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析(One Way ANOVA)进一步进行组间两两比较时，若方差齐时，采用LSD检验；若方差不齐时，采用Games-Howell检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2.实验结果

如图1所示，对照组肾脏细胞完整；模型组细胞有不同程度的部分空泡变性，细胞间界限不清。经治疗后，GSPE(100mg/kg)组和维生素(100mg/kg)组空泡减少，其中GSPE(100mg/kg)组比较显著。

如图2所示，与对照组相比，模型组肾脏组织细胞凋亡率显著上升；经治疗后，GSPE(100mg/kg)组和维生素C(100mg/kg)组细胞凋亡率显著下降。

如图3所示，与model组相比，经过GSPE(100mg/kg)和维生素C(100mg/kg)治疗后，Bcl-2水平显著上升，Bax水平显著下降。

本研究结果表明，与对照组比较，染氟组氧化损伤加剧，肾脏病理损伤加重，肾脏细胞凋亡率增加(P＜0.05)，肾脏组织促凋亡蛋白Bax上调，抑制凋亡Bcl-2下调(P＜0.05)，氟中毒可引起肾组织氧化损伤及肾脏细胞的凋亡加重，GSPE和Vitamin C对氟中毒大鼠肾脏具有抗氧化及抗细胞凋亡的作用，且GSPE效果优于Vitamin C。葡萄籽原花青素对氟化物诱导的肾脏氧化应激损伤和细胞凋亡具有较好的拮抗作用，可用于制备防治有氟化物肾脏毒性的药物或保健食品。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。