阅读说明：本技术 一种循环miR-1290的检测方法 (Detection method of circulating miR-1290 ) 是由 蔡建庭 徐丽怡 朱永良 陈肖 于 2019-09-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种循环miR-1290的检测方法,包含以下步骤：(1)从检测样本血浆或血清中提取循环miRNA；(2)茎环法逆转录：将步骤(1)中得到的miRNA进行特异性茎环法逆转录；(3)qPCR检测：以步骤(2)中所获得的cDNA为模板,进行qPCR检测。本发明成本相对较低,而灵敏度和特异性较好。可用于人和动物等相关的基础和应用研究工作。(The invention discloses a detection method of circulating miR-1290, which comprises the following steps: (1) extracting circulating miRNA from the detected sample plasma or serum; (2) reverse transcription by a stem-loop method: carrying out reverse transcription on the miRNA obtained in the step (1) by a specific stem-loop method; (3) and (3) qPCR detection: and (3) carrying out qPCR detection by using the cDNA obtained in the step (2) as a template. The invention has relatively low cost and good sensitivity and specificity. Can be used for relevant basic and application research works of human, animals and the like.)

一种循环miR-1290的检测方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种循环miR-1290的检测方法。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类长约19-23个核苷酸的非编码单链小RNA，广泛存在于各种生物体内，是一类重要的调控因子。miRNA通过与靶mRNA的互补配对，降解靶mRNA或抑制翻译，从而在转录后水平上对基因表达进行调控。miRNA具有高度保守性和严格的时空特异性，与其靶mRNA分子组成了复杂的调控网络，参与包括细胞增殖、凋亡、细胞分化、发育和逆境应答等多种生命活动。miRNA在肿瘤的发生中起重要作用。

研究表明，miRNA可以稳定地存在于血清和血浆等多种体液中，这种miRNA被称为循环miRNA，与肿瘤的发生发展密切相关，可作为肿瘤筛查、高风险人群预测及治疗效果评估的重要标志物。循环miRNA主要来源于两种途径：组织损伤或凋亡坏死细胞的被动渗漏和源自细胞的微囊泡的主动分泌。循环miRNA虽独立于细胞而存在，但是具有较高的稳定性，可能是由于RNA与DNA退火，从而既能耐受DNase又能耐受RNase降解，或者RNA被包入脂质或脂蛋白复合物内而收到保护，或者通过化学修饰或与蛋白结合而受到保护。

目前miRNA的检测方法主要有Northern blot分析、实时荧光定量PCR检测(real-time qPCR)、DNA微阵列芯片和二代测序等。Northern blot分析方法简单易行，但灵敏度低、耗时长，重复性差且需要的总RNA量较大，不适合用于循环miRNA的检测。微阵列芯片可以进行高通量的miRNA分析，但仍需足够的初始样本量，灵敏度亦不高。二代测序技术同样可以实现miRNA的高通量检测，但检测成本较高，不适于临床大样本分析。

qPCR检测通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累来实时监测整个PCR进程，进而实现对起始未知含量模板的定量和定性分析。相比于Northern blot和微阵列分析，qPCR需要的样本量较少，并且显著提高了检测范围和灵敏度。但由于miRNA非常小，需要特殊设计的引物来实现PCR检测。目前主要有两种方式：poly(A)加尾法和茎环法。poly(A)加尾法利用poly(A)聚合酶使miRNA的3’端带上一段poly(A)序列，然后利用Oligo(dT)序列引物进行逆转录。由于逆转录引物的通用性，降低了检测成本，但同时也降低了检测的灵敏性和特异性。茎环法通过茎环状引物对miRNA进行逆转录，由于该茎环状引物的5’端含有一个茎环结构，而3’端具有6个与成熟miRNA 3’端配对的特异性碱基，可以将短的成熟miRNA分子扩展并增加一个特异的3’引物位点，从而可以特异性的进行逆转录反应。

循环miRNA检测为液体活检的重要内容，对肿瘤的早期诊断、疗效评估和预后监测具有重要价值。Imaoka等研究(Annals of Oncology 27:1879–1886,2016)指出结直肠腺癌患者血清miR-1290显著升高，循环miR-1290可作为独立的预后因素。Ang Li等研究(ClinCancer Res；19(13)JμLy 1,2013)发现miR-1290在胰腺癌血清中显著升高，胰腺癌患者、慢性胰腺炎患者和胰腺神经内分泌肿瘤患者的受试者工作曲线(ROC)面积分别为0.96，0.81和0.80，循环miR-1290可作为胰腺癌早期诊断标志物。Francesca Tavano等研究(Sci Rep；8(1)Nov 6,2018)发现血浆miR-1290与CA 19-9联合检测较两者分别单独检测，具有更强的诊断和鉴别效能。因此循环miR-1290是一个潜在的肿瘤标志物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种循环miR-1290的检测方法，其是一种结合茎环法逆转录与taqman探针法实时荧光定量PCR对循环miR-1290进行定量的检测方法。

所采用的技术方案为：

一种循环miR-1290的检测方法，包含以下步骤：

(1)从检测样本血浆或血清中提取循环miRNA；

(2)茎环法逆转录：将步骤(1)中得到的miRNA进行特异性茎环法逆转录；

(3)qPCR检测：以步骤(2)中所获得的cDNA为模板，进行qPCR检测。

进一步地，步骤(1)中，提取循环miRNA是通过核酸吸附柱来实现的。

进一步地，步骤(2)中，逆转录体系包括逆转录缓冲液、逆转录酶、逆转录引物、无核酸酶纯水和miRNA模板；逆转录引物含有用于精确区分高度同源的miRNA的特异性茎环结构；针对所述miR-1290的逆转录引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；逆转录的反应条件为：16℃温浴30min，37℃温浴30min，85℃加热5min使酶失活，4℃保存。

进一步地，逆转录体系总体积为20μL，其中，逆转录缓冲液10μL、逆转录酶1.5μL、逆转录引物1μL、无核酸酶纯水稀释的miRNA模板7.5μL。

进一步地，步骤(3)中，qPCR检测的反应体系包括：Taqman预混液、特异性正向引物、通用反向引物、Taqman探针，无核酸酶纯水和cDNA模板；针对所述miR-1290的特异性正向引物、Taqman探针和通用反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQID No.10所示；qPCR检测的反应条件为：95℃预变性2.5min，95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环，最后72℃延伸10min。

进一步地，qPCR检测的反应体系总体积为10μL，其中，Taqman预混液5μL、特异性正向引物(10mM)0.2μL、通用反向引物(10mM)0.2μL、Taqman探针(10mM)0.4μL，无核酸酶纯水稀释的cDNA模板4.2μL。

进一步地，步骤(1)中，添加内参体系，内参体系包含：内参miR-16-5p和cel-miR-39以及相应的逆转录引物、qPCR正向引物和Taqman探针，

miR-16-5p的逆转录引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4，

miR-16-5p的qPCR正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，

miR-16-5p的Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，

cel-miR-39的逆转录引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，

cel-miR-39的qPCR正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，

cel-miR-39的Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；

miR-16-5p的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；

cel-miR-39的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。

进一步地，所述内参cel-miR-39是在样本提取过程中加入的体积为2μL的内参cel-miR-39溶液，浓度为0.2uM。

一种试剂盒，其是用上述任一方案所述的循环miR-1290的检测方法制备成miR-1290分析试剂盒。

一种应用，其是用上述任一方案所述的循环miR-1290的检测方法，进行血清或血浆样本的miR-1290表达水平检测，以用于基础研究和临床应用。

本发明的有益效果在于：

本发明适合于从miRNA丰度较低的生物体液样本中检测miR-1290的表达水平，成本相对较低，而灵敏度和特异性较好。根据本发明，可将本发明的检测方法制备成miR-1290分析试剂盒，用于体外检测和鉴定。

本发明的检测方法可用于人和动物等相关的基础和应用研究工作。

本发明的实施对严重危害人类健康的恶性肿瘤的发病机制研究和预防治疗等具有重要的社会和经济效益。

附图说明

图1是不同浓度miR-1290标准品的扩增曲线，从左到右的标准品浓度分别为100nM，10nM，1nM，100pM，10pM和1pM。图1中，RFU:相对荧光单位；Cycles:循环数；Amplification扩增曲线。

图2是miR-1290标准品的标准曲线。

图3是同一患者血清样本与血浆样本间miR-1290表达水平的比较。编号N188，N189，N191，N192，N197，T45和G112分别为不同的患者。

图4是miR-1290在不同临床样本中的相对表达水平。

具体实施方式

下面进一步详细阐述本发明，旨在进一步了解本发明，但本发明的保护范围并不局限于此。

本发明的循环miR-1290的检测方法，主要包含以下三个步骤：

(1)从检测样本血浆或血清中提取循环miRNA；

(2)茎环法逆转录：将步骤(1)中得到的miRNA进行特异性茎环法逆转录；

(3)qPCR检测：以步骤(2)中所获得的cDNA为模板，进行qPCR检测。

在步骤(1)中：

1.样本为血清或者血浆；可优选样本为血清。

2.可以选择合适的内参

选择miR-16-5p作为一个内参，同时在提取核酸的过程中外源性添加cel-miR-39作为另一个内参。miR-16-5p的序列见SEQ ID No.12，cel-miR-39序列见SEQ ID No.13。

内参cel-miR-39溶液由锐博生物合成，配制浓度为20um，使用浓度为10nM。

在步骤(2)中：

3.设计特异性茎环状逆转录引物

选择合适的茎环序列，在末端加上与成熟miRNA序列3’端配对的特异性碱基，从而形成5’端含有一个茎环结构，而3’端具有与成熟miRNA序列互补配对的特异性碱基的逆转录引物，从而将短的成熟miRNA分子扩展并增加特异的引物及探针结合位点。各miRNA的逆转录引物分别为SEQ ID No.1，SEQ ID No.4和SEQ ID No.7。

所用引物由生工生物工程(上海)公司合成。

4.设计特异性qPCR引物及Taqman探针

根据miR-1290、miR-16-5p和cel-miR-39序列及茎环序列信息，设计特异性上游引物，保证Tm值尽可能相近(约59℃)。同时设计特异性Taqman探针，5’端的修饰基团为6-FAM，3’端的修饰基团为TAMRA-N。

所用探针由生工生物工程(上海)公司合成。

5.逆转录

本发明采用生工生物工程(上海)公司的miRNA第一链cDNA合成试剂盒(NO：B532453)进行逆转录。反应体系包括：10μL的2×miRNA L-RT Solution mix，1.5μL的miRNA-L-RT Enzyme mix，1.0μL的逆转录引物(10uM)和7.5μL的模板，共20μL。反应条件为16℃温浴30min，37℃温浴30min，85℃加热5min使酶失活，4℃保存。

在步骤(3)中：

6.qPCR反应及反应条件优化

本发明在茎环法逆转录的基础上，采用通用PCR下游引物，从而减少了实验成本。在PCR过程中使用常规的Taqman预混液(包含缓冲液，dNTPs Mix，普通Taq酶和MgCl₂溶液)，也增加了试剂的可选择性。本发明技术具有特异性强、敏感性高、成本低、操作相对简单等优点。

综上，本发明采用生工生物工程(上海)公司的Taq PCR预混液进行qPCR反应。通过对反应体系和反应条件进行优化，最终确定最佳反应体系为：5μL的Taq qPCR mix，0.2μL特异性上游引物(10uM)，0.2μL的通用性下游引物(10uM)，0.4μL的特异性探针(10uM)和4.2μL的cDNA模板，共10μL。反应条件为95℃预变性2.5min，95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环，最后72℃延伸10min，其中退火温度在50-60℃范围均可。

下面再通过具体实施例来进一步阐述发明。在阐述实施例之前，对于各个实施例所用到的样本来源先统一说明如下：

本发明主要样本来源如下：

外周血液样本来源于浙江大学医学院附属第二医院。血清/血浆收集流程为：采血于含有促凝剂的采血管中，3000rpm，4℃，离心10min，取上清(即为血清)保存。采血于含有EDTA抗凝管的采血管中，3000rpm，4℃，离心10min，取上清于1.5ml离心管中；再次于16000g，4℃，离心10min，取上清(即为血浆)保存。血清/血浆样本分装并保存于-80℃。

实施例1：以miR-16-5p和cel-miR-39为内参，检测血清/血浆样本中miR-1290的表达水平

1.从血清/血浆中提取miRNA

用QIAGEN公司的miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit(ID：217204)提取血清/血浆中miRNA，其操作方法参照该试剂盒说明书，并进行一定的优化。

(1)取200μL血清/血浆样本于1.5ml离心管中，加入60μL Buffer RPL，涡旋混匀10s，室温静置3min；(2)向各离心管中加入20μL Buffer RPP，涡旋混匀30s，室温静置3min；(3)12000×g，室温离心3min；(4)吸取上清至新的1.5ml离心管中，加入等量的异丙醇(约230μL)，混匀；(5)将上述溶液加至吸附柱中，12000×g，室温离心15s，重复过柱1次，倒掉收集管中的液体；(6)依次向吸附柱中加入700μL Buffer RWT和500μL Buffer RPE，12000×g，室温离心15s，倒掉收集管中的液体；(7)向吸附柱中加入500μL80％乙醇，12000×g，室温离心2min；(8)更换新的收集管，最大转速开盖离心5min；(9)更换1.5ml离心管作为收集管，向各吸附膜中央加入20μL DEPC处理水，室温静置2min；(10)最大转速离心1min，收集RNA溶液。

然后选择miR-16-5p作为一个内参，同时在步骤(1)-(10)提取核酸的过程中外源性添加cel-miR-39作为另一个内参。内参体系包含：内参miR-16-5p和cel-miR-39以及相应的逆转录引物、qPCR正向引物和Taqman探针。

miR-16-5p的序列见SEQ ID No.12，cel-miR-39序列见SEQ ID No.13。

miR-16-5p的逆转录引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4，

miR-16-5p的qPCR正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，

miR-16-5p的Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，

cel-miR-39的逆转录引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，

cel-miR-39的qPCR正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，

cel-miR-39的Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

内参cel-miR-39溶液由锐博生物合成，配制浓度为20um，使用浓度为10nM。

2.设计特异性茎环状逆转录引物

选择合适的茎环序列，在末端加上与成熟miRNA序列3’端配对的特异性碱基，从而形成5’端含有一个茎环结构，而3’端具有与成熟miRNA序列互补配对的特异性碱基的逆转录引物，从而将短的成熟miRNA分子扩展并增加特异的引物及探针结合位点。各miRNA的逆转录引物分别为SEQ ID No.1，SEQ ID No.4和SEQ ID No.7。

所用引物由生工生物工程(上海)公司合成。

3.设计特异性qPCR引物及Taqman探针

根据miR-1290、miR-16-5p和cel-miR-39序列及茎环序列信息，设计特异性上游引物，保证Tm值尽可能相近(约59℃)。同时设计特异性Taqman探针，5’端的修饰基团为6-FAM，3’端的修饰基团为TAMRA-N。

所用探针由生工生物工程(上海)公司合成。

4.逆转录

用生工生物工程(上海)公司的miRNA第一链cDNA合成试剂盒(NO：B532453)进行逆转录。按说明书(下表1)配制逆转录体系(20μL)，miR-1290、miR-16-5p和cel-miR-39分别进行逆转录。逆转录条件：16℃温浴30min，37℃温浴30min，85℃加热5min使酶失活，4℃保存。

表1

组分	含量
		2×miRNA L-RT Solution mix	10μL
miRNA-L-RT Enzyme mix	1.5μL
		逆转录引物(10uM)	1.0μL
miRNA模板	7.5μL

5.qPCR检测

用生工生物工程(上海)公司的Taq PCR预混液(NO：B110006)进行qPCR反应。将上述逆转录产物稀释至合适浓度，按照说明书(下表2)配制反应体系(10μL)，每个样本设置3个复孔。以miR-16-5p和cel-miR-39为内参进行qPCR反应，PCR运行仪器为Bio-Rad CFX96，反应条件：95℃预变性2.5min，95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环，最后72℃延伸10min。

表2

针对miR-1290的特异性正向引物、Taqman探针和通用反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.10所示。

6.数据分析与结果

以miR-16-5p和cel-miR-39为内参，计算△Ct值，分析样本中miRNAs的表达水平。本实施例中相对表达量用2△△Ct计算，数据分析使用GraphPad Prism7软件，检测方法为Student’s tset，最终结果用平均数±SD(标准差)表示。

2^△△Ct值中，△Ct＝Ct(miR-1290)-Ct(miR-16-5p、cel-miR-39)；

△△Ct＝△Ct(待测样本)-△Ct(正常对照)

实施例2：miR-1290的定量扩增检测

1.miR-1290标准品的配制与稀释

miR-1290标准品(miDETECTTM miRNA qRT-PCR Standard RNA)由锐博生物合成，序列为SEQ ID No.11。标准品总量为1nmol，加水配制成终浓度为10um的标准品miRNA，分装保存于-80℃。同时取样依次进行梯度稀释，分别配制浓度为100nM，10nM，1nM，100pM，10pM和1pM的标准品。

2.标准曲线的绘制与miR-1290的定量检测

同上述实施例1中步骤，抽提血清miRNA并进行逆转录。在qPCR检测时，同时检测上述7个标准品。根据标准品的浓度及Ct值绘制标准曲线，根据标准曲线计算待测样本中miR-1290的表达水平。miR-1290标准品的扩增曲线及标准曲线见图1和图2。

实施例3：方法学评价(回收试验)

1.标准品的添加

同上述实施例1中步骤，在加入60μL Buffer RPL，涡旋混匀10s且室温静置3min后，分别向血清样本中加入高、中、低浓度miR-1290标准品(1204000000拷贝数、120400000拷贝数和12040000拷贝数)。

2.miR-1290表达水平的检测与回收率计算

同前步骤提取血清中miRNA，逆转录后进行qPCR定量检测。根据标准曲线计算各组样本中miR-1290拷贝数。回收率结果见表5。

表3添加高、中、低浓度标准品的各组样本回收率

样品	添加的标准品拷贝数	回收得拷贝数	回收率
				对照组	0	58479603.74	—
样本+低浓度标准品	1204000000	1115751731	0.878132996
				样本+中浓度标准品	120400000	198074269.5	1.159424134
样本+高浓度标准品	12040000	70998961.56	1.039813772

实施例4：血清样本与血浆样本的对比检测

1.收集样本

同时收集同一患者的血清和血浆样本，同前步骤进行离心，分别收集血清和血浆，分装保存于-80℃。

2.样本中miR-1290的检测

同实施例1的步骤提取血清及血浆样本中的miRNA，逆转录后进行qPCR检测。对比分析血清和血浆样本间miR-1290的表达水平差异(结果见图3)。结果表明血清和血浆样本均可用于miR-1290的qPCR检测，但血清中miR-1290的检测Ct值显著低于血浆，说明miR-1290在血清中的表达量高于血浆。

实施例5：临床样本检测

1.收集样本

收集10例胰腺癌，10例胃癌(所有肿瘤患者均经资深病理医生的病理诊断，之前未患其他肿瘤，且未经过化疗或放疗)和50例健康人(正常对照，均未无肿瘤良性患者)。空腹采集新鲜促凝血5ml，3000rpm，4℃离心10min，收集上层血清，-80℃保存。

2.血清中miR-1290表达水平的检测

参照实施例1中步骤，提取血清中的miRNA，逆转录后进行以cel-miR-39为内参进行qPCR检测。对比分析不同临床样本间miR-1290的表达水平差异(结果见图4)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种主要实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种循环miR-1290的检测方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactccctg 50

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccgcgtgga tttttggatc a 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcactggat acgactccct 20

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccgccaa 50

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcgcgtagca gcacgtaaat a 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgcactggat acgaccgcc 19

<210> 7

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccaagct ga 52

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggcgtcaccg ggtgtaaa 18

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cagcttggtc gtatccagtg cg 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 11

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

uggauuuuug gaucaggga 19

<210> 12

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

uagcagcacg uaaauauugg cg 22

<210> 13

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ucaccgggug uaaaucagcu ug 22