阅读说明：本技术 一种具有免疫调节活性的小球藻胞外多糖复合物及其制备方法和应用 (Chlorella extracellular polysaccharide compound with immunoregulatory activity and preparation method and application thereof ) 是由 李玉芹 雷铮宇 周蓉 唐裕芳 祝佳惠 李超 贾淑婷 于 2019-11-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种具有免疫调节活性的小球藻胞外多糖复合物及其制备方法和应用。本发明的胞外多糖复合物提取自小球藻Chlorella protothecoides CS-41发酵液,经过滤、离心、浓缩、醇沉、Sevage法除蛋白后,再通过阴离子交换层析和凝胶排阻色谱层析等分离纯化工序获得,所得多糖复合物为白色粉末,平均相对分子量为170kDa,由脂质和多糖组成,其中脂质含棕榈酸和硬脂酸,多糖由鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖组成。本发明的胞外多糖复合物组成明确,具备免疫调节作用,能显著降低炎症因子(ROS、iNOS、IL-6和TNF-α)水平,在临床及相关医疗保健领域有着广阔的应用前景。(The extracellular polysaccharide compound is extracted from Chlorella protothecoides CS-41 fermentation liquor, protein is removed through filtration, centrifugation, concentration, alcohol precipitation and Sevage methods, and then the extracellular polysaccharide compound is obtained through separation and purification procedures such as anion exchange chromatography and gel exclusion chromatography, wherein the obtained polysaccharide compound is white powder, has the average relative molecular weight of 170kDa and consists of lipid and polysaccharide, wherein the lipid contains palmitic acid and stearic acid, and the polysaccharide consists of rhamnose, xylose, mannose and glucose.)

一种具有免疫调节活性的小球藻胞外多糖复合物及其制备方 法和应用

技术领域

本发明涉及功能性保健食品或生物医药领域，具体涉及一种具有免疫调节活性的小球藻胞外多糖复合物及其制备方法和应用。

背景技术

微藻生物柴油已成为全世界公认的第三代可持续生物燃料，其开发与应用对解决目前化石燃料短缺和空气污染问题具有重要意义。但微藻能源产业至今依旧面临成本高昂的困境，尚处于起步阶段，商业化应用困难。提高藻细胞内油脂积累率、增大油脂产量是降低微藻生物柴油成本的有效解决途径之一。

国内***绕藻细胞生长和油脂积累特性，通过改变温度、光照、营养条件、盐度、金属离子等环境条件，在提高微藻细胞油脂产率的研究领域已取得较大成就，如采用指数末期-短时高温应激模式培养四尾栅藻(Scenedesmus quadricauda)能大大促进藻细胞的油脂积累，使其脂质含量和产率分别达到33.5％和23.2mg L^-1d^-1(Environ.Technol.,2016,37:2649-2657)；通过低磷环境可胁迫诱导小球藻(Chlorella sp.)油脂产率提升至15.67mg L^-1d^-1(J.Appl.Phycol.,2013,25:311-318.)；Faizal Bux等使用柠檬酸铁铵胁迫的方法分别提升镰形纤维藻(Ankistrodesmus falcatus)KJ671624的脂质含量和脂质生产率至59.6％和74.07mg L^-1d^-1(Biochem.,Eng.J.,2015,94,22-29)。尽管通过培养模式和培养条件的调控已较大幅度提高藻细胞产油效率，使其产量提升，但与石油价格相比，微藻生物柴油的价格依旧过于昂贵(Biofuels,2010,1:763-784)。实际上，微藻在生长过程中不仅会在细胞内积累油脂，还会向细胞外环境中分泌多种代谢产物，如多糖、蛋白质、脂类、色素、维生素、抑制和促进因子等。这些次级代谢产物大多具有生物活性，有较大的开发和应用前景，其中微藻多糖及其复合物不仅种类多样，还具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、降血脂、降血糖等重要生物活性，在医药、临床领域展现出巨大的应用潜能。开发利用微藻次级代谢产物、获取高价值活性物质是降低微藻柴油价格、加快微藻产业化进程的重要方式。

小球藻含有丰富的抗肿瘤活性、抗病原菌、抗病毒感染及增强免疫力的多糖及其复合物，但目前对原始小球藻(Chlorella protothecoides)多糖类物质的研究较少，仅Mario等分析了其细胞壁多糖组成(Arch.Mikrobiol.,1973,92,227-233)，乔代蓉等优化了其胞内多糖的提取工艺(Chin.J.Appl.Environ.Biol.,2014,20(4):615-620)，至今未有原始小球藻胞外多糖及其复合物应用价值的相关报道。本发明从原始小球藻(Chlorellaprotothecoides CS-41)发酵液中分离制备出一种具有免疫调节活性的多糖复合物，不仅不会影响小球藻油脂的提取制备，还能高值化利用细胞外代谢产物获取具有医疗保健前景的产品，对微藻资源的综合开发、降低微藻油脂成本具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是获取小球藻高值副产物，提供一种具有免疫调节活性的小球藻胞外多糖复合物及其制备方法，同时还提供了该免疫调节多糖的生物活性用途。

本发明的技术方案为：

具有免疫调节活性的小球藻胞外多糖复合物，其为白色粉末，平均相对分子量为170kDa，由质量百分比为16.52％的脂质和82.58％的多糖组成，其中脂质按质量百分比计的组成为棕榈酸(C16:0)39.44％，硬脂酸(C18:0)60.56％，多糖组分由鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖4种单糖组成，摩尔百分比分别为10.22％、46.19％、17.98％、25.62％。

上述的具有免疫调节活性的小球藻胞外多糖复合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将原始小球藻Chlorella protothecoides CS-41接种于固体培养基上进行复壮，再转接至液体培养基中获得一级种子液，然后继续转接至新鲜液体培养基中扩大培养获得二级种子液；

(2)将步骤(1)得到的小球藻二级种子液在新鲜的液体培养基及盐胁迫、兼养条件下继续扩大培养，得小球藻发酵液；

(3)收集步骤(2)得到的发酵液的上清液，无水乙醇醇沉并收集沉淀复溶，所得样品加入Sevage试剂除去蛋白质，透析、冷冻干燥即得到小球藻胞外粗多糖；

(4)将步骤(3)所得的小球藻胞外粗多糖用阴离子交换层析分离，以含0～1mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集目标洗脱峰，并透析冻干；

(5)将步骤(4)得到的洗脱峰用分子排阻色谱分离并收集洗脱组分，经透析再冷冻干燥后得单一组分多糖，即为具有免疫调节活性的小球藻胞外多糖，命名为CPEPS-2。

进一步地，步骤(1)中，固体培养基为Basal培养基，固体培养和一级种子液培养为兼养培养，光照强度为2000Lux，光照周期为12h光照：12h黑暗交替进行，培养温度为28℃，培养时间为5天；二级种子液培养为异养培养，接种量为5％，培养温度为28℃，培养时间为5天。

进一步地，步骤(2)中，液体培养基为Basal培养基，且盐胁迫浓度为10‰盐度，接种量为1％，光照强度为2000Lux，光照周期为8h光照：16h黑暗交替进行，培养温度为28℃，转速为160rpm，培养时间为7天。

进一步地，步骤(3)中，所述的Sevage试剂为体积比为4：1的三氯甲烷-异丙醇混合液；Sevage试剂的用量为与样品等体积，透析所采用的透析袋的截留分子量为3500Da。

进一步地，步骤(4)中，采用的阴离子交换层析柱为DEAE Sepharose Fast Flow，尺寸为2.0cm×30cm，梯度洗脱液为300mL含有不同浓度NaCl的Tris-HCl缓冲液，其pH为7.4，NaCl浓度梯度为0、0.3mol/L和0.5mol/L，收集的洗脱峰为0.5mol/L NaCl洗脱得到的组分。

进一步地，步骤(5)中，采用的分子排阻色谱为0.01mol/L NaCl溶液平衡好的Sephadex G-75，尺寸为1.0cm×50cm，洗脱液为0.01mol/L NaCl溶液。

上述的小球藻胞外多糖复合物应用于抑制炎症中。

实验结果表明，本发明的小球藻胞外多糖具有明显的抑制炎症的效果，能显著减少炎症因子ROS、iNOS、IL-6和TNF-α的产生。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明的小球藻胞外多糖复合物具有免疫调节活性，提取自小球藻上清液且为天然提取物，具有良好的安全性；

(2)本发明所得小球藻胞外多糖复合物CPEPS-2为纯品；

(3)本发明所得小球藻胞外多糖复合物具有良好的抑制炎症的效果；

(4)本发明所得小球藻胞外多糖复合物制备简单，且可联合胞内油脂提取，进一步降低微藻油脂的成本。

说明书附图

图1是本发明小球藻胞外多糖复合物的DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析图。

图2是本发明小球藻胞外多糖复合物的Sephadex G-75凝胶柱析图。

图3是本发明小球藻胞外多糖复合物的高效液相图谱。

图4是本发明小球藻胞外多糖复合物的傅里叶红外光谱图。

图5是本发明小球藻胞外多糖复合物的核磁共振氢谱图。

图6是本发明小球藻胞外多糖复合物对LPS刺激下巨噬细胞RAW264.7产生ROS的影响，图中*表示与空白对照组相比差异显著(P＜0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01)；^表示与LPS组相比差异显著(P＜0.05)，^^表示差异极显著(P＜0.01)(下同)。

图7是本发明小球藻胞外多糖复合物对LPS刺激下巨噬细胞RAW264.7内iNOS的影响。

图8是本发明小球藻胞外多糖复合物对LPS刺激下巨噬细胞RAW264.7产生IL-6的影响。

图9是本发明小球藻胞外多糖复合物对LPS刺激下巨噬细胞RAW264.7产生TNF-α的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明并不限于此。

实施例1

具有免疫调节活性的小球藻胞外多糖复合物的制备

(1)将原始小球藻Chlorella protothecoides CS-41接种于Basal固体培养基上，于28℃、2000Lux光照条件下兼养培养5天使藻种复壮；挑取复壮后的小球藻转接于普通Basal液体培养基中，2000Lux(12h光照：12h黑暗交替进行)、28℃、160rpm兼养培养5天，得到一级种子液；将5％一级种子液接种到新鲜的液体培养基中，异养培养5天后得到二级种子液；

(2)取1％二级种子液在含有10‰NaCl盐度(约2.784g/L)的Basal液体培养基中扩大培养，在光照强度为2000Lux，光照周期为8h光照：16h黑暗(光照-黑暗交替进行)的条件下28℃、160rpm兼养培养7天，得小球藻发酵液；

(3)将步骤(2)中得到的小球藻发酵液8000rpm离心15min，收集上清液；60℃减压浓缩后，加入4倍浓缩液体积的无水乙醇于4℃沉淀过夜；收集沉淀复溶后加入等体积的Sevage试剂(三氯甲烷：异丙醇＝4:1(v/v))并剧烈震荡收集上层溶液；反复5次后除去蛋白质；采用截留分子量为3500Da的透析袋在蒸馏水中4℃透析48h，期间换水5次；冷冻干燥得到小球藻胞外粗多糖；

(4)取20mg步骤(3)所得的小球藻胞外粗多糖溶于1mL Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)，上样到DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(2.0cm×30cm)中，分别用300mL含0、0.3mol/L和0.5mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，流速为2mL/min，5min/管收集，采用蒽酮-硫酸法测各管吸光度并绘制洗脱曲线(如图1所示)，收集0.5mol/L NaCl溶液的洗脱峰，透析冻干。

(5)将步骤(4)得到的洗脱峰组分于0.01mol/L的NaCl溶液溶解后，用Sephadex G-75分子排阻色谱(1.0cm×50cm)，以0.01mol/L的NaCl溶液为流动相进行洗脱，流速为1mL/min，3min/管，蒽酮-硫酸法跟踪监测各管糖浓度并绘制洗脱曲线(如图2所示)。收集洗脱组分后，蒸馏水透析(截留分子量为3500Da)再冷冻干燥后得单一组分多糖，即为本发明所述具有免疫调节活性的小球藻胞外多糖，命名为CPEPS-2。

实施例2

具有免疫调节活性的小球藻胞外多糖复合物的成分组成、纯度和分子量测定

(1)糖含量测定

分别取0、0.05mL、0.1mL、0.15mL、0.2mL和0.25mL葡萄糖标准液(100μg/mL)，并用蒸馏水补足到0.25mL，在冰浴条件下向各管加入1mL蒽酮(质量百分数为0.2％)-硫酸溶液，混匀；沸水浴10min后，迅速冰浴终止反应，再平衡至室温。通过分光光度计检测其在620nm处的吸光值，并以葡萄糖浓度为横坐标，以OD₆₂₀为纵坐标，制作标准曲线。同时取2μL小球藻胞外多糖复合物的水溶液(10mg/mL)，蒸馏水补足至0.25mL，其他步骤与上述相同，根据标准曲线，计算出糖含量。

(2)脂肪含量测定

用0.2mL浓硫酸配制系列浓度为10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL和50mg/mL的胆固醇溶液，沸水浴10min，室温冷却后加入3mL磷光体香草醛素溶液(1.2mg/L)，混匀，室温静置10min，测定OD₅₂₀值并绘制标准曲线。同时以0.2mL浓硫酸溶解10mg小球藻胞外多糖复合物CPEPS-2，按照上述方法测定样品溶液在520nm处的吸光值，并根据标准曲线计算样品中的脂肪含量。

(3)纯度和分子量

用双蒸水溶解小球藻胞外多糖复合物CPEPS-2配制成浓度10mg/mL的溶液，并用0.22μm滤膜过滤；取20μL多糖溶液上样于HPLC—SUGAR KS-804糖柱—蒸发光检测器(ELSD)系统，用双蒸水以1mL/min的流速在常温洗脱；采集洗脱图谱(如图3所示)，根据出峰情况判定样品纯度和分子量，图3显示单一狭窄对称峰，可以判定该多糖为纯品，保留时间为6.155min，根据多糖分子量标准曲线y＝-54x+502.77可知小球藻胞外多糖的分子量为170kDa。

实施例3

具有免疫调节活性的小球藻胞外多糖复合物的单糖组成和脂肪酸组成分析

(1)单糖组成

称取20mg干燥的小球藻胞外多糖CPEPS-2，加入10mL三氟乙酸(2mol/L)，110℃水解6h；将水解产物干燥后加入2mL甲醇，减压蒸干，重复3-4次，以除去三氟乙酸；然后将样品和10mg盐酸羟胺、0.6mL吡啶混合，90℃水浴反应30min；冷却后加入0.5mL乙酸酐在90℃下继续反应30min；反应产物干燥后用1mL氯仿溶解进行GC-MS分析。色谱条件：HP-5色谱柱，进样量：2μL，进样口温度：250℃，流速1mL/min；升温程序：110℃保持2min，每分钟升温5℃至220℃，保持6min。GC-MS分析结果表明：小球藻胞外多糖CPEPS-2由鼠李糖、木糖、甘露糖和葡萄糖组成，且四者的摩尔百分比为10.22：46.19：17.98：25.62。

(2)脂肪酸组成

向10mg小球藻胞外多糖复合物CPEPS-2中加入100μL十九烷酸(1g/L)-二氯甲烷溶液、2mL氢氧化钾(40g/L)-甲醇溶液，混匀后75℃水浴15min，待反应液冷却至室温后加入2mL三氟化硼(40g/L)-甲醇溶液(体积比1:1)，再于75℃水浴15min，冷却后分别加入1mL饱和氯化钠溶液和2mL正己烷，漩涡混匀后4000rpm离心8min，取1mL上清液过0.22μm滤膜后进行GC-MS分析。色谱条件：HP-5色谱柱，进样量：2μL，进样口温度：250℃，流速1mL/min；升温程序：150℃保持2min，每分钟升温8℃至250℃，保持6min。NIST08谱库自动检索脂肪酸信息，并根据峰面积计算出脂肪酸的相对含量。

表1为具有免疫调节活性的小球藻胞外多糖复合物脂肪酸组分分析的结果，小球藻胞外多糖复合物CPEPS-2中含有16.52％脂质成分，该脂质成分中含有39.44％棕榈酸(C16:0)和60.56％硬脂酸(C18:0)。

表1

实施例4

具有免疫调节活性的小球藻胞外多糖复合物的红外光谱分析

采用压片法，取2mg干燥的小球藻胞外多糖复合物CPEPS-2与KBr粉末混合，研细后，用压片机压成1mm薄片用于红外光谱分析，检测的波数范围为4000cm^-1～500cm^-1。

CPEPS-2的傅里叶红外光谱图(如图4所示)显示了多糖的特征吸收峰：O-H伸缩振动(3428.59cm^-1)、C-H的伸缩振动(2934.81cm^-1)、C＝O在COO-中的不对称振动(1619.57cm^-1，是糖的水化样品吸收峰)；波数1732.33cm^-1(C＝O振动)和1414.87cm^-1(COO-的对称拉伸振动)说明CPEPS-2是酸性多糖；1384.39cm^-1处是CH₃-对称变角振动；1254.84cm^-1处是C-O的伸缩振动，归属于糖环上的C-O-H和糖苷键C-O-C；1062.42cm^-1处是吡喃糖环的C-O-C和C-O-H单键的吸收峰，表明CPEPS-2存在吡喃糖苷形式的单糖；波数911.37cm^-1处是β-糖苷键的吸收峰，表明该多糖的键型为β-糖苷键；804.21cm^-1处是吡喃甘露糖的特征吸收峰，775.21cm^-1处是D-葡萄糖环的吸收峰，表明CPEPS-2中含有甘露糖和葡萄糖，与单糖组成的结果相符。

实施例5

具有免疫调节活性的小球藻胞外多糖复合物的核磁共振氢谱分析

取10mg干燥的小球藻胞外多糖复合物CPEPS-2溶于0.5mL重水，转置于核磁管中，以四甲基硅烷(TMS)为内标，工作频率为400MHz进行核磁共振氢谱分析。

CPEPS-2多糖的¹H-NMR结果如图5所示：δ4.5～5.5ppm区域内有5个质子信号，其中δ4.60ppm处为重氢信号，其余4个信号峰代表该多糖含有4种单糖，该结果与GC-MS的结果一致；δ5.06ppm处的信号大于5.0ppm表明存在α型糖环构型，δ4.53ppm、δ4.85ppm、和δ4.98ppm信号峰均小于5.0ppm，表明CPEPS-2中同时存在β糖环构型。

实施例6

具有免疫调节活性的小球藻胞外多糖复合物的免疫调节活性

(1)构建细胞炎症模型

将处于对数期的巨噬细胞RAW264.7重悬于含有10％(体积分数)胎牛血清的1640的基本培养基中，向6孔板中加入1×10⁴个细胞；过夜培养预贴壁后，去除旧的培养基，加入不同浓度的含药新鲜培养基；1h后向孔中加入1μg/mL的LPS(脂多糖)构建炎症细胞模型，并继续培养24h。

(2)小球藻胞外多糖复合物对炎症条件下巨噬细胞RAW264.7产生ROS的影响

用无血清培养基稀释DCFH-DA(2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐，1:1000)，使其终浓度为10μmol/L；胰酶消化收集细胞后，使之重悬于1mL已稀释好的DCFH-DA溶液中，37℃孵育20min；用无血清1640培养基充分洗涤细胞3次，去除DCFH-DA；用100μL PBS溶液(pH 7.4)重悬细胞，并加入到96孔板中；用荧光酶标仪检测各孔荧光信号强度，检测时激发波长为488nm，发射波长为525nm。图6中荧光强度表示ROS含量，结果显示LPS刺激巨噬细胞RAW264.7后，细胞内ROS含量显著上升；但是经多糖复合物CPEPS-2处理后细胞内的ROS含量呈现下降趋势，表明多糖CPEPS-2有抑制炎症因子ROS的作用。

(3)小球藻胞外多糖复合物对炎症条件下巨噬细胞RAW264.7内iNOS的影响

用胰酶消化各个孔的细胞，收集后用PBS溶液清洗细胞并重悬至100μL；反复冻溶细胞，使细胞裂解形成细胞匀浆液，按照试剂盒说明书(南京建成A014-1)检测巨噬细胞RAW264.7内iNOS含量，具体操作如下：吸取100μL细胞匀浆液，同时向其中加入试剂六(100μL)、底物缓冲液(200μL)、促进剂(10μL)、显色剂(100μL)，混匀后37℃水浴15min，利用双蒸水代替样本作为对照管；再向反应液中加入透明剂(100μL)、终止剂(2000μL)，混匀；在530nm处测定的各管吸光度值，即为细胞内iNOS含量(如图7所示)。结果显示LPS会刺激巨噬细胞RAW264.7大量合成炎症因子iNOS；多糖复合物CPEPS-2处理细胞会使得细胞内iNOS含量随着CPEPS-2剂量的上升而下降，达到抑制炎症的效果。

(4)小球藻胞外多糖复合物对炎症条件下巨噬细胞RAW264.7产生IL-6和TNF-α的影响

收集各孔细胞的上清液，3000rpm离心5min，收集上清液后按照试剂盒说明书(上海美轩生物MEXN-M0047，MEXN-M0042)分别检测巨噬细胞RAW264.7分泌的IL-6和TNF-α的含量，具体操作如下：吸取50μL上清液加入酶标板中，同时向酶标板中加入50μL不同浓度的标准品(IL-6或TNF-α)；再向各孔中加入100μL酶标试剂，37度反应30min；弃去各孔中液体，利用洗涤液清洗酶标板5次，并拍干；加入显色液A/B各50μL，避光孵育15min；加入50μL终止液，30min内用酶标仪在450nm处检测OD值。图8和图9的纵坐标分别代表巨噬细胞RAW264.7向外分泌的炎症因子IL-6和TNF-α的含量，结果表明随着多糖复合物CPEPS-2剂量的增大，细胞向上清液中分泌IL-6和TNF-α量显著减少，炎症得到抑制。