阅读说明：本技术 一种用于抑制腐败希瓦氏菌的抗菌剂及其制备方法和在南美白对虾保鲜剂制备中的应用 (Antibacterial agent for inhibiting Shewanella putrefaciens, preparation method thereof and application of antibacterial agent in preparation of litopenaeus vannamei preservative ) 是由 王靖 王鸿飞 许凤 邵兴锋 韦莹莹 于 2019-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于抑制腐败希瓦氏菌的抗菌剂及其在南美白对虾保鲜剂制备中的应用,特点是该抗菌剂为费菜总黄酮,所述的费菜总黄酮主要含有槲皮甙和没食子酸,还含有少量的山奈酚、槲皮素和异槲皮苷,其中槲皮甙的含量为35-50%总重量,没食子酸的含量为30-40%总重量,上述用于抑制腐败希瓦氏菌的抗菌剂在南美白对虾保鲜剂制备中的应用,该南美白对虾保鲜剂由以下原料及其重量份数组成：费菜总黄酮4份、蓝莓叶多酚2份、N-乙酰-L-半胱氨酸3.2份和水1000份,优点是能有效防治南美白对虾黑变腐败,提高其货架期。(The invention discloses an antibacterial agent for inhibiting Shewanella putrefaciens and an application thereof in preparation of a Penaeus vannamei preservative, which is characterized in that the antibacterial agent is general fern, the general fern mainly contains quercitrin and gallic acid, and also contains a small amount of kaempferol, quercetin and isoquercitrin, wherein the content of the quercitrin is 35-50% of the total weight, and the content of the gallic acid is 30-40% of the total weight, the antibacterial agent for inhibiting Shewanella putrefaciens is applied in the preparation of the Penaeus vannamei preservative, and the Penaeus vannamei preservative is composed of the following raw materials in parts by weight: 4 parts of sedum aizoon total flavone, 2 parts of blueberry leaf polyphenol, 3.2 parts of N-acetyl-L-cysteine and 1000 parts of water, and has the advantages of effectively preventing and treating the blackening and the putrefaction of the penaeus vannamei boone and prolonging the shelf life of the penaeus vannamei boone.)

一种用于抑制腐败希瓦氏菌的抗菌剂及其制备方法和在南美 白对虾保鲜剂制备中的应用

技术领域

本发明涉及一种腐败希瓦氏菌的抗菌剂，尤其是涉及一种用于抑制腐败希瓦氏菌的抗菌剂及其在南美白对虾保鲜剂制备中的应用。

背景技术

南美白对虾，因其营养丰富和肉质细嫩而深受消费者喜爱，然而南美白对虾属易腐食品，在捕捞、运输、加工及贮藏过程中极易受细菌侵袭而腐败变质。特别是在其死亡后，在体内多酚氧化酶（PPO）的作用下，极易导致黑变，在感官上达到消费者不能接受的地步，造成了极大的资源浪费。腐败希瓦氏菌作为南美白对虾腐败变质过程中的优势腐败菌，是一种兼性厌氧型革兰氏阴性运动杆菌，在自然界分布广泛，对生长环境中的盐度和温度耐受性极强，产生具有强烈的腐败异臭味的代谢产物，是南美白对虾腐败后异味的主要来源。由于抗生素的滥用，腐败希瓦氏菌已被报道对卡那霉素、头孢、四环素等抗生素产生了耐药性，在水生环境中或保鲜过程中使用抗生素的可行性正在下降。而化学杀菌剂在食物中的累积作用正在迫使人类放弃这种控制微生物增长的方式。目前研究者们将抗菌类物质的研究重点放在不易产生耐药性且对人体无害的天然产物上。

南美白对虾的保鲜通常利用物理、化学、生物等方法，最大限度地保证虾的新鲜程度。其中传统的保鲜方法如低温保藏、化学防腐剂保藏因其方法在其抑菌性和安全上的局限性已远远不能满足人们的要求，生物保鲜剂因其抑菌性强、安全性高，在使用过程中不会改变食品原有的风味和品质，开始越来越多地在南美白对虾保鲜中应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于抑制腐败希瓦氏菌的抗菌剂及其在南美白对虾保鲜剂制备中的应用，该保鲜剂能有效防治南美白对虾黑变腐败，提高其货架期。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种用于抑制腐败希瓦氏菌的抗菌剂，该抗菌剂为费菜总黄酮，所述的费菜总黄酮主要含有槲皮甙和没食子酸，还含有少量的山奈酚、槲皮素和异槲皮苷，其中槲皮甙的含量为35-50%总重量，没食子酸的含量为30-40%总重量。

2、一种用于抑制腐败希瓦氏菌的抗菌剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）采用乙醇超声波辅助提取法得提取液；

（2）将步骤（1）所得提取液浓缩，并添加无水乙醇；

（3）将步骤（2）所得溶液低温处理后，取上清液；

（4）将步骤（3）所得上清液浓缩，并采用大孔树脂法吸附，弃上清液，再用乙醇溶液解析，取上清液；

（5）将步骤（4）所得上清液浓缩，得到费菜总黄酮提取物，经冷冻干燥为成品。

具体步骤如下：

（1）取经烘干粉碎过60目筛的费菜粉1000 g，加入40 L 70%乙醇溶液，匀浆，超声波辅助提取，超声时间为60 min，超声温度为60 ℃，然后浸提2 h，浸提温度为60 ℃，过滤取上清液；

（2）将步骤（1）所得上清液进行减压浓缩，回收溶剂，加热温度为45-50℃，浓缩完毕后加浓缩液两倍体积的无水乙醇；

（3）将步骤（2）所得溶液，于4℃低温处理24 h，过滤，去沉淀，取上清液；

（4）将步骤（3）所得上清液进行减压浓缩，回收溶剂，加热温度为45-50℃；将浓缩液加入到20%乙醇溶液中将其稀释为黄酮浓度为2.5 mg/mL的费菜提取溶液，然后加入经酸、碱、醇处理至完全溶胀的大孔树脂静态吸附24 h后，过滤弃滤液，加入与20%乙醇溶液相同体积的80%乙醇溶液进行解析，解析完毕后，过滤取上清液，其中费菜提取溶液与大孔树脂比例为10mL：1g；

（5）将步骤（4）所得上清液进行减压浓缩，回收溶剂，加热温度为45-50℃，得到的浓缩液，即为费菜总黄酮，冷冻干燥后备用。

3、一种用于抑制腐败希瓦氏菌的抗菌剂的检测方法，具体步骤如下：将上述制备得到的费菜总黄酮，用甲醇溶解经冷冻干燥后的费菜总黄酮粉末，经0.22 μm滤膜过滤，作为样品溶液，采用超高效液相色谱-电喷雾质谱法检测费菜总黄酮的成分：

色谱柱为Angilent Zorbax XDB-C18柱，流动相为A相：甲醇和B 相：0.1% 甲酸溶液，流速为0.8 mL/min，进样量为10 μL，柱温25℃，检测波长为254 nm，线性梯度洗脱程序为：0-5min，70%-30% A；5-18 min，30%-10% A；

离子源：ESI；扫描范围：100~1200 m/z；毛细管电压：2.50 KV；锥孔电压：50.00 V；锥孔气流量：50 L/h；提取电压：2.00V；离子源温度：125℃；脱溶剂气温度：250℃；脱溶剂气流量：400 L/h。

上述用于抑制腐败希瓦氏菌的抗菌剂在南美白对虾保鲜剂制备中的应用。

所述的南美白对虾保鲜剂由以下原料及其重量份数组成：费菜总黄酮 4 份、蓝莓叶多酚 2 份、N-乙酰-L-半胱氨酸 3.2 份和水1000份。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、本发明提供了一种能够明显抑制腐败希瓦氏菌的天然生物抗菌剂，通过体外试验证明费菜总黄酮具有抑菌性强，作用高效，安全性高且营养等特点。

2、本发明提供的费菜总黄酮提取物的制备工艺能有效地富集总黄酮，提取率为10%左右；去除蛋白质多糖等杂质，其总黄酮含量高，纯度为67%左右，该制备提取及分析方法高效简单易控且工艺成本较低。

3、本发明首次将费菜总黄酮应用于水产品保鲜应用当中，根据南美白对虾的生化特性设计了一种以费菜总黄酮为主要原料的生物保鲜剂。所述保鲜剂中费菜总黄酮对蓝莓叶多酚和N-乙酰-L-半胱氨酸均具有协同增效作用，三者混合使用时，兼具有延缓对虾腐败和黑变的作用，且比单一使用效果更好。经本发明所述保鲜剂处理后的对虾，能够相对延长货架期6~7天，同时，费菜总黄酮和蓝莓叶多酚属天然提取成分对人体健康安全，原料易得，成本低廉，所述保鲜剂是一种高效，安全，廉价的复合保鲜剂。

附图说明

图1为本发明方法制备的费菜总黄酮的液相色谱分析图；

图2为本发明方法制备的费菜总黄酮不同时间下对腐败希瓦氏菌杀菌活性抑制图；

图3为本发明方法制备的费菜总黄酮对腐败希瓦氏菌胞内活性氧含量测试的流式峰图，横坐标是荧光强度，纵坐标是细胞数；

图4为本发明方法制备的费菜总黄酮对腐败希瓦氏菌胞内钙离子含量测试的流式峰图，横坐标是荧光强度，纵坐标是细胞数。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一、实验方法

1、费菜总黄酮含量的测定方法：

以槲皮甙为对照品，采用氯化铝法进行黄酮含量的测定，标准溶液的配置和标准曲线的绘制：精确称取标准品0.0224 g，用70%乙醇溶液定容至100 mL的容量瓶中，此时标准溶液的浓度为0.224 g.L^-1。精密移取标准液0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1 mL于10 mL的比色管中，各加入2 wt%氯化铝溶液1 mL，并用70 %的乙醇溶液定容至刻度线，制得的标准溶液的质量浓度分别为0、0.00448、0.00896、0.01120、0.01344、0.01792、0.02240 g.L^-1。混匀后静置20 min，在275 nm下测其吸光度。以标准溶液的质量浓度为横坐标，以吸光值A为纵坐标作图，进行线性回归分析，得标准曲线为y=34.631 x +0.0016, R²=0.9993。

费菜总黄酮含量的测定：分别吸取1 mL费菜总黄酮提取液用70 %的乙醇溶液定容于100 mL容量瓶中，再分别吸取1 mL定容之后的提取液于10 mL的比色管中，以70 %的乙醇溶液为空白对照，各加入1 mL的2wt%氯化铝溶液，用70 %的乙醇定容至刻度线，混匀之后静置20 min，后以空白管调零，在275 nm下测吸光值，根据标准曲线得到提取液中费菜总黄酮的含量。

2、可溶性糖泄露的测定：

分别取一定量对虾保鲜剂加入培养至对数期的腐败希瓦氏菌的菌悬液中，在摇床（120r/min、30 ℃）中继续培养，在以下处理时间点：0、3 h分别取4 mL菌液，3000 g 离心10min，取上清液1 ml，加入4 ml质量浓度为0.2 %的硫酸蒽酮溶液，冰浴下混合均匀，沸水浴10 min，迅速冷却，在620 nm下测定吸光值。将葡萄糖作为标准品绘制标准曲线，含量以μg/mL表示。

3、遗传物质泄露的测定

采用紫外分光光度计法测定腐败希瓦氏菌菌悬液中DNA、RNA大分子含量并稍加修改。分别取一定量对虾保鲜剂加入培养至对数期的腐败希瓦氏菌的菌悬液中，在摇床（120 r/min、30 ℃）中继续培养，在以下处理时间点：0、3 h分别取5 mL菌液，3000 g 离心 10 min，取上清液在260 nm下测定吸光值，绘制A₂₆₀值随时间的变化曲线。

4、可溶性蛋白的测定：

分别取一定量对虾保鲜剂加入培养至对数期的腐败希瓦氏菌的菌悬液中，在以下处理时间点：0、3 h分别取4 mL菌液，3000 g 离心 10 min，取上清液1 ml，用考马斯亮蓝的方法测定其中的可溶性蛋白的含量，静置两分钟后于595 nm处测定其吸光值。将牛血清蛋白作为标准品绘制标准曲线，含量以μg/mL表示。

具体实施例一

1、费菜总黄酮的提取方法

（1）取经烘干粉碎过60目筛的费菜粉1000 g，加入40 L 70%乙醇溶液，匀浆，超声波辅助提取，超声时间为60 min，超声温度为60 ℃，然后浸提2 h，浸提温度为60 ℃，过滤取上清液；

（2）将步骤（1）所得上清液进行减压浓缩，回收溶剂，加热温度为45-50℃，浓缩完毕后加浓缩液两倍体积的无水乙醇；

（3）将步骤（2）所得溶液，于4℃低温处理24 h，过滤，去沉淀，取上清液；

（4）将步骤（3）所得上清液进行减压浓缩，回收溶剂，加热温度为45-50℃，浓缩完毕后采用氯化铝法，在波长275 nm下根据吸光值测得费菜粗提液中黄酮含量；将浓缩液加入到20%乙醇溶液将其稀释为黄酮浓度为2.5 mg/mL的费菜提取溶液，然后加入经酸、碱、醇处理至完全溶胀的AB-8大孔树脂静态吸附24 h后，过滤弃滤液，加入与20%乙醇溶液相同体积的80%乙醇溶液解析，解析完毕后，过滤取上清液，回收大孔树脂，其中费菜提取溶液与大孔树脂比例为10mL：1g；

（5）将步骤（4）所得上清液进行减压浓缩，回收溶剂，加热温度为45-50℃，得到的浓缩液，即为费菜总黄酮，冷冻干燥后备用，同时测其总黄酮含量。经多次试验，提取液中费菜总黄酮的含量为60-80%。

2、费菜总黄酮的成分分析方法

将上述方法提取分离纯化的费菜总黄酮，用甲醇溶解经冷冻干燥后的费菜总黄酮粉末，经0.22 μm滤膜过滤，作为样品溶液。采用超高效液相色谱-电喷雾质谱法检测费菜总黄酮的成分：

色谱柱为Angilent Zorbax XDB-C18柱（4.6×150 mm，5 μm），流动相为甲醇（A）和0.1%甲酸溶液（B），流速为0.8 mL/min，进样量为10 μL，柱温25℃，检测波长为254 nm。线性梯度洗脱程序为：0-5 min，70%-30% A；5-18 min，30%-10% A。

离子源：ESI；扫描范围：100~1200 m/z；毛细管电压：2.50 KV；锥孔电压：50.00 V；锥孔气流量：50 L/h；提取电压：2.00V；离子源温度：125℃；脱溶剂气温度：250℃；脱溶剂气流量：400 L/h。

液相色谱结果如图1所示，经检测分析，费菜总黄酮中所含黄酮成分主要为槲皮甙（保留时间为8.07 min）和没食子酸（保留时间为2.26 min），其中含量最高的为槲皮甙35%~50%重量，其次为没食子酸30%~40%重量。

具体实施例二

1、最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）的测定

采用二倍稀释法稀释具体实施例一制备得到的费菜总黄酮，加入营养琼脂培养基中混匀，分别倒入培养皿，待凝固后，将0.1 mL培养至对数期的腐败希瓦氏菌菌悬液涂布于各培养皿中，以无菌水作为对照，30 ℃培养24 h后，观察菌落生长情况，以完全无菌生长的费菜黄酮浓度最小值为最低抑菌浓度。继续30 ℃培养，待48 h后，以完全无菌落生长的费菜黄酮浓度最小值为最低杀菌浓度。实验结果如下表1和表2所示，

表1费菜黄酮对腐败希瓦氏菌的MIC

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表2费菜黄酮对腐败希瓦氏菌的MBC

注：－表示无细菌生长；+表示有细菌生长（菌落数≤20）；++表示有细菌生长，细菌丛生。

由表可知，费菜总黄酮对腐败希瓦氏菌的最小抑菌浓度为0.675 mg/mL，最小杀菌浓度为2.5 mg/mL，表明在较低浓度下的费菜总黄酮具有明显的抑菌效果，明显低于辣木叶总黄酮对大肠杆菌的最低抑菌浓度6mg/mL和最低杀菌浓度10mg/mL。

2、费菜总黄酮对腐败希瓦氏菌杀菌活性的测定

将腐败希瓦氏菌的菌悬液中加入费菜总黄酮，使黄酮含量达到最低杀菌浓度MBC值，以无菌水作为对照组。在30 ℃，120 r/min摇床培养，分别于选取时间点为0、2、4、6、8、10 h吸取1ml混合液，用无菌水进行梯度稀释，并接种到营养琼脂平板中，37 ℃培养48小时，并对平板进行计数，要求菌落数在30-300 CFU 之间，以横坐标为时间，纵坐标为菌数对数值绘制曲线。

如图2所示，说明费菜总黄酮作用于腐败希瓦氏菌之后不同时间的活菌残余量的变化，表明费菜总黄酮对腐败希瓦氏菌具有明显的杀菌作用，且根据我们之前实验证明费菜黄酮浓度越大，杀菌效果越好。由图2中可知，费菜黄酮的杀菌率随着作用时间的增加而上升。1 MBC浓度下，2 h后费菜黄酮对腐败希瓦氏菌杀菌率达到99.9%以上，且后期抑菌效果达到稳定水平。

3、费菜总黄酮对腐败希瓦氏菌胞内内源性ROS的影响

取一定量具体实施例一制备得到的费菜总黄酮加入培养至对数期的腐败希瓦氏菌菌悬液中，使费菜黄酮的终浓度达到1.0 MIC和1.0 MBC，加入磷酸盐缓冲液（0.1 M，pH 7.2）作为对照组，在摇床（120 r/min、30 ℃）中继续培养。培养0、1 h后取样，3000 g离心10min，PBS洗涤三次，取相同体积菌体，加入终浓度为10 μmol/L的DCFU-DA荧光探针，37 ℃避光反应30 min。采用流式细胞仪检测胞内ROS即内源性ROS水平。

ROS被认为参与了细胞的衰老、凋亡或者癌变，其产生危害主要是由于ROS会造成细胞中的各种生物大分子快速氧化，生物体中的DNA、RNA、脂质和蛋白质等对ROS都很敏感，过量的ROS对这些物质都会造成损伤。其中，脂类物质是氧胁迫损伤的主要对象，自由基直接与细胞膜上的多不饱和脂肪酸反应，引起脂质的过氧化，造成细胞膜流动性的降低，改变了细胞膜的特性，进而破坏细胞膜蛋白。除此之外，DNA也是ROS的主要攻击对象，ROS可损伤DNA中的碱基和糖组分，进而破坏了DNA的双链结构，影响了DNA的正常复制，增加了突变的发生概率。细菌中过量生成ROS后与体内重要生物大分子发生的反应，无一例外都是对细胞有毒性的，都会影响细菌的正常生存。图3中横坐标是荧光强度，纵坐标是细胞数，出峰的迁移量代表着ROS水平的高低，越向右偏移表明胞内ROS含量越多。由图3可知，经费菜总黄酮处理后腐败希瓦氏菌胞内ROS含量大爆发，进而导致细胞膜膜脂过氧化，MDA含量增加，DNA等遗传物质受到不同程度的氧化损伤。

4、费菜总黄酮对腐败希瓦氏菌胞内丙二醛（MDA）含量的影响

取一定量具体实施例一制备得到的费菜总黄酮加入培养至对数期的腐败希瓦氏菌菌悬液中，使费菜总黄酮的终浓度达到1.0 MIC，加入磷酸盐缓冲液（0.1 M，pH 7.2）作为对照组，在摇床（120 r/min、30 ℃）中继续培养。在以下处理时间点：0、1、3 h分别取5 mL菌液，离心（2000 g，10 min）收集菌体，用磷酸盐缓冲液重悬，细胞破碎仪进行破碎后离心（8000g，10 min）取上清液进行测定；取1.0 mL上清液加入5 mL三氯乙酸溶液（5%）混匀，转移2.0mL混合液加入2.0 mL TBA溶液（0.67%）后沸水浴30 min，冰水冷却。于450 nm，532 nm，600nm处分别测定其吸光值，计算MDA含量，结果如下表3所示，

表3费菜总黄酮对腐败希瓦氏菌胞内丙二醛（MDA）含量的影响

丙二醛（MDA）是细胞膜脂质过氧化反应的终产物，细胞中MDA含量的多少可反映细胞脂质过氧化损伤程度。由对照组比较，经费菜总黄酮处理后菌细胞内MDA含量显著上升，且随着时间而显著增加，表明费菜总黄酮刺激腐败希瓦氏菌后，使菌细胞内ROS爆发，进而造成菌细胞内较大程度的氧化损伤，影响细胞代谢等生理活性，进而导致菌死亡。

5、费菜总黄酮对腐败希瓦氏菌胞内钙离子含量的影响

取一定量培养至对数期腐败希瓦氏菌的菌悬液，PBS缓冲液洗涤三次，离心收集细胞，加入终浓度为5 μM的Fluo-3，AM荧光探针，37 ℃避光反应20 min，加入5倍体积的HBSS稀释液，继续培养40 min，然后用HEPES稀释液洗涤三次，完毕后加入费菜总黄酮使费菜黄酮的终浓度达到1.0 MIC和1.0 MBC培养至0、3 h后取样上机，采用流式细胞仪检测胞内钙离子浓度变化。

由图4可知，经费菜总黄酮处理后出峰明显右移，说明费菜黄酮处理后腐败希瓦氏菌胞内钙离子浓度明显增高。研究表明，费菜总黄酮刺激细胞后导致胞内ROS爆发，从而激活了质膜上钙离子通道以及细胞内的钙池，从而钙离子从质外经质膜内流，胞内“钙库”释放向胞液运输钙离子，进而激发相关下游信号。钙离子浓度增加后，会与细胞内的磷酸根产生沉淀，而磷酸根是细胞能量及物质代谢所必须的，除此之外，钙离子浓度过高也会引起细胞内遗传物质表达发生改变，从而导致菌细胞的死亡。

具体实施例三

对虾保鲜处理方法：采集新鲜健康的南美白对虾，充氧加水保活运回，剔除死亡，变色，肢体残缺等异常个体，用无菌水冲洗，放入碎冰中使其猝死，体积之比为1：3；将处理完毕的南美白对虾保鲜剂浸泡，浸泡时间为20 min。沥干浸泡后的南美白对虾残余的保鲜剂，用无菌风辅助沥干，温度要求4℃左右，风速1.5 m/s，沥干后装入无菌保鲜袋内，将处理完毕装袋后的南美白对虾置于4℃培养箱内储藏。其中南美白对虾保鲜剂分别为

本发明处理方法的保鲜剂：由以下原料及其重量份数组成：费菜总黄酮 4 份，蓝莓叶多酚 2份、N-乙酰-L-半胱氨酸 3.2 份和水1000份；

对照组1：对虾保鲜剂由以下原料及其重量份数组成：费菜总黄酮 4 份和水1000份；

对照组2：对虾保鲜剂由以下原料及其重量份数组成：蓝莓叶多酚 2份和水1000份；

对照组3：对虾保鲜剂由以下原料及其重量份数组成：费菜总黄酮 4 份、蓝莓叶多酚 2份、和水1000份；

对照组4：对虾保鲜剂由以下原料及其重量份数组成：N-乙酰-L-半胱氨酸 3.2 份和水1000份；

对照组5：对虾保鲜剂由以下原料及其重量份数组成：费菜总黄酮 4 份、N-乙酰-L-半胱氨酸 3.2 份和水1000份；

空白对照组：无菌水。

1、费菜总黄酮与蓝莓叶多酚单独和共同作用对腐败希瓦氏菌胞内内容物泄露的影响，实验结果如下表4所示：

表 4

表 5

表 6

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细胞膜是细胞结构的重要组成部分之一，它能够协助细胞抵抗外来物质侵入。细菌细胞在遭受诸如外界破坏等不利条件影响的情况下，其细胞膜的流动性会降低，通透性也随之改变，使细胞失去天然的保护屏障。这是因为，细胞膜发生变化的时候，内部电解质、生物大分子如：糖类、蛋白质、核酸等发生泄露。根据这些原理，我们可以通过测定细菌培养液中是否有这些胞内物质，从而判定细菌的完整性。由表4-6可知，各处理组相对于对照组可溶性糖，DNA，RNA等生物大分子以及可溶性蛋白得到很大程度的泄露，且费菜总黄酮和蓝莓叶多酚共同作用对腐败希瓦氏菌完整性的破坏作用远大于各成分单独作用，起到抑菌的协同作用。

协同机理为：蓝莓叶多酚作用于腐败菌富含脂多糖的细胞壁，增加细胞壁的通透性，可以与腐败菌外膜的阳离子结合使细胞壁出现塌陷凹塌等现象，破环腐败菌的细胞壁细胞膜的完整性，从而使费菜黄酮更有利于进入腐败菌体内。费菜黄酮作为非生物性胁迫，通过使细菌胞内ROS含量激增，造成腐败菌内氧化损伤，遗传物质损伤，细胞膜脂质过氧化，MDA含量上升，破坏了磷脂双分子层结构，进一步增加了菌细胞细胞膜的通透性，从而更好破坏了其完整性。激增的ROS进而激活致死下游信号，钙离子浓度增加，其与磷酸根结合，直接影响菌体能量代谢和物质代谢。

2、费菜总黄酮与蓝莓叶多酚单独和共同作用对南美白对虾冷藏期间菌落总数的影响

按照要求将南美白对虾进行前处理，然后浸泡于各种保鲜剂中，采用GB 4789.2-2016的方法进行测定菌落总数。实验结果如下表7所示，

表 7

当菌落总数≤5时为一级鲜度，5~5.7时为二级鲜度，通常认为，当菌落总数≥6时，虾体已不能食用，认为此时为货架期终点。由上表可知，对照组的货架期只有4天左右，费菜总黄酮处理后对虾的货架期在7天左右，经蓝莓叶多酚处理后货架期在6天左右，而两者共同处理后对虾的货架期能够保持货架期10天左右，能够相对延长6~7天，保鲜效果明显优于单一组分。

3、费菜总黄酮与N-乙酰-L-半胱氨酸单独和共同作用对PPO酶活的影响

按照上述方法进行对虾样品处理后，取虾头壳，用液氮处理，0℃磨碎。1 g虾样品与3mL 0.1 mol /L磷酸缓冲液（pH 7.2，并含有1 mol/L氯化钠、0.2% Brij 35和2% PVPP）混合，最后加入1 mL PMSF搅拌均匀，混合物在低温下放置1 h，4℃ 10000 r/min离心15 min。取中层清液，装于离心管储存于超低温冰箱中，测定方法采用L-脯氨酸-邻苯二酚分光光度法，每分钟吸光度改变0.01为一个酶活单位。相对酶活力为所测酶活与最大酶活的比值。实验结果如下表8所示，

表8不同处理方法对PPO酶活的影响

针对于南美白对虾黑变的主要活性酶多酚氧化酶（PPO），能够氧化虾体产生醌类，再进一步反应形成黑色素，对虾死后大量PPO被激活，贮藏期间黑色素不断积累使虾体表面黑斑不断扩大，感官品质受到极大的影响。根据酶活性的高低判断不同溶液对PPO 的抑制能力，从而判断抑制南美白对虾冷藏期间黑变的能力，PPO相对酶活力越低说明抑制黑变的能力越强。由上表8可知，在对虾冷藏期间，费菜总黄酮和N-乙酰-L-半胱氨酸都有抑制PPO酶活的能力，且两个共同使用会对抑制PPO酶活产生协同作用，抑制作用更强。

其原因可能是对虾黑变所需的条件：氧气，PPO，铜离子，底物。费菜总黄酮能够去除环境中的氧，除了能够减缓对虾脂肪的氧化外，还能够改变激活PPO所需的外部条件，主要与PPO产生在外界氧气方面产生竞争性抑制，并且能够螯合PPO活性位点的铜离子，使PPO失活从而抑制黑变。而N-乙酰-L-半胱氨酸是一种巯基供给体，与PPO竞争性抑制和不可逆抑制共存，一方面能够取代铜离子与组氨酸残基紧密结合，从而使PPO失活；另一方面能够与酶促反应的中间产物醌类结合形成稳定的无色化合物，从而抑制对虾的黑变。

4、费菜总黄酮与N-乙酰-L-半胱氨酸单独和共同作用对南美白对虾冷藏期内黑变值的影响

按照上述方法处理好对虾样品后，分别从对照组中随机取对虾置于同一背景的比色板上，黑变评分标准和实验结果如下表9和表10所示，

表9 黑变评分标准

表10对虾黑变实验结果

由上表9和表10可知，费菜总黄酮和N-乙酰-L-半胱氨酸都可以抑制对虾冷藏期间的黑变，并且两者共同作用能够产生协同作用更有效的防黑变效果，从而延长货架期。

5、配方优化实验

按照上述的方法处理对虾样品，其区别在于按照下表配置保鲜剂浸泡虾后，测定其对对虾冷藏期内菌落总数和发生黑变速率的影响。

表 11 对虾保鲜剂中以下各成分的浓度

表 12菌落总数的变化(log(CFU/g))

表13 黑变评价

由上述表11-13可知，在对比例1中，无菌水处理后的虾，贮藏到第2天时，发生轻微黑变，贮藏到第4天时，发生中等黑变且菌落总数已经接近10⁶ CFU/g个，即不可食用，可见，无菌水处理后，对虾的鲜度保持4天，黑变期为2天。与对比例1相比，对比例2~28中，在贮藏期第4~10天才发生黑变，在第6~12天才相继达到货架期终点。可见，经过本发明所述复合保鲜剂处理后的虾，虾的黑变期和货架期分别得到了不同程度的延缓。且由菌落总数的结果可知，N-乙酰-L-半胱氨酸的添加并没有明显增强抑菌效果的作用，从对虾的黑变情况结果可得，蓝莓叶多酚对抑制黑变的作用也不是特别显著。

对比例2~10中，由于费菜总黄酮的含量较少，保鲜效果和防黑变的效果较差。可见，当费菜总黄酮的用量太少时，无法与另外两种成分之间发挥有效的延缓对虾黑变和延长对虾鲜度的协同增效作用，是无法保证本发明所述效果的。

对比例15中，对虾贮藏到第10天时才发生轻微黑变，贮藏到第12天时接近货架期终点，相对于对比例1，延缓黑变7天左右，货架期延长7~8天。

对比例18与例15相比较，区别在于蓝莓叶多酚含量较高，由表可知，贮藏期间菌落总数略下降但差异不显著，黑变程度相近，可见蓝莓叶多酚用量过多并不能延缓对虾黑变和延长对虾的货架期。同理对比例16与例15相比较，区别在于N-乙酰-L-半胱氨酸的含量较多，从表中可知N-乙酰-L-半胱氨酸含量的继续增加并没有显著的降低黑变程度且菌落总数差异不大。对比例24与例15相比较，区别在于例24费菜总黄酮含量较高，由结果可知，例24中菌落总数略有下降但并没有相对多的延长货架期且黑变程度差异不显著，因此出于经济的原则本发明采用例15中各成分所需的含量。

综上所述，本发明所要解决的技术问题在于如何最大限度的降低南美白对虾的黑变速度和减少微生物侵染程度，同时配制低成本，高效，安全营养的生物保鲜剂。通过测定生物保鲜剂对南美白对虾优势腐败菌腐败希瓦氏菌的抑菌效果以及测定南美白对虾经过生物保鲜剂处理后，在冷藏（4℃）过程中菌落总数，PPO相对酶活力，黑变值等指标的变化，来研究延长南美白对虾货架期的有效的生物保鲜方法，为防治南美白对虾的黑变和腐败提供一定的技术支持。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。