阅读说明：本技术 基于转录组测序分析确定特定染色体上物种特异性基因的方法 (Method for determining species-specific genes on specific chromosomes based on transcriptome sequencing analysis ) 是由 王金英 党江波 温国 郭启高 梁国鲁 何桥 杨垚 于 2019-09-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于转录组测序分析确定特定染色体上物种特异性基因的方法。所述方法包括：(1)取外源染色体来源材料、异源单体附加系材料和未附加外源染色体的寄主材料进行转录组测序；(2)根据所述转录组测序结果设计PCR引物；(3)使用所述PCR引物对所述外源染色体来源材料、所述异源单体附加系材料和所述未附加外源染色体的寄主材料进行PCR验证；(4)对所述PCR验证的结果进行统计并确定染色体上物种特异基因。本发明以异源单体附加系为材料、利用转录组分析和PCR验证,不进行染色体分离和测序,相比之下过程简易,成本较低。(The invention discloses a method for determining species-specific genes on a specific chromosome based on transcriptome sequencing analysis. The method comprises the following steps: (1) taking exogenous chromosome source material, heterologous monomer additional system material and host material without exogenous chromosome to perform transcriptome sequencing; (2) designing a PCR primer according to the sequencing result of the transcriptome; (3) performing PCR validation of the exogenous chromosome source material, the heteromonomer addition line material, and the host material to which no exogenous chromosome is added, using the PCR primers; (4) and counting the PCR verification result and determining the species specific gene on the chromosome. The invention uses the heterologous monomer addition system as material, uses transcriptome analysis and PCR verification, does not carry out chromosome separation and sequencing, and has simple process and lower cost compared with the prior art.)

基于转录组测序分析确定特定染色体上物种特异性基因的 方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种基于转录组测序分析确定特定染色体上物种特异性基因的方法。

背景技术

基因在染色体上的位置影响基因的表达及其调控，这被称为基因的位置效应。因此，基因的染色体定位对染色体功能和表达模式的研究非常重要。

远缘杂交过程中，外源染色体的引入会导致大量外源基因的引入。外源基因的引入常导致寄主材料新的表型，这会导致新物种产生或新育种材料的获得。解析这些外源基因对物种进化和新种质的研究非常重要。解析这些外源基因的第一步即需对这些外源基因进行挖掘。

挖掘特定染色体上基因的方法目前主要包括：(1)染色体分离测序，获得基因序列信息；(2)利用EST标记进行连锁图谱构建，通过染色体连锁图谱获得染色体特异分子标记，进而获得染色体特异基因；(3)通过荧光原位杂交将已知基因定位至染色体上。

随着测序技术的改进和组学技术的发展，对整个基因组和转录组进行序列分析的成本已经较大程度降低，对不同材料间的差异序列进行分析也较易实现。

异源单体附加系是在某一物种中含有一条其他物种单条染色体的材料，其生长发育过程中，外源染色体上的特异序列会不同程度地表达，而在未添加该外源染色体的材料中，这些特异序列则不会表达。以异源单体附加系为材料，以未添间外源染色体的材料为对照，通过转录组分析，可筛选获得这些表达的特异序列。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种基于转录组测序分析确定特定染色体上物种特异性基因的方法。所述技术方案如下：

第一方面，基于转录组测序分析确定特定染色体上物种特异性基因的方法，所述方法包括：

(1)取外源染色体来源材料、异源单体附加系材料和未附加外源染色体的寄主材料进行转录组测序；

(2)根据所述转录组测序结果设计PCR引物；

(3)使用所述PCR引物对所述外源染色体来源材料、所述异源单体附加系材料和所述未附加外源染色体的寄主材料进行PCR验证；

(4)对所述PCR验证的结果进行统计并染色体上物种确定特异基因。

进一步的，取外源染色体来源材料、异源单体附加系材料和未附加外源染色体的寄主材料进行转录组测序，包括：

取外源染色体来源材料、异源单体附加系材料和未附加外源染色体的寄主材料分别提取总RNA；

将提取到的总RNA分别进行反转录，然后分别进行测序；

去除含adapter、ploy-N以及低质量的reads，获得clean reads；

将clean reads比对至assembled transcriptome上，获得count数，并计算FPKM(Fragments per kilobase million)值。

进一步的，所述根据所述转录组测序结果设计PCR引物，包括：

选取FPKM值在未附加外源染色体的寄主材料中表达量为0，在外源染色体来源材料、异源单体附加系材料中表达量均不为0的序列为备选序列；

利用Primer Premier 5.0.软件对上述备选序列进行引物设计，选取分数在90分以上的引物进行PCR验证。

进一步的，所述使用所述PCR引物对所述外源染色体来源材料、所述异源单体附加系材料和所述未附加外源染色体的寄主材料进行PCR验证，包括：

采用改良的CTAB法提取外源染色体来源材料、所述异源单体附加系材料和所述未附加外源染色体的寄主材料基因组总DNA；

以上述3个材料的基因组总DNA为模板，不同引物分别进行扩增；

上述3个材料的扩增产物分别采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后拍照、观察。

进一步的，所述引物进行扩增时，

扩增体系为：3.4μL 10×buffer(含有Mg²⁺15mmol/L，Takara公司)，dNTP 0.4μL(2.5mmol/L，Takara公司)，rTaq0.1μL(5U/μL，Takara公司)，1μL的DNA模板(25-50ng/μL)，正反向引物(10μmol/L)各0.5μL，ddH₂O 14.1μL，为20μL的PCR扩增体系；

反应程序：94℃预变性2.5min；30-35个循环；每个循环：94℃变性30s，53℃-60℃(依据不同引物所定)退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸10min，4℃保存备用。

进一步的，所述对所述PCR验证的结果进行统计并确定特异基因，包括：

统计电泳结果，选取在外源染色体来源材料基因组总DNA和所述异源单体附加系材料基因组总DNA中扩增出相同条带，并且在所述未附加外源染色体的寄主材料基因组总DNA中未能扩增出相应条带的引物为特异引物，所述特异引物的序列即为染色体上物种特异基因序列。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明以异源单体附加系为材料、利用转录组分析和PCR验证，不进行染色体分离和测序，相比之下过程简易，成本较低。本发明以转录组测序和分析为基础，以差异表达的基因为备选，获得的序列均为物种特异性序列，有利于特异基因的研究。由于转录组数据较多，且通过无参分析，可对没有研究基础和无参考基因组的物种的特定染色体进行分析，获得特异基因数量也较多。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例

以烟草(云烟87)-N.plumbaginifolia异源单体附加系(附加N.plumbaginifolia的9号染色体)为材料，结合转录组测序分析，PCR验证发掘N.plumbaginifolia中9号染色体上的物种特异性基因

1、转录组测序

(1)材料：云烟87、附加N.plumbaginifolia中9号染色体的云烟87异源单体附加系—TP-1和N.plumbaginifolia的幼嫩叶片，每个材料设置3个重复。

(2)总RNA提取、反转录和测序：常规方法分别提取上述三种材料幼嫩叶片中的总RNA并进行反转录，然后上机测序。

(3)质量控制：去除含adapter、ploy-N以及低质量的reads，获得clean reads。

(4)拼接：进行序列拼接，获得assembled transcriptome。

(5)比对和定量分析：将clean reads比对至assembled transcriptome上，获得count数，并计算FPKM(Fragments per kilobase million)值。

2、备选序列的获得及引物设计

(1)备选序列：选取FPKM值在云烟87的3个重复中为0、TP-1和N.plumbaginifolia的3个重复中均不为0的序列为备选序列(如表1所示)。

表1备选序列表(FPKM值)

(2)引物设计：利用Primer Premier5.0.软件对上述备选序列进行引物设计，选取分数在90分以上的引物进行PCR验证。

3、PCR验证

(1)总DNA提取：采用CTAB法提取云烟87、TP-1和N.plumbaginifolia各自的基因组总DNA。

(2)扩增：以上述3个材料的基因组总DNA为模板，不同引物进行扩增。

扩增体系为：3.4μL 10×buffer(含有Mg²⁺15mmol/L，Takara公司)，dNTP 0.4μL(2.5mmol/L，Takara公司)，rTaq0.1μL(5U/μL，Takara公司)，1μL的DNA模板(25-50ng/μL)，正反向引物(10μmol/L)各0.5μL，ddH₂O 14.1μL，为20μL的PCR扩增体系。

反应程序：94℃预变性2.5min；30-35个循环；每个循环：94℃变性30s，53℃-60℃(依据不同引物所定)退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸10min，4℃保存备用。

(3)电泳：对3种材料扩增后的扩增产物采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后拍照、观察。

4、统计：统计电泳结果，选取能在N.plumbaginifolia和TP-1基因组总DNA中扩增出相同条带，而在云烟87基因组总DNA中未能扩增出相应条带的引物为特异引物。

5、特异基因确认：特异引物所在的序列即为特异基因序列(表2)。

表2特异基因及其表达序列

本发明以异源单体附加系为材料、利用转录组分析和PCR验证，不进行染色体分离和测序，相比之下过程简易，成本较低。本发明以转录组测序和分析为基础，以差异表达的基因为备选，获得的序列均为物种特异性序列，有利于特异基因的研究。由于转录组数据较多，且通过无参分析，可对没有研究基础和无参考基因组的物种的特定染色体进行分析，获得特异基因数量也较多。

上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。