阅读说明：本技术 人类个体的年龄确定 (Age determination of human individuals ) 是由 马克·温尼菲尔德 伊丽莎白·伍尔泽 鲍里斯·克里斯托夫 拉尔斯·卡德雷利 于 2018-06-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种用于确定人类皮肤的生物学年龄的方法,所述方法包括：提供人类皮肤细胞,确定所述皮肤细胞的至少一条染色体的特定区域的至少两个CpG-二核苷酸的甲基化水平,以及通过将所述确定的甲基化水平与经验确定的数据进行比较来确定所述皮肤细胞的生物学年龄,所述经验确定的数据表示至少一个人类个体的CpG-核苷酸的甲基化水平和实足年龄之间的相关性。(The present invention relates to a method for determining the biological age of human skin, said method comprising: providing human skin cells, determining the methylation level of at least two CpG-dinucleotides of a specific region of at least one chromosome of said skin cells, and determining the biological age of said skin cells by comparing said determined methylation level with empirically determined data representing a correlation between the methylation level and chronological age of at least one human individual.)

人类个体的年龄确定

技术领域

本发明涉及通过分析DNA特定位点的表观遗传模式来确定人类皮肤的生物学年龄。评价皮肤样品的选定CpG位点处的甲基化水平来准确确定人类皮肤的生物学年龄。然后将所测量的生物学年龄与实足年龄相关联，平均绝对误差小于5.05年。

背景技术

已知随着时间会发生DNA的表观遗传变化，并已被公认为人类个体衰老过程的程度的指标。特别是，已经鉴定出CpG二核苷酸的甲基化程度与年龄有关。

通过分析各种CpG-二核苷酸来确定生物学年龄的方法是已知的。例如，在Weidner等人，Genome Biology，2014 15R24中，血液中102个年龄相关的CpG位点已被鉴定为适合评估个体的生物学年龄。所描述的方法使用了来自3个CpG位点的数据，以达到与实足年龄的平均绝对偏差小于5年。EP 2 711 431还基于所述102个所鉴定的与年龄相关的CpG位点中的6个分析了受试者的血细胞并预测实足年龄。发现基于6个CpG位点确定生物学年龄的预测与实足年龄相差约4.53年至多达10.30年。在另一项研究中，Horvath，Genome Biology，2013，14:R115，通过从血细胞表征353个CpG位点，发现实足年龄与生物学年龄之间的差异为±3.6年。

由于在血液中发现的各种细胞类型具有不同的DNA甲基化模式，因此在分析表观遗传变化中使用血样不是最佳的。此外，细菌和病毒感染可显著改变血液中的细胞组成，这可改变甲基化模式。

人类皮肤也已被用作分析与年龄相关的表观遗传变化的模型，并与个体的实足年龄关联。在Bormann等人，Aging Cell，2016，15，563至571页中，将根据Horvath，GenomeBiology 2013，14：R115的已知预测指标用在人类表皮上，发现平均绝对预测误差为14.5年。这表明已发表的预测指标低估了表皮样品的实足年龄。在Bormann等人，Aging Cell，2016，15，563至571页中，开发了利用450,000个CpG二核苷酸的甲基化的另一个预测指标，所述CpG二核苷酸通过基于阵列的途径同时分析。使用其中的方法确定的生物学年龄的误差在小于实足年龄的5.25年之内。然而，这种方法的缺点是需要分析大量的位点，耗费时间又耗费成本。

因此，希望提供改进的和/或替代的方法来确定个体的生物学年龄。优选地，希望提供一种使用减少数量的CpG位点的方法。

发明内容

本发明在所附的权利要求中限定。

根据第一方面，提供了一种用于确定人类皮肤的生物学年龄的方法，所述方法包括：

a)确定人类皮肤细胞的至少两个CpG-二核苷酸的甲基化水平；以及

b)通过将所述确定的甲基化水平与经验确定的数据进行比较来确定所述皮肤细胞的生物学年龄，所述经验确定的数据表示至少一个人类个体的所述CpG-核苷酸的甲基化水平和实足年龄之间的相关性。

根据第二方面，提供了一种测试活性剂的方法，所述方法包括根据所述第一方面的方法，还包括以下步骤：

c)使皮肤细胞与活性剂接触；

d)根据所述第一方面的方法确定步骤c)的皮肤细胞的生物学年龄；以及

e)将步骤a)和b)中确定的生物学年龄与步骤d)中确定的生物学年龄进行比较。

根据第三方面，提供了核酸分子在根据所述第一方面的方法确定人类皮肤的生物学年龄中的应用，其中所述核酸分子包含选自下列的至少一个核苷酸序列：

a)包含至少一个选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:205的序列的核苷酸序列；

b)通过置换a)的核苷酸中除所述CpG-二核苷酸外的至多10％的核苷酸、优选至多5％的核苷酸而不同于a)的核苷酸的核苷酸序列；

c)与所述核苷酸序列a)和/或b)的互补链对应的核苷酸序列。

根据第四方面，提供了一种计算机可读介质，其具有存储的计算机可执行指令，用于使计算机执行确定人类皮肤的生物学年龄的方法，所述方法包括：

a)输入人类皮肤细胞的至少两个CpG-二核苷酸的确定的甲基化水平的至少两个值；

b)将所述确定的甲基化水平值与存储数据进行比较，所述存储数据表示至少一个人类个体的所述CpG-二核苷酸的甲基化水平和实足年龄之间的相关性；以及

c)显示生物学年龄。

根据第五方面，提供了一种用于根据第一方面的方法确定人类皮肤的生物学年龄的试剂盒，其包含至少一个寡核苷酸引物，所述引物用于扩增和/或测序至少一个选自SEQID NO:1至SEQ ID NO:205的核苷酸序列中的至少两个CpG核苷酸。

本发明的某些实施方式可以提供一个或多个以下优点：

·期望的从个体收集样本的容易度；

·期望的获得生物信息数据的速度；

·期望的获得生物信息数据的容易度；

·期望的具有成本效益的数据收集；

·期望的年龄预测准确度。

关于本发明的任何具体的一个或多个陈述方面所提供的细节、示例和优选同样适用于本发明的所有方面。除非本文另有说明，或者上下文明显矛盾，否则本文所述的实施方式、示例和优选以其所有可能的变化的任何组合均被本发明包括在内。

附图说明

将参照以下附图进一步说明本发明：

图1 SEQ ID No:1至6的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图2 SEQ ID No:7至12的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图3 SEQ ID No:13至18的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图4 SEQ ID No:19至24的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图5 SEQ ID No:25至30的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图6 SEQ ID No:31至36的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图7 SEQ ID No:37至42的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图8 SEQ ID No:43至48的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图9 SEQ ID No:49至54的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图10 SEQ ID No:55至60的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图11 SEQ ID No:61至66的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图12 SEQ ID No:67至72的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图13 SEQ ID No:73至78的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图14 SEQ ID No:79至84的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图15 SEQ ID No:85至90的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图16 SEQ ID No:91至96的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图17 SEQ ID No:97至102的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图18 SEQ ID No:103至108的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图19 SEQ ID No:109至114的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图20 SEQ ID No:115至120的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图21 SEQ ID No:121至126的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图22 SEQ ID No:127至132的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图23 SEQ ID No:133至138的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图24 SEQ ID No:139至144的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图25 SEQ ID No:145至150的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图26 SEQ ID No:151至156的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图27 SEQ ID No:157至162的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图28 SEQ ID No:163至168的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图29 SEQ ID No:169至174的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图30 SEQ ID No:175至180的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图31 SEQ ID No:181至186的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图32 SEQ ID No:187至192的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图33 SEQ ID No:193至198的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图34 SEQ ID No:199至204的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图35 SEQ ID No:205的CpG位点和核苷酸序列的表格；

图36 图表示两个示例性CpG标记：cg06335867和cg13848598，随年龄的甲基化改变；

图37 图表示实足年龄与生物学年龄的相关性，利用标记cg06335867和cg13848598，使用下式：70.002+8.992*cg06335867+12.998*cg13848598。

应当理解，以下描述和对附图的参考涉及本发明的示例性实施方式，并且不应限制权利要求的范围。

具体实施方式

本发明是基于发现所选的CpG核苷酸的甲基化水平可以确定人类皮肤的生物学年龄。

年龄增长(衰老)是变老的过程。年龄可以用多种方式来看，例如实足年龄和生物学年龄。

用于本文中时，术语“实足年龄”是指自个体出生以来流逝的时间的量。本文所用的术语“个体”是指人类个体。

用于本文中时，“生物学年龄”是指个体的物理变化，例如DNA的表观遗传变化的程度。DNA的表观遗传变化的程度在皮肤样品中确定。从皮肤样品确定生物学年龄并与个体的生物学年龄相关联。本文公开的生物学年龄使用本发明的第一方面的方法确定。特别地，评估特定CpG-二核苷酸的甲基化水平作为本发明的一部分。所述甲基化水平可以，例如，通过以下方法确定：甲基化特异性PCR，亚硫酸氢盐处理的DNA的序列分析，CHIP测序(IlluminaMethylation BeadChip技术)，分子倒置探针测定，甲基-CAP测序，下一代测序，COBRA测定，甲基化特异性限制性图谱，或MassARRAY测定。

在某些实施方式中，人类皮肤的生物学年龄等于个体的生物学年龄。

生物学年龄可受诸如遗传背景、疾病和生活方式等许多参数的影响。

生物学年龄可不同于实足年龄。当与实足年龄相比较时，生物学年龄可以提供个体健康的指示。如果，例如，生物学年龄低于实足年龄，则可以得出结论，在生物学水平上，衰老的迹象没有预期的显著。这可以指示该个体身体健康。或者，如果生物学年龄高于实足年龄，则可作为个体健康欠佳的迹象。

在某些实施方式中，根据本发明的方法使用的人类皮肤细胞是通过从个体采集所需的整个皮肤样品而得到的。在某些实施方式中，根据本发明的方法使用的人类皮肤细胞是通过使用体外方法培养所述皮肤细胞而得到的。

从个体采集样品可以使用抽吸起泡、钻取活检、刮取活检或在任何手术程序例如整形手术、拉皮、移植等期间进行。

皮肤样品可取自表皮或真皮。

人类皮肤细胞可以从个体采集的皮肤细胞小样品培养。所采集的人类皮肤细胞可以在容器例如皮氏培养皿内在供应必需营养素的培养基或底物中体外生长。

所使用的人类皮肤细胞可以是采集细胞和培养细胞的混合物。

在某些实施方式中，包含本发明的CpG-二核苷酸的染色体的特定区域可以是编码区或非编码区。在某些实施方式中，所述CpG二核苷酸可存在于编码区和/或非编码区。所述CpG二核苷酸可以在单个特定区域或不同的特定区域中发现。

在某些实施方式中，所述染色体的特定区域包含来自如图1至35所示的SEQ IDNO.1至SEQ ID NO.205的至少一个核苷酸序列。每个SEQ ID与本发明的CpG二核苷酸的相关性示于图1至35。

在某些实施方式中，所述第一方面的方法可以包括确定两个CpG二核苷酸的甲基化水平。确定甲基化水平的所述两个CpG二核苷酸可以在同一核苷酸序列上，例如在SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.25、SEQ IDNO.35、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.71、SEQ IDNO.77、SEQ ID NO.94 97、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.129、SEQ ID NO.151和SEQ ID NO.168上。所述两个CpG二核苷酸可以在不同的二核苷酸序列上，每个序列独立地来自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.205。

在某些实施方式中，所述第一方面的方法可以包括确定三个CpG二核苷酸的甲基化水平。在某些实施方式中，所述第一方面的方法可以包括确定四个CpG二核苷酸的甲基化水平。在某些实施方式中，所述第一方面的方法可以包括确定五个CpG二核苷酸的甲基化水平。在某些实施方式中，所述第一方面的方法可以包括确定六个CpG二核苷酸的甲基化水平。在某些实施方式中，所述第一方面的方法可以包括确定七个CpG二核苷酸的甲基化水平。在某些实施方式中，所述第一方面的方法可以包括确定八个CpG二核苷酸的甲基化水平。在某些实施方式中，所述第一方面的方法可以包括确定九个CpG二核苷酸的甲基化水平。在某些实施方式中，所述第一方面的方法可以包括确定十个CpG二核苷酸的甲基化水平。在某些实施方式中，所述第一方面的方法可以包括确定至少两个且不多于三个CpG二核苷酸的甲基化水平。在某些实施方式中，所述第一方面的方法可以包括确定至少两个且不多于四个CpG二核苷酸的甲基化水平。在某些实施方式中，所述第一方面的方法可以包括确定至少两个且不多于五个CpG二核苷酸的甲基化水平。在某些实施方式中，所述第一方面的方法可以包括确定至少两个且不多于六个CpG二核苷酸的甲基化水平。在某些实施方式中，所述第一方面的方法可以包括确定至少两个且不多于七个CpG二核苷酸的甲基化水平。在某些实施方式中，所述第一方面的方法可以包括确定至少两个且不多于八个CpG二核苷酸的甲基化水平。在某些实施方式中，所述第一方面的方法可以包括确定至少两个且不多于九个CpG二核苷酸的甲基化水平。在某些实施方式中，所述第一方面的方法可以包括确定至少两个且不多于十个CpG二核苷酸的甲基化水平。

某些实施方式涉及一种估算人类个体的实足年龄的方法，所述方法包括所述第一方面的方法。例如，一种估算人类个体实足年龄的方法包括：1)确定人类皮肤细胞的至少两个CpG-二核苷酸的甲基化水平；2)通过将所述确定的甲基化水平与经验确定的数据进行比较来确定所述皮肤细胞的生物学年龄，所述经验确定的数据表示至少一个人类个体的所述CpG-核苷酸的甲基化水平和实足年龄之间的相关性；和3)估算实足年龄。

在某些实施方式中，所述第一方面的方法还包括估算人类个体的实足年龄的步骤。使用本发明的方法，生物学年龄和实足年龄之间的相关性高，其中生物学年龄和实足年龄之差，即通过本文所描述的方法确定的平均绝对误差(MAE)，不超过约7岁，不超过约6岁，不超过约5.5岁，不超过约5岁，不超过约4.5岁，不超过约4岁，不超过约3.5岁，不超过约3岁，不超过约2岁，不超过约1.5岁，不超过约1岁，不超过约0.5岁，不超过0岁。

可以确定单个个体的生物学年龄和实足年龄之差。单个数据点与叠加在所有人的数据点上的最佳拟合线的偏差可以从约0岁至约15岁不等。例如，单个数据点与最佳拟合线的偏差将为约0岁，约1岁，约2岁，约3岁，约4岁约5岁，约6岁，约7岁，约8岁，约9岁，约10岁，约11岁，约12岁，约13岁，约14岁，约15岁。这是人类个体和人类皮肤的健康状况的指示。

在某些实施方式中，如上所述确定未知个体的生物学年龄。从该生物学年龄，通过将预计的MAE应用于所使用的CpG数据点，估算出个体的实足年龄。

在某些实施方式中，当使用确定两个CpG二核苷酸甲基化水平的方法时，生物学年龄和实足年龄之间的相关性比预计的好。通过额外确定更多CpG二核苷酸中的甲基化水平，可进一步改善生物学年龄和实足年龄之间的相关性。所述更多CpG二核苷酸例如总共三个CpG二核苷酸、或总共四个CpG二核苷酸、或总共五个CpG二核苷酸、或总共六个CpG二核苷酸、或总共七个CpG二核苷酸、或总共八个CpG二核苷酸、或总共九个CpG二核苷酸、或总共十个CpG二核苷酸。然而，要注意的是，使用两个CpG核苷酸的甲基化水平的方法所产生的结果在实践中是可广泛接受的，而考虑额外的CpG二核苷酸的甲基化水平可引起相关性的改善，然而，其中这种改善随着每个额外考虑的CpG二核苷酸而减少。

在某些实施方式中，使用生物学年龄和实足年龄来计算值h，该值指示人类个体和人类皮肤的健康。在某些实施方式中，值h根据下式(I)计算

h＝生物学年龄–实足年龄(I)

某些实施方式涉及一种评价个体健康的方法，所述方法包括所述第一方面的方法和确定所述值h。例如，一种评价个体健康的方法包括：1)确定人类皮肤细胞的至少两个CpG-二核苷酸的甲基化水平；2)通过将所述确定的甲基化水平与经验确定的数据进行比较来确定所述皮肤细胞的生物学年龄，所述经验确定的数据表示至少一个人类个体的所述CpG-核苷酸的甲基化水平和实足年龄之间的相关性；3)估算实足年龄；和4)将生物学年龄减去实足年龄来确定值h。

不希望受到理论的束缚，认为如果从式(I)获得的值h为正，则该人类个体健康欠佳。在这种情况下，较大的h数值指示人类个体的健康状况要差于较小的h数值。如果从式(I)获得的h值为负，则可以假定该个体身体健康。

如果h的值为正，则可能希望减小该值，从而改善个体的健康。h值可以通过多种手段来减小，例如运动、健康饮食、适量睡眠、喝足够的水和/或避免压力。

也可以通过将活性剂以药物和/或美容剂的形式施加到皮肤细胞上来减小h值。活性剂可以在体外或体内接触皮肤细胞。使用体外方法，将活性剂添加到皮肤细胞的培养基中。使用体内方法，可以利用局部、皮下或皮内施用使人类个体的皮肤细胞与活性剂接触。

本文所用的“活性剂”是对个体具有治疗效果和/或美容效果的任何剂。治疗效果是治疗和/或预防疾病。美容效果是改善外观，例如治疗和/或预防分子老化的迹象。分子老化的迹象是，例如，干细胞耗竭、细胞间通讯改变、基因组不稳定、端粒磨损、表观遗传改变、蛋白稳态丧失、营养感应失调、线粒体功能障碍、细胞衰老和增殖能力改变。在某些实施方式中，活性剂是美容剂。当应用于个体时，美容剂可以促进吸引力、改变外观、美化和/或清洁。美容剂也可以预防和/或治疗人类皮肤表型老化的迹象，例如皱纹形成、脸色苍白、伤口愈合能力降低、弹性和紧致度丧失。

在某些实施方式中，在使皮肤细胞与活性剂接触之前和之后确定生物学年龄。例如，确定生物学年龄，使皮肤细胞与活性剂接触，然后确定生物学年龄。比较皮肤细胞与活性剂接触之前和之后的生物学年龄。处理后生物学年龄降低表明活性剂的治疗效果和/或美容效果。皮肤细胞与活性剂接触和确定生物学年龄之间的时间可以变化。可以重复使皮肤细胞与活性剂接触和确定生物学年龄的步骤，以提供有关活性剂随时间推移对皮肤细胞的效果的信息。该方法的优点可以是鉴定活性美容和/或药物化合物和/或提取物的快速而成本有效的方式。

在某些实施方式中，本发明的方法可以具有以下一种或多种以下效果：

·从生物学年龄估算实足年龄的准确性增加；

·实足年龄和生物学年龄之间相关性的可靠性增加；

·确定生物学年龄的成本降低；

·确定生物学年龄所需的时间减少；

·确定药剂或美容剂对生物学年龄的效果的有效方法。

应该注意的是，本发明可以包括在本文中提到的特征和/或限制的任何组合，除非这样的的特征的组合相互排斥。为了说明本发明，前面的描述针对本发明的特定实施方式。然而，对本领域技术人员显而易见的是，对本文中描述的实施方式的许多修改和变化都是可能的。所有这样的修改和变化都意欲在如所附权利要求中限定的本发明范围内。

为了避免疑问，本申请涉及以下编号的段落中描述的主题。

1.一种用于确定人类皮肤的生物学年龄的方法，所述方法包括：

a)提供人类皮肤细胞；

b)确定所述皮肤细胞的至少一条染色体的特定区域的至少两个CpG-二核苷酸的甲基化水平；和

c)通过将所述确定的甲基化水平与经验确定的数据进行比较来确定所述皮肤细胞的生物学年龄，所述经验确定的数据表示至少一个人类个体的所述CpG-核苷酸的甲基化水平和实足年龄之间的相关性。

2.段落1的方法，其中所述皮肤细胞是人类个体采集。

3.段落1的方法，其中所述皮肤细胞在体外培养。

4.根据任何前述编号段落所述的方法，其中确定所述人类皮肤细胞的一条或两条染色体的特定区域的两个CpG-二核苷酸的甲基化。

5.根据前述段落中任一者所述的方法，其中所述染色体的每个特定区域包含至少一个选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:205的核苷酸序列。

6.根据任何前述段落所述的方法，其中一个或两个所述核苷酸序列选自SEQ IDNO:51和SEQ ID NO:110。

7.根据任何前述段落所述的方法，其中至少一个所述核苷酸序列选自SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203；SEQ ID NO:204；和SEQ ID NO:205。

8.前述段落中任一者的方法，其中所述数据包含至少一个线性回归方程，优选包含至少两个线性回归的一个方程。

9.根据任何前述段落所述的方法，其还包括估算人类个体的实足年龄的步骤。

10.段落9的方法，其中估算的实足年龄在生物学年龄的5.25岁以内。

11.根据任何前述段落所述的方法，其还包括计算指示人类个体健康的值h的步骤，其中h是基于生物学年龄和实足年龄计算的。

12.根据段落11所述的方法，其中h是基于生物学年龄和实足年龄之差计算的。

13.根据前述权利要求任一项所述的方法，其还包括使所述皮肤细胞与活性剂接触的步骤。

14.根据段落13所述的方法，其中在使所述皮肤细胞与活性剂接触之前和之后确定生物学年龄。

15.一种测试活性剂的方法，所述方法包括段落1至10中任一者的方法，还包括以下步骤：

d)使步骤a)的皮肤细胞与活性剂接触；

e)根据段落1至10中任一者的方法确定步骤d)的皮肤细胞的生物学年龄；以及

f)将步骤a)和c)中确定的生物学年龄与步骤e)中确定的生物学年龄进行比较。

16.段落15的方法，其中步骤d)在体内或体外进行。

17.段落15或16的方法，其中所述活性剂是美容剂和/或治疗剂。

18.段落15至段落17中任一者的方法，用于鉴定预防和/或治疗人类皮肤表型老化迹象的活性剂。

19.核酸分子在根据段落1至18中任一者的方法确定人类皮肤的生物学年龄中的应用，其中所述核酸分子包含至少一个选自以下的核苷酸序列：

d)包含至少一个选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:205的序列的核苷酸序列；

e)通过置换a)的核苷酸序列中除所述CpG-二核苷酸外的至多10％的核苷酸、优选至多5％的核苷酸而不同于a)的核苷酸序列的核苷酸序列；

f)与所述核苷酸序列a)或b)的互补链对应的核苷酸序列。

20.段落19的应用，其中选择两个核苷酸序列。

21.计算机可读介质，其具有存储的计算机可执行指令，用于使计算机执行确定人类皮肤的生物学年龄的方法，所述方法包括：

d)输入所述皮肤细胞的至少一个染色体的特定区域的至少两个且不多于10个CpG-二核苷酸的确定甲基化水平的至少两个值且不多于10个值；

e)将所述确定的甲基化水平值与存储数据进行比较，所述存储数据表示至少一个人类个体的所述CpG-二核苷酸的甲基化水平和实足年龄之间的相关性；以及

f)显示生物学年龄。

22.根据段落21所述的计算机可读介质，其中所述存储数据包含至少一个线性回归方程，优选包含至少两个线性回归的一个方程。

23.一种用于根据段落1至10中任一者的方法确定人类皮肤的生物学年龄的试剂盒，其包含至少一个寡核苷酸引物，所述引物用于扩增和/或测序至少一个选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:205的核苷酸序列中的至少两个CpG核苷酸。

实施例

皮肤样品和患者组

收集了来自DNA甲基化阵列(Illumina 450k BeadChip)的108个表皮样品(Bormann，Aging Cell 2016)的数据。为了得到年龄相关的CpG位点，计算了所述样品的实足年龄和每个CpG位点的相应β值之间的相关系数(r)。在预过滤后，选择了225个年龄相关的CpG位点(r>0.8或r<-0.8)。使用整集的225个CpG位点训练多变量线性模型。

为了找到合适的CpG组合，将完整的样本集分为训练集和测试集。单个CpG或至少两个CpG的CpG组合由其预测准确度加以选择。

图2显示了两个CpG标记：cg06335867和cg13848598，在甲基化方面的年龄依赖性变化的相关性。

皮肤样品是利用抽吸起泡从年龄在23和54岁之间的健康志愿者收集的。对于全部表皮样品，通过热分离将皮肤的表皮部分与真皮部分分开。为了分离角质形成细胞，通过分散酶II(Roche 04942078001)消化将表皮与真皮分离，并在胰蛋白酶(Life Technologies#25200056)处理后分离出角质形成细胞。

DNA分离和亚硫酸氢盐转化

使用QIAmp DNA Investigator试剂盒(Qiagen#56504)分离DNA。使用体外培养的人角质形成细胞和离体人表皮样品，用EpiTect Bisulfite试剂盒(Qiagen#59104)进行500ng DNA的亚硫酸氢盐转化。DNA按照制造商的方案转化DNA，但是其中使用的温育时间为4小时55分钟，而不是2小时55分钟。

扩增子PCR和测序

为了分析CpG，使用PCR产生扩增子。所述PCR使用亚硫酸氢盐转化的DNA和PyroMark PCR试剂盒(Qiagen#978703)进行。PCR组成示于表1。所述PCR在55℃的退火温度下进行。

表1：PCR组成

组分<sup>1</sup>	量
		亚硫酸氢盐转化的DNA	50ng，在2μl水中
Mastermix(2×)	12.5μl
		Coral加样染料	2.5μl
MgCl<sub>2</sub>(25mM)	1μl
		正向引物(10μM)	0.5μl
反向引物(10μM)	0.5μl
		水	6μl

¹MgCl₂、正向引物和反向引物作为水溶液使用。

将PCR片段在1％琼脂糖凝胶的TAE缓冲液中解开，并切出所述凝胶。使用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen#28706)纯化所述扩增子。

根据制造商的方案，使用454-测序方法(Roche)进行DNA测序。

甲基化的程度由甲基化和未甲基化读出序列的比例确定。

计算生物学年龄

为了计算生物学年龄，确定了CpG基因座处的甲基化比例，以提供β值。计算每个CpG基因座和每个样品的平均β值(β)。然后使用下式(1)将其转换为m值(m)：

m＝log2(β/1-β) (1)

然后，可以将m值用于，例如，针对cg06335867和cg13848598列出的等式(2)至(4)之一中：

生物学年龄＝70.002+8.992*m_cg06335867+12.998*m_cg13848598

(2)

生物学年龄＝68.785+7.346*m_cg06335867+15.865*m_cg13848598

(3)

生物学年龄＝60.372+6.923*m_cg06335867+12.904*m_cg13848598

(4)

可用于其他CpG-二核苷酸的等式的其他示例包括下列：

针对cg13848598和cg25015733列出的等式(5)至(7)之一：

生物学年龄＝49.9135+32.3373*m_cg13848598-4.3823*m_cg25015733

(5)

生物学年龄＝40.0731+11.7548*m_cg13848598-3.7269*m_cg25015733

(6)

生物学年龄＝66.5409+6.0015*m_cg13848598+0.5269*m_cg25015733

(7)

针对cg06335867和cg12494373列出的等式(8)至(10)之一：

生物学年龄＝77.9930+13.8956*m_cg06335867-11.1632*m_cg12494373 (8)

生物学年龄＝45.505+4.103*m_cg06335867-3.89*m_cg12494373 (9)

生物学年龄＝73.506+5.203*m_cg06335867-3.63*m_cg12494373 (10)

针对cg23368787和cg03271893列出的等式(11)至(13)之一：

生物学年龄＝49.0849+23.5911*m_cg23368787-17.7116*m_cg03271893 (11)

生物学年龄＝34.928+8.129*m_cg23368787-5.868*m_cg03271893 (12)

生物学年龄＝64.454+8.149*m_cg23368787-3.872*m_cg03271893 (13)

针对cg11084334和cg24217948列出的等式(14)至(16)之一：

生物学年龄＝69.9697+24.0016*m_cg11084334-11.8749*m_cg24217948 (14)

生物学年龄＝54.792+11.685*m_cg11084334-6.465*m_cg24217948 (15)

生物学年龄＝50.985+3.226*m_cg11084334+6.147*m_cg24217948 (16)

实施例1

从6个个体收集皮肤样品，并根据以上提供的方法进行分析。分析的CpG核苷酸是cg06335867和cg13848598。以下生物年龄的计算使用等式(2)进行，并与实足年龄进行比较。

受试者1

实足年龄：30岁

标记cg06335867：

测量的β-值(cg06335867)：0.1702

计算的m-值(cg06335867)＝log2(0.1702/1-0.1702)＝-2.2855326

标记cg13848598：

测量的β-值(cg13848598)：0.25

计算的m-值(cg13848598)＝log2(0.25/1-0.25)＝-1.5849625

生物学年龄：

70.002+8.992×(-2.2855326)+12.998×(-1.5849625)＝28.85岁

实足年龄和生物学年龄之差：1.15岁。

受试者2

实足年龄：35岁

标记cg06335867：

测量的β-值(cg06335867)：0.2286

计算的m-值(cg06335867)＝log2(0.2286/1-0.2286)＝-1.7546537

标记cg13848598：

测量的β-值(cg13848598)：0.3775

计算的m-值(cg13848598)＝log2(0.3775/1-0.3775)＝-0.7215972

生物学年龄：

70.002+8.992×(-1.7546537)+12.998×(-0.7215972)＝44.84岁

实足年龄和生物学年龄之差：9.84岁。

受试者3

实足年龄：57岁

标记cg06335867：

测量的β-值(cg06335867)：0.1681

计算的m-值(cg06335867)＝log2(0.1681/1-0.1681)＝-2.3070904

标记cg13848598：

测量的β-值(cg13848598)：0.5514

计算的m-值(cg13848598)＝log2(0.5514/1-0.5514)＝0.2976696

生物学年龄：

70.002+8.992×(-2.3070904)+12.998×(0.2976696)＝53.13岁

实足年龄和生物学年龄之差：3.87岁。

受试者4

实足年龄：72岁

标记cg06335867：

测量的β-值(cg06335867)：0.3262

计算的m-值(cg06335867)＝log2(0.3262/1-0.3262)＝-1.0465636

标记cg13848598：

测量的β-值(cg13848598)：0.6071

计算的m-值(cg13848598)＝log2(0.6071/1-0.6071)＝0.62777201

生物学年龄：

70.002+8.992×(-1.0465636)+12.998×(0.62777201)＝68.75岁

实足年龄和生物学年龄之差：3.25岁。

将计算的生物学年龄针对六个个体中每一个的实足年龄作图，如图37所示。跨这些数据点的平均绝对误差为5.05岁，证明了根据本发明计算的生物学年龄和实足年龄之间的高度相关性。此外，所有年龄都有良好的相关性。由于所述方法在所有样品中以高准确度预测生物学年龄，因此偏离生物学年龄指示单个个体的健康状况。