阅读说明：本技术 Hla的一个snp检测试剂盒和检测方法 (HLA single SNP detection kit and detection method ) 是由 郑仲征 杜可明 贺青青 徐祥 袁志阳 于 2020-11-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种HLA的一个SNP检测试剂盒和检测方法。其中所述HLA的一个SNP检测试剂盒包括引物一、引物二、探针一以及探针二；所述HLA的一个SNP检测方法包括以下步骤：获得待测样品的基因组DNA,利用所述引物一、所述引物二、所述探针一和所述探针二,以所述基因组DNA为模板,进行荧光PCR扩增,收集并分析荧光信号,从而获取HLA的一个SNP等位基因扩增量的比值。本发明HLA的一个SNP检测试剂盒和检测方法提高了检测HLA的一个SNP的准确性和灵敏度。(The invention discloses an SNP detection kit and a detection method of HLA. The SNP detection kit of the HLA comprises a first primer, a second primer, a first probe and a second probe; the SNP detection method of the HLA comprises the following steps: and obtaining the genome DNA of a sample to be detected, performing fluorescence PCR amplification by using the first primer, the second primer, the first probe and the second probe and taking the genome DNA as a template, and collecting and analyzing a fluorescence signal so as to obtain the ratio of the amplification amount of one SNP allele of the HLA. The SNP detection kit and the detection method of the HLA improve the accuracy and the sensitivity of detecting one SNP of the HLA.)

HLA的一个SNP检测试剂盒和检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种HLA的一个SNP检测试剂盒和HLA的一个SNP检测方法。

背景技术

非亲属供体造血干细胞的人类白细胞抗原(HLA)与患者的HLA不匹配，导致非亲属供体造血干细胞的移植存在危及生命的风险，这因此限制了造血干细胞移植在血液病治疗领域的广泛应用。研究显示，上述HLA的不匹配可能与高度多态性的主要组织相容性复合体(MHC)的遗传变异有关。随后，研究人员在这个MHC中发现了单核苷酸多态性(SNP)，SNP进一步被确定是影响造血干细胞移植后效果的决定因素。也即，患者的SNP与供体的SNP的不匹配，提高了患者接受非亲属供体造血干细胞移植后的死亡风险。而且，患者接受非亲属供体造血干细胞移植后的死亡风险随着不匹配的SNP数量的增加而提高。因此，了解HLA的SNP含量，有助于在非亲属供体造血干细胞移植前评估移植的风险；并可以根据SNP的含量，来合理选择MHC更加匹配的非亲属供体干细胞来降低术后并发症。

HLA的rs429916 SNP是人染色体chr6:33010810(GRCh38.p12)上的一个二等位多态性的SNP位点，所述位点的变异是A或C的转换(在其互补链上则为T或G)。所述rs429916SNP的基因型是AA、AC(CA)或CC。所述AA是双链rs429916 SNP的位点均为A的纯合型，所述CC是双链rs429916 SNP的位点均为C的纯合型，所述AC(CA)是一条rs429916 SNP链的位点为A，另一条 rs429916 SNP链的位点为C的杂合型。

目前临床应用的检测HLA的SNP方法包括直接测序法，PCR-基因芯片法和PCR-溶解曲线法，上述三种检测方法的准确性和灵敏度较低。

上述内容仅用于辅助理解发明的技术方案，并不代表承认上述内容是现有技术。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种HLA的一个SNP检测试剂盒和检测方法，旨在提高检测HLA的rs429916 SNP的准确性和灵敏度。

为实现上述目的，第一方面，本发明提出一种HLA的一个SNP检测试剂盒，包括：

引物一，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

引物二，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

探针一，包括如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列一和分别连接所述核苷酸序列一5’端和3’端的荧光基团；以及

探针二，包括如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列二和分别连接所述核苷酸序列二5’端和3’端的荧光基团。

可选地，所述核苷酸序列一的5’端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列一的3’端连接NFQ-MGB荧光基团；所述核苷酸序列二的5’端连接VIC荧光基团，所述核苷酸序列二的3’端连接NFQ-MGB荧光基团。

第二方面，本发明还提出一种HLA的一个SNP检测方法，包括以下步骤：

(1)获得待测样品的基因组DNA；

(2)利用引物一、引物二、探针一和探针二，以所述基因组DNA为模板，进行荧光PCR扩增，并收集荧光信号；

(3)分析所述荧光信号的强度，获取HLA的一个SNP等位基因的扩增量的比值；

其中，所述引物一的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述引物二的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针一包括如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列一和分别连接所述核苷酸序列一5’端和3’端的荧光基团；所述探针二包括如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列二和分别连接所述核苷酸序列二5’端和 3’端的荧光基团。

可选地，所述核苷酸序列一的5’端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列一的3’端连接NFQ-MGB荧光基团；所述核苷酸序列二的5’端连接VIC荧光基团，所述核苷酸序列二的3’端连接NFQ-MGB荧光基团。

本发明HLA的一个SNP检测试剂盒包括特异性地引物一、引物二、探针一以及探针二；本发明HLA的一个SNP检测方法，通过获得待测样品基因组 DNA，利用所述引物一、所述引物二、所述探针一和所述探针二，以所述基因组DNA为模板，进行荧光PCR扩增，收集并分析荧光信号，从而获取HLA 的一个SNP等位基因的扩增量的比值。通过所述引物一和所述引物二分别特异性地扩增rs429916 SNP的序列，所述探针一特异性地检测rs429916 SNP的一单拷贝，所述探针二特异性地检测rs429916 SNP的另一单拷贝；如此，提高了检测的准确性和灵敏度。而且，本发明检测试剂盒和检测方法的操作简单，大大缩短了检测时间，节省了大量的人力和物力，具有广泛的临床应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为实施例一的检测结果图；

图2为实施例二的检测结果图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提出一种HLA的一个SNP检测试剂盒，包括引物一、引物二、探针一以及探针二，所述引物一核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述引物二核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针一包括如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列一和分别连接所述核苷酸序列一5’端和3’端的荧光基团；所述探针二包括如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列二和分别连接所述核苷酸序列二5’端和3’端的荧光基团。

在本发明中，通过引物设计软件(例如Primer Premier 5)，以HLA的 rs429916SNP序列为模板，设计所述引物一、所述引物二、所述探针一和所述探针二的序列。所述引物一、所述引物二、所述探针一和所述探针二的序列请参阅表1。所述引物一和所述引物二的Tm值均在60℃附近，这样尽量避免引物二聚体的产生；所述探针一和所述探针二的Tm值均在70℃附近，这样尽量避免所述探针一和所述探针二与其他非特异性序列之间的结合，同时也避免所述探针一和所述探针二之间形成复杂的二聚体；如此，提高了荧光 PCR的扩增特异性。

所述引物一为扩增rs429916 SNP序列的上游引物，所述引物二为扩增 rs429916SNP序列的下游引物。所述探针一从5’端到3’端的第十个碱基为C (红色标出)，所述探针二从5’端到3’端的第十个碱基为A(红色标出)，从而对rs429916 SNP的三种基因分型AA、AC(CA)、CC进行检测。

表1引物一、引物二、探针一和探针二的序列

序列名	Tm	序列(5’-3’)
			SEQ ID No.1	52.2℃	GTTTCTAGTCCACAGTGTCTACG
SEQ ID No.2	58.6℃	TAACCAGGGCAGGACCAAAG
			SEQ ID No.3	67℃	CTAGCACATCATAGGC
SEQ ID No.4	67℃	CTAGCACATAATAGGC

可选地，所述核苷酸序列一的5’端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列一的3’端连接NFQ-MGB荧光基团；所述核苷酸序列二的5’端连接VIC荧光基团，所述核苷酸序列二的3’端连接NFQ-MGB荧光基团。即，所述探针一的5’端连接FAM荧光基团，3’端连接NFQ-MGB荧光基团；所述探针二的5’端连接VIC荧光基团，3’端连接NFQ-MGB荧光基团。MGB探针与普通的TaqMan探针相比，为非荧光淬灭基团，可大大降低本底信号强度，并具有更高的特异性。

第二方面，本发明还提出一种HLA的一个SNP检测方法，包括以下步骤：

(1)获得待测样品基因组DNA；

(2)利用引物一、引物二、探针一和探针二，以所述基因组DNA为模板，进行荧光PCR扩增，并收集荧光信号；

(3)分析所述荧光信号的强度，获取HLA的一个SNP等位基因的扩增量的比值；

其中，所述引物一的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述引物二的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针一包括如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列一和分别连接所述核苷酸序列一5’端和3’端的荧光基团；所述探针二包括如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列二和分别连接所述核苷酸序列二5’端和 3’端的荧光基团。

可选地，所述核苷酸序列一的5’端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列一的3’端连接NFQ-MGB荧光基团；所述核苷酸序列二的5’端连接VIC荧光基团，所述核苷酸序列二的3’端连接NFQ-MGB荧光基团。

所述引物一、所述引物二、所述探针一和所述探针二的信息，前文已经介绍，在此不再赘述。

检测HLA的rs429916 SNP的具体步骤如下：

1)采用DNA提取试剂盒(例如，Qiagen，货号：69506)，按照试剂盒说明书提取待测样品的DNA；

2)按照表2中的荧光PCR检测体系配置荧光PCR反应液，然后按照表 3中的荧光PCR反应程序在荧光PCR仪中进行荧光PCR反应；

3)收集所述荧光PCR仪检测到的荧光信息，使用美国应用生物学技术公司开发的基因分型专业分析软件TaqMan Genotyper对荧光数据进行分析，得到HLA的rs429916 SNP的基因分型结果。

表2荧光PCR检测体系

表3荧光PCR反应程序

本发明HLA的一个SNP检测试剂盒包括特异性地引物一、引物二、探针一以及探针二；本发明HLA的一个SNP检测方法，通过获得待测样品基因组 DNA，利用所述引物一、所述引物二、所述探针一和所述探针二，以所述基因组DNA为模板，进行荧光PCR扩增，收集并分析荧光信号，从而获取HLA 的一个SNP等位基因的扩增量的比值。通过所述引物一和所述引物二分别特异性地扩增rs429916 SNP的序列，所述探针一特异性地检测rs429916 SNP的一单拷贝，所述探针二特异性地检测rs429916 SNP的另一单拷贝；如此，提高了检测的准确性和灵敏度。而且，本发明检测试剂盒和检测方法的操作简单，大大缩短了检测时间，节省了大量的人力和物力，具有广泛的临床应用价值。

实施例一

本发明采用已知HLA的rs429916 SNP基因型别的47个DNA样本，来验证本发明检测试剂盒和检测方法的准确性。请参阅图1，图1中左上方区域 (黑色圆圈)为CC型纯合子样本的结果；图1中右边区域(浅灰色圆圈)为 AC(CA)型杂合子样本的结果；图1中左下方区域(黑色方形)为空白对照的结果。本实施例同样对47个所述DNA样本进行一代测序，实验结果显示，本发明的检测结果、一代测序的检测结果与已知结果均为一致，说明本发明检测HLA的rs429916 SNP基因分型的准确性和特异性较高。

实施例二

本发明进而以已知HLA的rs429916 SNP基因型别的5个临床DNA样本为模板，检测本发明检测试剂盒和检测方法的检测灵敏度。5个所述临床DNA 样本的加样量接近临床检测下限，为20ng；检测时间按临床检测标准，连续检测5天。

请参阅图2，图2中左上方区域(黑色圆圈)为CC型纯合子样本的结果；图2中中间区域(浅灰色圆圈)为AC(CA)型杂合子样本的结果；图2中左下方区域(浅灰色方形)为空白对照的结果。本发明的检测结果与已知结果一致，本发明检测使用的模板量为20ng，接近临床检测下限，说明本发明检测方法的灵敏度较高。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海荻硕贝肯医学检验所有限公司

深圳荻硕贝肯精准医学有限公司

上海荻硕贝肯生物科技有限公司

上海荻硕贝肯基因科技有限公司

<120> HLA的一个SNP检测试剂盒和检测方法

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<170> PatentIn version 3.3

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