阅读说明：本技术 检测巨噬细胞中rfx1表达水平的试剂在制备巨噬细胞分型检测制剂中的应用 (Application of reagent for detecting RFX1 expression level in macrophage in preparing macrophage typing detection preparation ) 是由 贾素洁 赵明 杨爽 堵培 于 2020-07-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种检测巨噬细胞中RFX1表达水平的试剂在制备巨噬细胞分型检测制剂中的应用。通过巨噬细胞中RFX1的表达水平判断巨噬细胞分化类型,在M1型巨噬细胞中RFX1的表达水平高于M0和M2型巨噬细胞。提示该基因可作为M1型巨噬细胞的生物标志物,在巨噬细胞的分型鉴定中具有较好的应用价值。(The invention discloses an application of a reagent for detecting the expression level of RFX1 in macrophages in preparing a macrophage typing detection preparation. Macrophage differentiation type was judged by the expression level of RFX1 in macrophages, with RFX1 expression levels in M1-type macrophages higher than M0 and M2-type macrophages. The gene can be used as a biomarker of M1 type macrophages and has good application value in the typing identification of the macrophages.)

检测巨噬细胞中RFX1表达水平的试剂在制备巨噬细胞分型检 测制剂中的应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测巨噬细胞中RFX1表达水平的试剂在制备巨噬细胞分型检测制剂中的应用。

背景技术

巨噬细胞是单核吞噬细胞系统的固有免疫细胞，在机体应激防御、组织生长发育和体内稳态平衡等多个方面发挥着重要作用。研究显示巨噬细胞具有明显的可塑性—可极化为促进炎症的表型或抑制炎症的表型。这种可塑性使得机体既能有效地抵御感染又能进行感染后的自我修复。促进炎症的巨噬细胞是由干扰素γ（Interferon γ，IFN-γ），脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导的经典炎症巨噬细胞，即M1型巨噬细胞。M1型细胞释放促炎性细胞因子，如白介素（Interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-12、肿瘤坏死因子（Tumornecrosis factor α，TNF-α）、诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS）等来激活炎症反应。而抑制炎症的表型是替代活化的巨噬细胞，也称为M2型巨噬细胞，是由IL-4，IL-13诱导形成。M2巨噬细胞表达低水平的促炎细胞因子，高水平表达精氨酸酶-1（Arginase-1，ARG-1）、类几丁质蛋白3 （Chitinase-like protein 3，Chil3或YM1）、IL-10、TGF-β、甘露糖受体-1（Mannose receptor-1，MRC-1）等，参与组织修复和重塑。

巨噬细胞异常极化参与了多种疾病的发生发展。研究发现M1巨噬细胞可泌促炎性细胞因子促进炎症性肠病发展进程, 而M2巨噬细胞促进组织修复和炎症消退，减轻炎症性肠病发展程度。有研究表明冠心病患者心外膜脂肪组织中巨噬细胞浸润增加并向M1型促炎状态极化。巨噬细胞的极化方向影响了炎症性肠病、动脉粥样硬化等慢性炎症性疾病的发展和转归。因此，准确鉴定巨噬细胞的亚型在慢性炎症性疾病的研究中显得尤为重要。

巨噬细胞亚型之间的形态没有明显差异，目前主要通过生物标志物对巨噬细胞的亚型进行鉴定，常用的分子主要有CD68、iNOS、CD206等，通常通过流式细胞术进行检测鉴定，对实验平台的仪器有一定的要求，通过这些分子进行巨噬细胞亚型鉴定有一定的局限性。因此，发现新的方便检测、适用性强的鉴定巨噬细胞亚型的标志物及检测试剂对巨噬细胞亚型的鉴定具有重大意义。

调节因子X（Regulation factor X，RFX）家族是一类重要的转录因子，RFX1作为该家族的一员，具有抑制和激活目的基因转录的双重能力。研究发现RFX1的表达与胶质母细胞瘤细胞的增殖、存活和侵袭能力呈负相关关系。目前，没有RFX1的表达与巨噬细胞分化相关的研究报道。

发明内容

本发明的首要目的在于提供了一种巨噬细胞分型检测方法。该方法操作简单、结果准确，为巨噬细胞分化类型鉴定提供了新的途径。

一种巨噬细胞分型检测方法，检测巨噬细胞RFX1表达水平。

上述的检测方法，通过巨噬细胞中RFX1的表达水平判断巨噬细胞分化类型，在M1型巨噬细胞中RFX1的表达水平高于M0和M2型巨噬细胞。

上述的检测方法，检测巨噬细胞中RFX1表达水平包括检测巨噬细胞中RFX1 mRNA和/或蛋白表达水平。

采用本发明所述的巨噬细胞分型检测方法检测的结果为巨噬细胞中RFX1表达水平，并仅仅以此中间结果来判断或者研究巨噬细胞分化类型。

本发明的第二个目的是提供一种巨噬细胞分型检测试剂，该试剂即为与上述检测方法配套的检测巨噬细胞中RFX1表达水平的试剂。

所述的检测试剂，检测巨噬细胞中RFX1表达水平包括检测巨噬细胞中RFX1 mRNA和/或蛋白表达水平。

所述的检测试剂，检测巨噬细胞RFX1 mRNA表达水平的试剂中PCR扩增引物对序列如下 :

RFX1-F：5'-GATCCAAGGCGGCTACAT-3'；

RFX1-R：5'-CAGCCGTCTCATAGTTGTCC-3'。

所述的检测试剂，检测巨噬细胞中RFX1 mRNA表达水平的试剂还包括：RNA提取试剂、逆转录试剂、PCR扩增试剂。

所述的检测试剂，检测巨噬细胞中RFX1蛋白表达水平的试剂包含蛋白抽提试剂、RFX1特异性抗体和发光检测试剂。

本发明的第三个目的是提供上述的检测巨噬细胞中RFX1表达水平的试剂在制备巨噬细胞分型检测制剂中的应用。

在本发明中，我们通过荧光实时定量PCR和蛋白质印迹法检测人单核细胞体外诱导的M0、M1型和M2型巨噬细胞中RFX1的表达，发现在M1型巨噬细胞中该基因的mRNA及蛋白表达水平明显高于M0和M2型巨噬细胞，同时通过蛋白质印迹法检测在C57BL/6小鼠骨髓来源细胞体外诱导的M0、M1型和M2型巨噬细胞中RFX1的表达，发现在M1型巨噬细胞中该基因的蛋白表达水平明显高于M0和M2型巨噬细胞，上述结果提示RFX1可作为M1型巨噬细胞的生物标志物，在巨噬细胞的分型鉴定中具有较好的应用价值，且检测方法简单、方便，具有普遍适用性。

附图说明

图1为本发明设计的RFX1扩增引物特异性及扩增产物片段大小验证结果；

A为人单核细胞诱导的巨噬细胞用RFX1引物扩增的溶解曲线图；

B为人单核细胞诱导的巨噬细胞用RFX1引物qPCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果图。

图2为人单核细胞体外诱导的M0、M1及M2型巨噬细胞中RFX1 mRNA及蛋白表达水平检测的结果图；

A为人单核细胞体外诱导的M0、M1及M2型巨噬细胞中RFX1的mRNA相对表达量检测统计结果图；

B为人单核细胞体外诱导的M0、M1及M2型巨噬细胞中RFX1蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图；

C为人单核细胞体外诱导的M0、M1及M2型巨噬细胞中RFX1蛋白相当表达量检测统计结果图。

图3为C57BL/6小鼠骨髓来源细胞体外诱导的M0、M1及M2型巨噬细胞中RFX1蛋白表达水平检测的结果图；

A为C57BL/6小鼠骨髓来源细胞体外诱导的M0、M1及M2型巨噬细胞中RFX1蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图；

B为C57BL/6小鼠骨髓来源细胞体外诱导的M0、M1及M2型巨噬细胞中RFX1蛋白相对表达量检测统计结果图。

图4为受试者工作特征（ROC）曲线分析计算M1型巨噬细胞与M0、M2型巨噬细胞RFX1mRNA和蛋白相对表达量比较时的曲线下面积（AUC）结果图；

A为受试者工作特征（ROC）曲线分析计算M1型巨噬细胞与M0、M2型巨噬细胞RFX1 mRNA相对表达量比较时的AUC结果图；

B为受试者工作特征（ROC）曲线分析计算M1型巨噬细胞与M0、M2型巨噬细胞RFX1蛋白相对表达量比较时的AUC结果图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。

下述实施例中涉及到的：生长培养基为DMEM，购自Gibco；FBS胎牛血清，购自Gibco；兔来源的RFX1抗体，购自美国GeneTex；离心机生产厂家为美国Thermo公司、型号为FRESC017高速冷冻离心机；荧光定量PCR仪生产厂家为美国Applied Biosystem公司、型号为T7900HT Fast Real-Time PCR仪；电泳仪生产厂家为美国BIO-RAD公司、型号为PowerPacTMand Mini-Sub cell GT；转膜仪生产厂家为美国Bio-Rad公司、型号为MiniTrans-Blot cell；化学发光凝胶成像系统生产厂家为美国GE公司、型号为ImageQuantLAS4000mini。

实施例1：人外周血单核细胞的分离

取得4例健康志愿者（健康志愿者的纳入标准为：1．3个月内无严重感染性疾病，未进行大型外科手术；2．具有健康生活方式及良好饮食习惯；3．BMI在正常范围内（18.5~23.9）；4．既往无慢性病，无自身免疫病或免疫抑制状态及恶性病史。）知情同意后，抽取约200 mL外周静脉血，采用密度梯度离心法和磁珠分选法分离外周血CD14⁺单核细胞。具体步骤如下：

a. 每个50 mL离心管中加入5 mL肝素溶液，取20 mL外周静脉血加入离心管中，用恢复后的无菌PBS补充体积至35 mL，用量程为10 mL的移液管轻轻混匀；

b. 取15 mL复温的人淋巴细胞分离液于50 mL离心管中；

c. 用移液管缓慢地延管壁将步骤a获得的稀释后的外周静脉血加于淋巴细胞液面上，保持淋巴细胞与血液的分层界面清晰，防止界面被破坏（注意整个过程动作轻柔）；

d. 为确保缓慢降速不破坏分层的液面及溶血，离心条件采用18℃，转速2000 rpm，加速度为8，减速度为0，水平离心30 min；

e. 离心后管内液面共分为三层：最上层为血浆和PBS的混合液，最底层为红细胞和血小板，中间层即为呈现白色云雾状为外周血单个核细胞。毛细吸管吸取中间的云雾层，转移至另一无菌50 mL离心管中；

f. 向转移至新的离心管中的外周血单个核细胞溶液中加入2倍以上体积的无菌PBS洗涤并离心，离心条件为4℃，2000 rpm，水平离心10 min；

g. 重复步骤f（重新洗涤），离心后弃上清；

h. 取480 μL buffer（4℃）重悬细胞沉淀，加入120 μL CD14磁珠（4℃，避光）混匀，4℃避光孵育15 min；

i. 孵育结束后，向离心管中加buffer至20 mL，水平离心10 min ，离心条件4℃，1200rpm，加速度为8，减速度为9，离心后弃去上清；

j. 取1000 μL buffer（4℃）重悬细胞，将LS分离柱固定于Midi MACS分选器上，用3 mL预冷的无菌bufffer润洗LS柱；

k. 将1 mL细胞悬浮液加入分离柱中，待LS分离柱底部未有液体流出时，加3 mLbuffer冲洗柱子，重复3次；

l.取下LS分离柱，向柱内加入5 mL buffer，采用配套的推柄将细胞迅速推入15 mL离心管；

m. 细胞计数后铺板。

实施例2：人单核细胞体外诱导M0、M1、M2型巨噬细胞

a. 用50 ng/mL终浓度的巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage colony-stimulatingfactor,M-CSF）诱导CD14⁺单核细胞向巨噬细胞分化，每两天换一次液，共培养6天；

b. 在人巨噬细胞上清中加入100 ng/mL终浓度的LPS诱导细胞向M1型分化（参见:Mediators Inflamm. 2016;2016:6986175.），加入终浓度20 ng/mL的IL-4诱导巨噬细胞向M2型分化（参见: Exp Cell Res. 2017 Aug 15; 357(2): 155-162.），不加刺激的对照组为M0型巨噬细胞，24 h后收取进行后续实验。

实施例3：RNA提取及逆转录

（1）样本RNA的提取

a. 提前用95%的酒精喷洒台面，将溶于Trizol并冻存于-80℃冰箱的样本取出，冰上溶解；

b. 每1000 mL Trizol中加200 μL氯仿，上下颠倒混匀15 s，冰上放置10 min；

c. 转速12000 rpm，4℃，离心30 min；

d. 移取上清液约400 μL于另一新EP管中，注意不要将吸头插入白色液面及以下部分，每管加入400 μL异丙醇，上下颠倒混匀，室温孵育15 min：

e. 12000 rpm，4℃，离心20 min，轻轻弃去上清；

f. 每管加入500 μL预冷的无酶75%乙醇，上下颠倒，轻轻混匀，7500 rpm，4℃，离心5min；

g. 轻轻弃去上清，置漂浮板上晾干5~10 min；

h. 加无酶水20 μL溶解，4℃溶解3~4 h，测浓度；

（2）逆转录

采用Takara公司的 PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒进行RNA逆转录，具体步骤如下：

a. 去除基因组DNA，反应体系如下表1所示:

表1 DNA去除反应体系

b. 如下表2所示配置反应混合液，并分装于无酶PCR管中：

表2 逆转录Mix配制体系

c. 逆转录合成的cDNA，用无酶水稀释5倍，置于-20℃保存。

实施例4：实时荧光定量PCR检测RFX1 mRNA表达水平

以人RFX1基因序列为模板，设计如下引物，所述引物序列如下：SEQ ID No:1 :

RFX1-f：5'-GATCCAAGGCGGCTACAT-3'

SEQ ID No:2

RFX1-R：5'-CAGCCGTCTCATAGTTGTCC-3'

引物特异性及扩增产物片段大小验证结果见图1，

由结果可知，图1A为人单核细胞诱导的巨噬细胞用RFX1引物扩增的溶解曲线，图中显示溶解曲线为单峰，扩增的产物单一，引物特异性好；且通过NCBI网站的BLAST功能比对的引物扩增产物片段大小的结果图，扩增产物的片段大小为107bp；图1B为人单核细胞诱导的巨噬细胞用RFX1引物qPCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果图，条带单一，且产物片段大小在107bp，说明qPCR扩增产物为目的片段；

a. 按照Takara公司的SYBR® PrimeScriptTM RT-PCR Kit试剂盒说明书操作，β-actin作为内参，反应体系见表3；

表3 Real time-PCR扩增体系

b. 反应条件见下表4：

表4 Real time-PCR反应条件

c. 采用Roche公司的LightCyclery® 7900 PCR仪进行实时荧光定量PCR，实验重复三次以上；

实验结果见图2，

由结果可知，人单核细胞体外诱导的M0、M1及M2型巨噬细胞中RFX1 mRNA相对表达量，M1显著高于M0及M2型巨噬细胞，P=0.0035，结果有统计学意义。

实施例4：总蛋白提取

a. 将冻存于-80℃的2×10⁶个/管细胞样本（M0,M1,M2各4个）置于冰上解冻，强蛋白裂解液（RIPA）和蛋白酶抑制剂（PMSF）按照100:1的比例配置蛋白裂解液；

b. 每管细胞加入配好的裂解液50 μL，吹打混匀，置于冰上裂解30 min；

c. 采用超声探头对EP管中的细胞进行冰上超声，5 min/次，重复三次；

d. 将超声过的细胞进行离心4℃，10000~12000 rpm，离心10 min，移取上清于另一新EP管中；

e. 采用BCA法检测蛋白浓度，按每管30 μg蛋白量分装，冻存于-80℃冰箱。

实施例5：蛋白质印迹法检测RFX1蛋白表达水平

（1）制备SDS-PAGE胶

a. 配置8%的分离胶溶液，充分混匀后用吸管换注入组装好的制胶玻璃夹板中，注入分离胶最终体积约为容积的3/4；

b. 吸取去离子水缓慢注入夹板内，避免液面出现大幅波动，直至分离胶与空气完全隔离，静置30 min；

c. 倾倒出分离胶上层的去离子水，并用滤纸轻轻吸取残留的水分，配置5%的浓缩胶溶液，完全混匀后用吸管转移至分离胶上层，轻轻插入8孔梳子（完全插入前轻轻晃动梳子，保证其周围没有气泡）；

d. 静置1 h，确保浓缩胶完全凝固后，将胶板置于电泳液中，4℃保存备用；

（2）SDS-PAGE凝胶电泳

a. 取出分装好的蛋白样品冰上溶解，量取20 μg的蛋白溶液并与2×SDS-loadingBuffer以体积比为1:1混合，在金属浴上100℃煮沸7 min（变性蛋白），12000 rpm，5 min离心；

b. 安装好电泳架，加入电泳液检查是否有漏液。确认无漏液后，将电泳架内加满并拔出凝胶板的梳子冲洗胶孔（去除胶孔内杂质）；

c. 将Marker和变性后的蛋白样品依次加到加样孔内，后在电泳盒子内加电泳液，调节电压为80 V（恒压电泳），时间为40~60 min，待蛋白从浓缩胶移至分离胶，并电泳为一条线时，调节电压为100 V继续电泳至结束；

（3）转膜

a. 配置转膜液，取出电泳架，回收电泳液备下次使用；

b. 将凝胶板取出，小心撬开玻璃板，取出SDS-PAGE凝胶，根据marker条带的位置切除多余胶（务必保证130 kd及42 kd位置的RFX1及β-actin蛋白不被剪掉），置于转膜液中备用；

c. 按照胶的大小剪裁相同大小的PDVF膜和滤纸，将PDVF膜放入甲醇浸泡5 min后取出，将海绵垫和滤纸和PDVF膜放入转膜液中浸湿；

d. 按照从下往上依次为海绵垫-三层滤纸-SDS-PAGE凝胶-PDVF膜-三层滤纸-海绵垫（保证每层无气泡）的顺序夹好，塞入转印夹中，采用转膜仪在4℃层析柜中恒流300 mA，转膜90 min；

（4）封闭

a. 称取约2.5 g脱脂奶粉置于50 mL离心管中，加入PBST溶液上下颠倒混匀至完全溶解后，定容至50 mL；

b. 将印迹膜从转印夹中取出，膜正面朝上，左上角剪去小角标记正反，随后置于洗涤盒中，加入足量5%脱脂奶粉封闭液以覆盖印迹膜，垂直摇床上室温封闭1 h；

（5）孵一抗

a. 将印迹膜按照marker位置进行剪裁，使RFX1和β-actin蛋白位于两张印迹膜上，将RFX1抗体和β-actin抗体与封闭液分别按1:500和1:2000稀释，混匀后加入两张印迹膜所在的抗体孵育盒中，将孵育盒置于4℃层析柜的摇床中，孵育过夜；

b. 过夜后用PBST溶液洗膜三次，每次10 min；

（6）孵二抗

a. 将清洗过的两张印迹膜分别置于抗鼠和抗兔的二抗稀释液中（稀释比为1:2000），在室温下的垂直摇床上孵育1 h；

b. 将膜转入足量PBST中，水平摇床上洗涤10 min/次，洗涤三次；

（7）显影：提前打开显影仪，按照显影液的说明书配置显影液，用移液枪均匀的润湿印迹膜后，置于显影仪的暗室中进行显影；

结果见图2，

由结果可知，人单核细胞体外诱导的M0、M1及M2型巨噬细胞中RFX1 蛋白相对表达量，M1显著高于M0及M2型巨噬细胞，P=0.0062，结果有统计学意义。

实施例6：C57BL/6小鼠骨髓来源细胞的分离

a. 配置1%戊巴比妥钠溶液，按照50mg/kg对小鼠进行腹腔麻醉，等待其进入深麻醉状态，并且对伤害性夹持无反应后处死小鼠；

b. 剪开小鼠皮肤，游离出胫骨和腓骨，用喷了75%酒精的吸水纸将骨头外部的肌肉及组织剔除干净，放入干净15 mL离心管；

c. 用75%酒精冲洗后用纯DMEM培养基冲掉残留的酒精，用消毒过的剪刀剪掉骨头的两端，用纯DMEM培养基将小鼠骨髓冲出至10 cm培养皿中，吹打混匀之后，1500 rpm，离心5min；

d. 用50%DMEM培基，30% 无菌L929细胞培养上清，1%双抗，20% FBS配置小鼠骨髓巨噬细胞诱导培养基，用小鼠骨髓巨噬细胞诱导培养基重悬骨髓细胞，每只小鼠骨髓细胞铺两个10 cm培养皿，每个培养皿含6 mL诱导培基，每两天换一次液；

e. 用20 mL 0.5M EDTA溶液，960 mL PBS溶液和20 mL胎牛血清配置EDTA巨噬细胞消化液。细胞培养至第六天（上清直接倒掉），用配好的EDTA巨噬细胞消化液消化细胞，并计数铺板。

实施例7：C57BL/6小鼠骨髓来源细胞体外诱导的M0、M1及M2型巨噬细胞

巨噬细胞培养过夜后，向细胞培养上清中加入终浓度100 ng/mL的LPS诱导24 h后，巨噬细胞向M1型分化；向细胞培养上清中加入终浓度为20 ng/mL的IL-4诱导24 h后，巨噬细胞向M2型分化。

实施例8：总蛋白提取

a. 将冻存于-80℃的2×10⁶个/管细胞样本（M0,M1,M2各4个）置于冰上解冻，强蛋白裂解液（RIPA）和蛋白酶抑制剂（PMSF）按照100:1的比例配置蛋白裂解液；

b. 每管细胞加入配好的裂解液50 μL，吹打混匀，置于冰上裂解30 min；

c. 采用超声探头对EP管中的细胞进行冰上超声，5 min/次，重复三次；

d. 将超声过的细胞进行离心4℃，10000~12000 rpm，离心10 min，移取上清于另一新EP管中；

e. 采用BCA法检测蛋白浓度，按每管30 μg蛋白量分装，冻存于-80℃冰箱。

实施例9：蛋白质印迹法检测RFX1蛋白表达水平

（1）制备SDS-PAGE胶

a. 配置8%的分离胶溶液，充分混匀后用吸管换注入组装好的制胶玻璃夹板中，注入分离胶最终体积约为容积的3/4；

b. 吸取去离子水缓慢注入夹板内，避免液面出现大幅波动，直至分离胶与空气完全隔离，静置30 min；

c. 倾倒出分离胶上层的去离子水，并用滤纸轻轻吸取残留的水分，配置5%的浓缩胶溶液，完全混匀后用吸管转移至分离胶上层，轻轻插入8孔梳子（完全插入前轻轻晃动梳子，保证其周围没有气泡）；

d. 静置1 h，确保浓缩胶完全凝固后，将胶板置于电泳液中，4℃保存备用；

（2）SDS-PAGE凝胶电泳

a. 取出分装好的蛋白样品冰上溶解，量取20 μg的蛋白溶液并与2×SDS-loadingBuffer以体积比为1:1混合，在金属浴上100℃煮沸7 min（变性蛋白），12000 rpm，5 min离心；

b. 安装好电泳架，加入电泳液检查是否有漏液。确认无漏液后，将电泳架内加满并拔出凝胶板的梳子冲洗胶孔（去除胶孔内杂质）；

c. 将Marker和变性后的蛋白样品依次加到加样孔内，后在电泳盒子内加电泳液，调节电压为80 V（恒压电泳），时间为40~60 min，待蛋白从浓缩胶移至分离胶，并电泳为一条线时，调节电压为100 V继续电泳至结束；

（3）转膜

a. 配置转膜液，取出电泳架，回收电泳液备下次使用；

b. 将凝胶板取出，小心撬开玻璃板，取出SDS-PAGE凝胶，根据marker条带的位置切除多余胶（务必保证130 kd及42 kd位置的RFX1及β-actin蛋白不被剪掉），置于转膜液中备用；

c. 按照胶的大小剪裁相同大小的PDVF膜和滤纸，将PDVF膜放入甲醇浸泡5 min后取出，将海绵垫和滤纸和PDVF膜放入转膜液中浸湿；

d. 按照从下往上依次为海绵垫-三层滤纸-SDS-PAGE凝胶-PDVF膜-三层滤纸-海绵垫（保证每层无气泡）的顺序夹好，塞入转印夹中，采用转膜仪在4℃层析柜中恒流300 mA，转膜90 min；

（4）封闭

a. 称取约2.5 g脱脂奶粉置于50 mL离心管中，加入PBST溶液上下颠倒混匀至完全溶解后，定容至50 mL；

b. 将印迹膜从转印夹中取出，膜正面朝上，左上角剪去小角标记正反，随后置于洗涤盒中，加入足量5%脱脂奶粉封闭液以覆盖印迹膜，垂直摇床上室温封闭1 h；

（5）孵一抗

a. 将印迹膜按照marker位置进行剪裁，使RFX1和β-actin蛋白位于两张印迹膜上，将RFX1抗体和β-actin抗体与封闭液分别按1:500和1:2000稀释，混匀后加入两张印迹膜所在的抗体孵育盒中，将孵育盒置于4℃层析柜的摇床中，孵育过夜；

b. 过夜后用PBST溶液洗膜三次，每次10 min；

（6）孵二抗

a. 将清洗过的两张印迹膜分别置于抗鼠和抗兔的二抗稀释液中（稀释比为1:2000），在室温下的垂直摇床上孵育1 h；

b. 将膜转入足量PBST中，水平摇床上洗涤10 min/次，洗涤三次；

（7）显影：提前打开显影仪，按照显影液的说明书配置显影液，用移液枪均匀的润湿印迹膜后，置于显影仪的暗室中进行显影；

结果见图3，

由结果可知，C57BL/6小鼠骨髓来源细胞体外诱导的M0、M1及M2型巨噬细胞中RFX1的相对蛋白表达量，M1显著高于M0及M2型巨噬细胞，P=0.0165，结果有统计学意义。

实施例10：RFX1 mRNA和蛋白相对表达量作为M1型巨噬细胞生物标志物的特异性分析

采用受试者工作特征（ROC）曲线分析计算M1型巨噬细胞与M0、M2型巨噬细胞RFX1 mRNA和蛋白相对表达量比较时的曲线下面积（AUC）；

结果见图4，

由结果可知，11例健康志愿者的人单核细胞体外诱导的M1与M0、M2型巨噬细胞RFX1mRNA相对表达量的AUC值为0.839（95%CI：0.658-1.000）（n=33）；RFX1 mRNA相对表达量的结果表明：根据“ 尤登指数”即敏感性-(1-特异性)，该指数值取最大值处就是最佳的界值，可得到“尤登指数”最大值为R＝0.773，M1与M0、M2型巨噬细胞RFX1 mRNA相对表达量的最佳界值为a=1.2491，即所述样本a值与界值（a=1.2491）进行比较，a>1.2491判读为M1型巨噬细胞，a≤1.2491判读为非M1型巨噬细胞，具体视IL-4诱导/非诱导判读为M2/M0型巨噬细胞。使用该最佳临界值鉴定M1型巨噬细胞的敏感性和特异性分别为81.8%和95.5%；

4例健康志愿者的人单核细胞体外诱导的和4例C57BL/6小鼠骨髓来源细胞诱导的M1与M0、M2型巨噬细胞RFX1 蛋白相对表达量的AUC值为0.938（95%CI：0.842-1.000）（n=24）；RFX1 蛋白相对表达量的结果表明：“尤登指数”最大值为R＝0.75，M1与M0、M2型巨噬细胞RFX1 蛋白相对表达量的最佳界值为b=30.55，即所述样本b值与界值（b=30.55）进行比较，b>30.55判读为M1型巨噬细胞，a≤30.55判读为非M1型巨噬细胞，具体视IL-4诱导/非诱导判读为M2/M0型巨噬细胞。使用该最佳临界值鉴定M1型巨噬细胞的敏感性和特异性分别为87.5%和87.5%。

以上结果提示，RFX1的表达可作为M1型巨噬细胞的生物标志物，具有较高的准确性与特异性，对M1型巨噬细胞的鉴定具有较好的应用价值。

序列表

<110> 中南大学

<120> 检测巨噬细胞中RFX1表达水平的试剂在制备巨噬细胞分型检测制剂中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatccaaggc ggctacat 18

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cagccgtctc atagttgtcc 20