阅读说明：本技术 一种hla-b位点等位基因分型试剂盒及其检测方法 (HLA-B locus allele typing kit and detection method thereof ) 是由 何军 邱桥成 于 2020-07-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种HLA-B位点等位基因分型试剂盒及其检测方法,该试剂盒包括用于扩增覆盖HLA-B位点第2,3,4外显子区域的扩增引物,以及分别针对第2,3,4外显子区域的特异性测序引物。该检测方法通过扩增引物对DNA样本进行扩增,然后分别使用针对HLA-B位点第2,3,4外显子区域的测序引物对扩增产物中的第2,3,4外显子进行测序,将得到的测序结果与数据库比对得到HLA-B位点等位基因型。该方法可以使用扩增引物直接针对HLA-B位点进行扩增及使用测序引物第2,3,4外显子区域进行测序,获得B位点上各种等位基因型,避免了与其同源性极高的HLA-A,C位点基因序列的干扰,提高了分型结果的准确性。(The invention discloses an HLA-B locus allele typing kit and a detection method thereof, wherein the kit comprises an amplification primer for amplifying the 2 nd, 3 rd and 4 th exon regions covering the HLA-B locus and specific sequencing primers aiming at the 2 nd, 3 th and 4 th exon regions respectively. According to the detection method, an amplification primer is used for amplifying a DNA sample, sequencing primers aiming at exon regions 2,3 and 4 of an HLA-B locus are used for sequencing exons 2,3 and 4 in an amplification product respectively, and the obtained sequencing result is compared with a database to obtain the allele type of the HLA-B locus. According to the method, the amplification primers can be used for directly amplifying the HLA-B locus and sequencing the exon regions 2,3 and 4 of the sequencing primers to obtain various allelic genotypes on the B locus, so that the interference of the HLA-A and C locus gene sequences with extremely high homology with the B locus is avoided, and the accuracy of the typing result is improved.)

一种HLA-B位点等位基因分型试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种HLA-B位点等位基因分型试剂盒及其检测方法。

背景技术

人类白细胞抗原(HLA)由位于人类6号染色体短臂的基因编码产生，经典的HLA-Ⅰ类分子包括A,B,C位点，HLA-Ⅱ类分子包括DR,DQ,DP位点，HLA各位点上的基因是以单倍体形式连锁遗传，其中HLA-B位点是迄今为止发现等位基因多态性最复杂的位点。WHO已报道的HLA-B位点等位基因数为7255个，中国人群统计的B位点等位基因数为485个， 其中常见等位基因为54个。

HLA-B位点除了在异基因造血干细胞移植和器官移植中发挥重要作用外，更与疾病的遗传性、发病机制及疾病进展、药物的毒性或不良反应、生殖健康及***不育等密切相关。尤其是HLA-B位点等位基因分型比传统血清型相比，对疾病的诊断及预后判断更精准。临床应用领域为：HLA-B27等位基因分型在预测及诊断强直性脊柱炎中的临床价值；在预测患者药物不良反应中的临床价值，如抗癫痫药物检测B*15:02基因，抗病毒药阿巴卡伟检测B*57:01基因，抗痛风药降尿酸的别嘌醇检测B*58:01基因等；以及HLA与免疫性***、习惯性流产均有相关性。因此，应用基因测序方法制备精准进行HLA–B位点等位基因分型试剂盒有非常重要的临床应用前景，及对疾病的诊断和治疗价值。

基因测序（sequence basis test, SBT）技术是HLA基因分型的“金标准”，采用SBT技术进行HLA-B位点等位基因分型方法，是针对B位点具有T细胞重要抗原递呈作用的第2,3,4外显子进行全长测序，故不仅可以精准对患者的HLA-B位点上2个等位基因进行测序外，还可以明确血清型、等位基因纯合子或杂合子表达，并进一步分析致病基因的HLA单倍型。具有正确性高、特异性高、精密度高、样本量小，并可实现大规模检测、报告时间缩短等优势。

发明内容

本发明的目的在于提供一种HLA-B位点等位基因分型试剂盒及其使用该试剂盒进行HLA-B位点等位基因分型的检测方法，通过设计覆盖HLA-B位点各种等位基因型特征性的引物序列，进而设计了用于HLA-B位点第2,3,4外显子测序反应的引物序列，同时建立和优化实验反应体系及条件进行HLA-B位点等位基因分型的检测。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种HLA-B位点等位基因分型试剂盒，包括用于扩增覆盖HLA-B位点第2,3,4外显子区域的扩增引物，以及分别针对第2,3,4外显子区域的特异性测序引物；

所述扩增引物的核苷酸序列如下所述：

上游引物BF：TCTCAGGGTCTCAGGGTCCG，如SEQ ID NO .1所示；

下游引物BR：CAGCCAGGCCAGCAACAATG，如SEQ ID NO .2所示；

针对第2外显子的测序引物如下所述：

上游引物B2F：CCCAGGCTCCCACTCCAT，如SEQ ID NO .3所示；

下游引物B2R：GGGGAGTCGTGACCTGC，如SEQ ID NO .4所示；

针对第3外显子的测序引物如下所述：

上游引物B3F：GGCCAGGGTCTCACA，如SEQ ID NO .5所示；

下游引物B3R：GGCGACATTCTAGCGC，如SEQ ID NO .6所示；

针对第4外显子的测序引物如下所述：

上游引物B4F：AGATGCAAAGCGCCTGAA，如SEQ ID NO .7所示；

下游引物B4R：GGCTCCTGCTTTCCCTGA，如SEQ ID NO .8所示。

进一步的，覆盖HLA-B位点第2,3,4外显子区域的扩增体系包括：上游引物BF、下游引物BR、10×buffer、dNTP、Taq酶和DNA样本。

进一步的，针对第2,3,4外显子区域的测序体系包括：PCR扩增产物、B2F/B2R,B3F/B3R, B4F/B4R测序引物和Bigdye。

使用以上所述的试剂盒进行HLA-B位点等位基因分型的检测方法，包括以下步骤：

（1）DNA抽提；

（2）将步骤（1）中提取的DNA样本，使用SEQ ID NO .1和SEQ ID NO .2所示的扩增序列进行扩增，得到覆盖HLA-B位点包含第2,3,4外显子区域的DNA序列；

（3）将步骤（2）扩增出的PCR产物，用琼脂糖凝胶进行电泳，根据目的条带的大小及位置分离出目的条带，将目的条带加入虾碱酶消化后分别进行测序反应；

（4）将步骤（3）消化后的PCR产物，利用SEQ ID NO .3～8所示的测序引物分别对2、3、4外显子进行测序，得到测序产物；

（5）将步骤（4）得到的测序产物经纯化和变性后，上测序仪进行测序；测序所得序列与HLA-IMGT数据库进行比对分析得到HLA-B位点等位基因型。

进一步的，所述步骤（2）的扩增条件：95℃ 5min；95℃ 30 s、63℃ 25 s、72℃ 2min30s，共40个循环数；72℃ 5min ；10℃ 结束。

进一步的，所述步骤（4）的测序条件：96℃ 20min、50℃ 30s，60℃ 1min 45s，共25个循环。

有益效果：本发明提供了一种HLA-B位点等位基因分型试剂盒及其检测方法，该试剂盒是首次制备的基于基因测序方法的HLA-B位点等位基因分型试剂盒，该试剂盒包含覆盖HLA-B位点的扩增引物及针对第2、3、4外显子的测序引物，可以直接分析HLA-B位点各种等位基因型，避免了与其同源性极高的HLA-A,C位点基因序列的干扰，提高了分型结果的准确性。附图说明

图1为HLA-B位点经DNA 扩增反应后产物的电泳图。

图2 为HLA-B位点第2外显子测序图，其显示B位点等位基因分型结果：HLA-B*15:01, B*51:01，箭头指示黑色条形框内为第2外显子区域。

图3为HLA-B位点第3外显子测序图，其显示B位点等位基因分型结果：HLA-B*46:01, B*46:01，箭头指示黑色条形框内为第3外显子区域。

图4为HLA-B位点第4外显子测序图，其显示B位点等位基因分型结果：HLA-B*46:01, B*51:01，箭头指示黑色条形框内为第4外显子区域。

图5为WHO的HLA 命名原则示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

HLA-B位点等位基因分型试剂盒，包括用于扩增覆盖HLA-B位点第2,3,4外显子区域的扩增引物，以及分别针对第2,3,4外显子区域的特异性测序引物；

所述扩增引物的核苷酸序列如下所述：

上游引物BF：TCTCAGGGTCTCAGGGTCCG，如SEQ ID NO .1所示；

下游引物BR：CAGCCAGGCCAGCAACAATG，如SEQ ID NO .2所示；

针对第2外显子的测序引物如下所述：

上游引物B2F：CCCAGGCTCCCACTCCAT，如SEQ ID NO .3所示；

下游引物B2R：GGGGAGTCGTGACCTGC，如SEQ ID NO .4所示；

针对第3外显子的测序引物如下所述：

上游引物B3F：GGCCAGGGTCTCACA，如SEQ ID NO .5所示；

下游引物B3R：GGCGACATTCTAGCGC，如SEQ ID NO .6所示；

针对第4外显子的测序引物如下所述：

上游引物B4F：AGATGCAAAGCGCCTGAA，如SEQ ID NO .7所示；

下游引物B4R：GGCTCCTGCTTTCCCTGA，如SEQ ID NO .8所示。

该试剂盒覆盖HLA-B位点第2,3,4外显子区域的扩增体系包括：10μM BF引物 0.6μL、10μM BR引物0.6μL、10×buffer 2μL、dNTP 0.4μL、热启动Taq酶0.2μL、DNA 2 μL、H₂O14.2μL，总体积20 μL；

该试剂盒针对第2,3,4外显子区域的测序体系包括：分别针对第2外显子（B2F/ B2R）、第3外显子（B3F/ B3R）、第4外显子（B4F/B4R）的正反向测序引物10μM 0.7 μL、Bigdye 4 μL、H₂O 3.3 μL、产物 2μL，总体积10 μL。

实施例2

使用以上所述的试剂盒进行HLA-B位点等位基因分型的检测方法，包括以下步骤：

（1）DNA的提取：按照仪器和试剂盒说明书提取DNA，DNA的浓度不小于10ng/μL。

（2）将步骤（1）中提取的DNA样本，使用SEQ ID NO .1和SEQ ID NO .2所示的扩增序列进行扩增，得到覆盖HLA-B位点包含第2,3,4外显子区域的DNA序列；使用Perkin ElmerGeneAmp 9700 PCR扩增仪进行扩增，PCR反应条件：95℃ 5min；95℃ 30 s、63℃ 25 s、72℃2 min30s，共40个循环数；72℃ 5min，10℃ forever。

（3）电泳：配置1.0-1.5%浓度琼脂糖凝胶，加入PCR产物和1×凝胶加样缓冲液各2μL混匀，电泳10-15分钟，得到的电泳图如图1所示；紫外成像仪成像，摄图进行结果判读判断目的条带的特异性，PCR扩增产物为2KB，分析产物的特异性、亮度，及是否存在非特异性条带或引物二聚体。

（4）产物消化：在18μL产物中加入虾碱酶2.5μL，置PCR仪，反应条件：37℃ 20 min、80℃ 20 min、10℃ forever。

（5）将步骤（4）消化后的PCR产物，利用SEQ ID NO .3～8所示的测序引物分别对2、3、4外显子进行测序，得到测序产物；测序PCR反应条件：96℃ 20min、50℃ 30s，60℃ 1min45s，共25个循环。

（6）产物纯化：10μL产物中加入2μL醋酸钠和EDTA混合后，离心，再加入25μL无水乙醇后，于振荡器以2000r/min混匀2min，置水平离心机以2000g离心12min，离心后倒扣甩板；再加入80%无水乙醇45μL，离心机以2000g离心5min，离心后倒扣甩板；加入HiDi 10μL，置PCR仪37℃ 2min变性。

（7）测序：编制测序板号，使用ABI 3730XL型测序仪进行测序，进样量为5-8µL，进样时间为10-20秒，图2-4分别为测得的HLA- B位点第2、3、4外显子测序图。

（8）数据采集：读取测序数据，与HLA数据进行碱基序列的比对，分析结果得到HLA-B

位点等位基因型。表1为100例无关个体HLA-B位点等位基因分型结果。

表1 HLA-B位点基因分型(n=50)

本发明的优势及创新点如下所示：

HLA-B位点的等位基因数随着IMGT数据库更新而不断增加，现于2020年6月发布的HLA-B位点的等位基因数为7431个，其中有蛋白功能的为4739个（www..ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla

/intro.html）。根据WHO对于HLA的命名规则，HLA-B位点有功能的等位基因需要明确进行区分，见示意图5显示 HLA-A*02:101，即必须区分有功能不同的等位基因型。

1、技术特点：本发明实现了对HLA-B位点最高清晰度、最高分辨率的等位基因分型方法，

与常规HLA高分辨分型方法相比，一次检测可明确区分人类来源于父母遗传的两条染色体上的两个等位基因，并弥补了常规高分辨分型方法中模棱两可组合、无法区分等位基因的缺陷。用碱基序列比对的方法实现对HLA-B位点等位基因分型结果的分析及判断，不仅明确所得到的碱基序列是否与数据库序列的一致性，或错误，还能区分单峰或双峰、峰度高低，及发现一些新的等位基因。因此，本发明对于实验结果的分析具有直观、明确、自动比对的功能。见图2、3、4。

2、临床优势：举例说明：如HLA-B*27:04 与HLA-B*27:0,6，在以中轴脊柱关节和骶髋关节及其附属组织炎症性病变为主要特征的一种原因不明的自身免疫性强直性脊柱炎疾病中，中国人群常见的HLA-B27亚型：B*27:04、 B*27:05、B*27:07、 B*27:27是致病基因，而B*27:06、 B*27:09 是保护基因。因此，应用一种试剂盒及其检测方法可精准区分4千多个HLA-B位点等位基因，对于疾病诊断实现了精准、快速、并达到可大规模检测的目的。

序列表

<110> 苏州大学附属第一医院

<120> 一种HLA-B位点等位基因分型试剂盒及其检测方法

<141> 2020-07-31

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 1

tctcagggtc tcagggtccg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 2

cagccaggcc agcaacaatg 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 3

cccaggctcc cactccat 18

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 4

ggggagtcgt gacctgc 17

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 5

ggccagggtc tcaca 15

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 6

ggcgacattc tagcgc 16

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 7

agatgcaaag cgcctgaa 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 8

ggctcctgct ttccctga 18