一种双标记报告荧光多重病原体核酸检测方法

文档序号：1595783 发布日期：2020-01-07 浏览：17次 >En<

阅读说明：本技术 一种双标记报告荧光多重病原体核酸检测方法 (Double-label report fluorescent multiple pathogen nucleic acid detection method ) 是由张誌李禹� 王月华于 2019-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种双标记报告荧光多重病原体核酸检测方法,本发明在现有技术的基础上设计出包括两种荧光基团,以及一种或两种淬灭荧光基团标记的探针,并使用该探针检测核酸,所述被检测核酸选自病原体,本发明所述探针包括两种荧光基团,称为双标记的报告荧光,所述报告荧光选自FAM、HEX/VIC/HEX/、TAMRA、Cy3、Cy5、CY5.5、Texax、ROX,本发明所述探针包括淬灭荧光,选自BHQ1、BHQ2与BHQ3。(The invention relates to a double-label report fluorescent multiple pathogen nucleic acid detection method, which designs a probe comprising two fluorescent groups and one or two quenching fluorescent group labels on the basis of the prior art, and uses the probe to detect nucleic acid, wherein the detected nucleic acid is selected from pathogens, the probe comprises two fluorescent groups, namely double-label report fluorescence, the report fluorescence is selected from FAM, HEX/VIC/HEX/, TAMRA, Cy3, Cy5, CY5.5, Texax and ROX, and the probe comprises quenching fluorescence and is selected from BHQ1, BHQ2 and BHQ 3.)

技术领域：

本发明涉及核酸的检测，特别涉及病毒、细菌等病原体核酸的检测，本发明进一步涉及一种双标记报告荧光多重病原体核酸检测方法。

背景技术：

核酸检测，即核酸扩增检测技术泛指以扩增DNA或RNA为手段，从而筛查特定基因的检测技术，如聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、转录依赖的扩增反应(TMA)等。核酸检测试剂是基于核酸扩增检测技术的体外诊断试剂，目前已经用于病原体检测、特定疾病的早期诊断和体内物质的型别鉴定等。

已有的多病原核酸检测技术主要是基于扩增片段大小通过琼脂糖凝胶电泳检测或者基于荧光PCR原理单荧光标记技术检测的多重PCR技术。基于扩增片段大小通过琼脂糖凝胶电泳检测的多重PCR技术耗时，容易造成污染；基于荧光PCR原理单荧光标记技术同一反应管中最多检测4种病原，如果检测5种以上多病原需要配制多管反应液，浪费时间、试剂与模板。

本发明主要是为了解决检测多病原需要配几个反应液或需要电泳检测而造成的耗时耗力并容易产生交叉污染的问题。

本发明涉及核酸扩增，具体是一种基于双荧光探针标记判断一种病原的多重PCR方法及其应用。本发明基于荧光PCR技术原理，通过每个病原由双标记报告荧光判读结果而开发的一系列多病原核酸检测方法。

发明内容

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂。如，卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羧基和羰基化合物均为常见的荧光熄灭剂。

本发明在于，在现有技术的基础上设计出包括两种荧光基团，以及一种或两种淬灭荧光基团标记的探针，并使用该探针检测核酸。

所述被检测核酸选自病原体，如常见的人与动物传染病如呼吸道病原体、发热伴出疹病原体、感染性腹泻及食源重要病原体、虫媒传染病、人畜共患病原体、肝炎病毒、烈性传染病病原体等。

所述病原体优选包括呼吸道病原体，如：(甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒、腺病毒、偏肺病毒、博卡病毒、冠状病毒、鼻病毒、肠道病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌、流行性脑膜炎双球菌、军团菌、百日咳、副百日咳、结核分枝杆菌等病毒细菌及其亚型)。发热伴出疹病原体(肠道病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、疱疹病毒、伤寒副伤寒、细小病毒、巨细胞病毒、立克次体等病毒细菌及亚型)、感染性腹泻及食源重要病原体(诺如病毒、札如病毒、轮状病毒、星状病毒、霍乱弧菌、致泻性大肠埃希菌、副溶血弧菌、弯曲曲、志贺氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、假单胞菌等病毒细菌及其亚型)、虫媒传染病(布尼亚病毒、登革热病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、寨卡病毒、基孔肯雅热病毒、疟原虫等病毒细菌及其亚型)、人畜共患病原体、肝炎病毒(甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒等)、动物传染病原体(***、猪瘟、伪狂犬、乙脑、猪细小、布鲁菌病、链球菌病、附红体病、猪肺疫、猪副伤寒、猪大肠杆菌病、狂犬病、蓝耳病、猪流感、猪痢疾、猪丹毒、猪喘气病、猪痘等)。

优选的，本发明所述核酸，为流感病毒，优选甲型流感病毒(FLUA)，H1N1亚型流感病毒，H3N2亚型流感病毒，乙型流感病毒(FLUB)，BV亚型流感病毒，BY亚型流感病毒。

本发明提供一种标记的探针，本发明所述探针，其中包括两种荧光基团，称为双标记的报告荧光，所述报告荧光选自FAM、HEX/VIC/HEX/、TAMRA、Cy3、Cy5、CY5.5、Texax、ROX，

本发明所述探针，其中包括淬灭荧光，选自BHQ1、BHQ2与BHQ3。

本发明每个报告荧光可以是FAM、HEX/VIC/Joe、Cy3、Cy5、CY5.5、Texax、ROX任意两个标记的组合。

本发明所述探针是任意一种用于检测本发明上述所述核酸的探针。

本发明进一步提供，使用本方所述双标记的报告荧光的探针检测核酸的方法，所述的方法包括以下步骤：

步骤1，样本提取

病原样本类型包括拭子类、病毒培养物、细菌、真菌、组织、血浆、血清、全血、干血斑、粪便、环境样本等。

提取试剂可以用商品化试剂盒进行核酸提取，其方法可以是硅胶膜或磁珠法，其中以北京金豪制药股份有限公司生产的“通用型核酸快速提取试剂”，步骤如下：

1)取30μl拭子类临床样本，加入50μl核酸提取液中，混匀，90℃裂解4min。

2)干血斑样本，打6mm斑，加1ml去红细胞裂解液，室温放置3min，8000rpm离心3min，加入50μl核酸提取液，混匀，90℃裂解4min。

3)全血样本，建议取1－5*10⁶白细胞，加入50μl核酸提取液，混匀，90℃裂解4min。

4)尿液样本建议取100μl尿液样本，8000rpm离心，去上清，沉淀加入50μl核酸提取液，混匀，90℃裂解4min。

5)粪便样本建议水样便采取200μl，成形便采取黄豆大小的粪量，加入900μlPBS，100μl氯仿，漩涡震荡5-10分钟，12000rpm离心2min，转移上清至另一干净、无核酸酶的EP管中。取30μl上清入50μl核酸提取液，90℃裂解4min。

6)污染严重的水源样本，建议5000rpm离心1-2min，转移上清30μl至50μl核酸提取液中，混匀，90℃裂解4min。

7)细菌真菌培养液10μl，或用牙签挑一菌斑至50μl核酸提取液中，混匀，90℃裂解4min。

8)取出加样管，瞬时离心，上清即是提取的核酸。

步骤2，PCR

1)根据病原的保守与特异区设计引物与探针，探针可以是同一条序列两种报告集团标记也可以是不同序列两种标报告集团标记。

并交专业的公司合成。

2)根据合成公司的报告单，将引物与探针稀释成10-100mM。

3)进行PCR反应的调配：调配PCR缓冲液、酶、Mg2⁺、dNTPs与引物探针的量。

PCR缓冲液终浓度：1×

Taq聚合酶终浓度:0.1-1U/μl

RT逆转录酶终浓度：1-10U/μl

Mg2⁺终浓度：1-5mM

dNTPs终浓度：0.1-0.8mM

引物与探针终浓度：50-500nM

4)PCR总体系可以是20μl-100μl

步骤3，荧光检测

扩增条件

针对RNA病原可以是表1或表2程序

表1荧光PCR扩增程序1

表2荧光PCR扩增程序2

针对DNA病原扩增程序如下：

表3 DNA病原扩增程序

步骤4，定性计算

定性判断值见表4与表5

表4针对RNA病原阳性判断值

表5针对DNA病原阳性判断值

本发明进一步包括试剂盒，所述试剂盒含有本发明所述标记的探针及其相关的试剂。

本发明的试剂盒包括以下成分，例如：

1)反应液

2)酶混合液

3)阳性对照

4)阴性对照

本发明的试剂盒中，主要试剂的制备方法如下：

反应液：包括PCR缓冲液终浓度、dNTPs、Mg²⁺、检测病原的引物与探针和无核酸酶水。具体配制步骤如下：

在一无核酸酶的容器中，依次加入PCR缓冲液(含Mg²⁺)至终浓度为1×，加入dNTPs、引物与探针及无核酸酶水。混匀30-60min，分装。

酶混合液：包括Taq聚合酶或/与RT逆转录酶及酶稀释液，按一定比例混匀。

阳性对照：有无核酸酶水稀释的人工假病毒，分装成200ul/支。

阴性对照：无核酸酶水，质检后分装。

本发明进一步包括本发明试剂盒的使用方法：

针对DNA病原检测

1)反应体系的配制：

取出试剂盒，在室温下融化并漩涡震荡60秒后(酶不需要震荡)，6000rpm离心10秒。计算需准备反应试剂人份数n(n＝样本数+2管对照)。每人份反应体系配制如下：

表6配制体系

试剂名称	加样量(μl)/每人份
		ADV反应液	19
Taq聚合酶	1
		总体积	20

计算上述试剂的各使用量，充分混匀后，离心6000rpm 10秒，按20μl的量分装到n个PCR反应管中。

2)加样：

取5μl(待测样本DNA、阴性对照、阳性对照)分别加入PCR扩增管，反应总体系为25μl。

3)扩增检测：

将加样后的PCR扩增管分别转移到全自动荧光定量PCR检测仪上进行扩增检测，全自动荧光定量PCR检测仪(RG3000、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000、STRATAGENE Mx3000p型)扩增程序：

对于ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型全自动荧光定量PCR检测仪，荧光信号设置为：Reporter Dye1：FAM、Quencher Dye1：NONE，Passive Reference：NONE。荧光PCR扩增程序如下。

4)反应程序：

(荧光信号采集)

对于RNA病原检测：

1)反应体系的配制：

表7反应体系配制

试剂名称	加样量(μl)/每人份
		反应液	18
酶混合液	2
		总体积	20

计算上述试剂的各使用量，充分混匀后，离心6000rpm 10秒，按20μl的量分装到n个PCR反应管中。

2)加样：

取5μL(待测样本RNA、阴性对照、阳性对照)分别加入PCR扩增管。

3)扩增检测：

将加样后的PCR扩增管分别转移到全自动荧光定量PCR检测仪上进行扩增检测，全自动荧光定量PCR检测仪(RG3000、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000、STRATAGENE Mx3000p型)扩增程序表8与表9的程序1与2都可以：

表8荧光PCR扩增程序1

表9荧光PCR扩增程序2

本发明的有益效果如下：

1、极大的节约了操作者的时间成本：既往的荧光PCR法检测多病原核酸需要配制一管以上的反应液，本发明只需要配制一管反应液即能检测6-15种病原。

2、节约成本：既往的荧光PCR法检测多病原核酸需要配制一管以上的反应液，因此需要酶、buffer、dNTPs等原料用量较多，本发明只需要配制一管反应液即能检测6-15种病原，能节省试剂成本。

3、避免样本污染：既往的凝胶电泳法检测多重病原核酸因需要开盖电泳等步骤，耗费时间并且容易造成实验室污染，本发明方不需要电泳，仪器上直接判读结果，节省时间同时避免造成实验室污染。

4、双荧光判断一个病原，理论上避免了实验结果的假阳性。

具体实施方式

实施例1：流感病毒核酸检测方法的建立。

流感病毒在自然界中宿主分布广泛，基因组结构复杂，基因易发生突变及重配，这使得其成为人类健康的重大威胁。根据流感病毒核蛋白和基质蛋白的不同，可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)、丁(D)4个型。截止目前，已经发现有18个亚型的HA蛋白(H1-H18)和11个亚型的NA蛋白(N1-N11)。目前人致病性甲型流感病毒主要是H1N1与H3N2，甲型流感H5N1、H5N6、H7N9与H9N2也称禽流感，属于人畜共患病。B型流感病毒与A型流感病毒一样感染人类呼吸道并可造成局部或大面积暴发流行，根据抗原性的差异分为Yamagata系(BY)和Victoria系(BV)两个系。本实施例主要是针对甲型流感、H1N1、H3N2、乙型流感、BY与BV这6个常见的病毒进行检测。

方案设计

表10流感病毒双荧光标记设计

2、引物探针由专业的生物公司合成

3、体系调配

根据商品化的buffer、酶与dNTPs的推荐量优化每个引物探针的量，以每个病毒单通道核酸检测试剂盒为对照，最终流感病毒检测体系如表11与表12所示：

表11反应体系

表12反应体系二

各病毒单通道体系配制按北京金豪制药股份有限公司相应产品说明书操作。反应程序见表13：

表13双标记流感病毒扩增程序

4、实验结果

表14双标记流感病毒扩增结果

由表5可以看出，双标记多重流感病毒核酸检测方法其敏感性与特异性都较好。

实施例2

详细描述一个具体的样本的检测方法：

例如，一例甲型流感病毒检测

样本类型为咽拭子。

核酸提取：

1)取30μl拭子类临床样本，加入50μl核酸提取液中，混匀，在震荡金属浴中90℃裂解4min。

2)取出样本管，瞬时离心。上清即是提取的核酸

反应液配制：

取出流感多重核酸检测试剂盒，在室温下融化并漩涡震荡60秒后(酶不需要震荡)，6000rpm离心10秒。计算需准备反应试剂人份数n(n＝样本数+2管对照)。每人份反应体系配制如下：

表15反应体系配制

计算上述试剂的各使用量，充分混匀后，离心6000rpm 10秒，按20μl的量分装到n个PCR反应管中。

2)加样：

取5μL(待测样本RNA、阴性对照、阳性对照)分别加入PCR扩增管。

3)扩增检测：

将加样后的PCR扩增管分别转移到全自动荧光定量PCR检测仪上进行扩增检测，全自动荧光定量PCR检测仪(RG3000、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000、STRATAGENE Mx3000p型)扩增程序表16程序，表16荧光PCR扩增程序

结果判断：

表17结果判断

实施例3

详细描述一个具体的样本的检测方法：

例如食源性致病菌金黄色葡萄球菌检测

核酸提取：

1)取10μl菌液，加入50μl核酸提取液中，混匀，在震荡金属浴中90℃裂解4min。

取出样本管，瞬时离心。上清即是提取的核酸反应液配制：

表18反应体系配制

试剂名称	加样量(μl)/每人份	N＝4
			反应液	18	32
Taq聚合酶	2	8
			总体积	20

计算上述试剂的各使用量，充分混匀后，离心6000rpm 10秒，按20μl的量分装到n个PCR反应管中。

2)加样：

取5μL(待测样本RNA、阴性对照、阳性对照)分别加入PCR扩增管。

3)扩增检测：

4)结果判断

表19

实施例4

详细描述一种试剂盒：

流感病毒核酸多重检测试剂盒。

1、预期用途：本试剂使用双标记荧光PCR法检测呼吸道病毒的特异性靶基因，用于检测人呼吸道相关临床标本(包括鼻咽拭子、痰液等)中的人类呼吸道病毒，主要用于发热呼吸道症候群病毒病原构成的检测和监测相关研究。检测病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒及甲型H1N1、甲型H3N2、乙型流感病毒(Yamagata株和Victoria株)

2、试剂盒组成

表20试剂盒组成成分

3、适用仪器

RG3000、LightCycler480、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000、STRATAGENEMx3000p型全自动荧光PCR检测仪。

4、检验方法

1)核酸提取

﹡注意事项：

本品中的阴性对照需参与核酸提取；阳性对照不需参与核酸提取。

实验条件：实验分区进行；实验环境的温度：10-30℃、湿度：35～75％、空调气流方向控制：顶送侧回。

2)PCR扩增：

2.1实验设计

2.1.1待检样本检测：每份样本使用反应液检测，根据反应液检测结果对样本进行判定。

2.1.2对照品检测：每次试验都应设置阴性对照和阳性对照。

2.2反应体系的配制

表21配制体系

试剂名称	加样量(μl)/每人份
		反应液	18
酶混合液	2
		总体积	20

2.3加样

取5μl(待测样本、阴性对照、阳性对照)分别加入PCR扩增管，反应总体系为25μl。

2.4扩增检测

将加样后的PCR扩增管分别转移到全自动荧光定量PCR检测仪上进行扩增检测。

对于ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型全自动荧光定量PCR检测仪，荧光信号设置为：Reporter Dye1：FAM、Quencher Dye1：NONE；Reporter Dye2：HEX、Quencher Dye2：NONE；Reporter Dye3：CY5、Quencher Dye3：NONE；Reporter Dye4：ROX、Quencher Dye4：NONE；Passive Reference：NONE。荧光PCR扩增程序的设置见表1-2。反应总体积为25μl。

表22荧光PCR扩增程序1