阅读说明：本技术 一种虾夷扇贝雌性特异性标记组合及应用 (Patinopecten yessoensis female specific marker combination and application ) 是由 张玲玲 郭振义 李亚娟 刘亮洁 王师 陆维 包振民 于 2019-10-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种虾夷扇贝雌性特异性分子标记组合及应用。本发明雌性特异性分子标记组合的核苷酸片段序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4,上述序列可利用常规PCR扩增进行虾夷扇贝性别鉴定。本发明提供的两对雌性特异性引物,扩增产物大小分别为593bp和477bp。两对引物联合使用,对虾夷扇贝性别鉴定的准确率达100％。该性别检测方法简单,结果准确,对虾夷扇贝性别鉴定和性别调控的研究具有重要意义。(The invention provides a female specific molecular marker combination of Japanese scallops and application thereof. The nucleotide fragment sequences of the female specific molecular marker combination are SEQ ID NO. 1 and SEQ ID NO. 4, and the sequences can be used for carrying out sex identification on the Japanese scallops by utilizing the conventional PCR amplification. The two pairs of female specific primers provided by the invention have amplification product sizes of 593bp and 477bp respectively. The two pairs of primers are used together, and the accuracy rate of the sex identification of the patinopecten yessoensis reaches 100 percent. The sex detection method is simple, has accurate result, and has important significance for the research of sex identification and sex regulation of the patinopecten yessoensis.)

一种虾夷扇贝雌性特异性标记组合及应用

技术领域

本发明属于水产养殖动物性别鉴定技术领域，具体涉及一种虾夷扇贝雌性特异性标记组合及应用。

背景技术

虾夷扇贝属瓣鳃纲、扇贝科、扇贝属，是一种重要的经济贝类，其全球年产值超过15亿美元。我国自1982年开始虾夷扇贝的人工育种，目前虾夷扇贝的人工繁育技术已十分成熟，但是虾夷扇贝的性别鉴定、性别控制技术仍然比较匮乏。开展虾夷扇贝性别鉴定、性别调控的研究有助于推进育种进程，对扇贝养殖业的发展具有重要意义。

目前，虾夷扇贝的性别可以通过三种方法进行鉴定，分别是表型观察法、组织切片法以及基于性别分化基因表达的贝类性别鉴定方法。表型观察法的局限性较大，仅适用于处于生产季节有明显性别二态性虾夷扇贝性别的鉴定；组织观察法操作繁琐，且对性腺处于休止期虾夷扇贝的性别鉴定成功率低；基于性别分化基因表达对虾夷扇贝性别进行鉴定的方法，是通过分析性别差异基因的表达量来判定性别，适用于性腺已分化个体的性别鉴定。

DNA分子标记是鉴定性别的重要工具，在鱼类、虾、鳖等物种中广泛应用。其相比基因表达和形态学方法，不受组织和发育阶段限制，检测手段简单快速，结果准确。开发虾夷扇贝性别特异分子标记，发展简单有效且成本低廉的性别鉴定方法，不仅有利于虾夷扇贝良种培育工作的开展，对贝类性别决定机制的研究也具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种虾夷扇贝雌性特异性标记组合及应用，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种虾夷扇贝雌性特异性标记组合，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4；或SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4的互补序列。

本发明还提供一种检测虾夷扇贝性别的制品，是用于检测上述核苷酸序列为SEQID NO:1和SEQ ID NO:4的标记；

所述的制品，优选为PCR扩增检测试剂盒或PCR扩增测序试剂盒；

本发明再一个方面还提供一种虾夷扇贝性别的检测方法，所述的方法是用于检测上述的核苷酸序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4的标记；

针对SEQ ID NO:1所示序列设计的引物，所述的引物，其上游引物的序列为SEQ IDNO:2,下游引物的序列为SEQ ID NO:3；

针对SEQ ID NO:4所示序列设计的引物，所述的引物，其上游引物的序列为SEQ IDNO:5,下游引物的序列为SEQ ID NO:6。

本发明提供的雌性特异性标记组合，可以利用常规PCR扩增对虾夷扇贝性腺以外的组织进行性别鉴定，经验证准确率达100％。与之前基因表达和形态学方法相比，该技术具有简单、快速，结果准确等优点，有助于虾夷扇贝性控育种和养殖业的发展。

附图说明

图1为虾夷扇贝雌性特异引物FSP1在虾夷扇贝群体遗传性别鉴定的结果示意图。图中个体编号1-12为雌性个体，都能扩增出593bp特异条带，个体编号13-24为雄性个体，均无法扩增出条带，M表示2000bp DNA ladder。

图2为虾夷扇贝雌性特异引物FSP2在虾夷扇贝群体遗传性别鉴定的结果示意图。图中个体编号1-12为雌性个体，都能扩增出477bp特异条带，个体编号13-24为雄性个体，均无法扩增出条带，M表示100bp DNA ladder。

具体实施方式

本发明的虾夷扇贝性别检测方法共包括3个步骤：

1)以获得的雌性特异性序列为模板设计雌性特异性引物；

2)将合成的雌性特异性引物分别对雌雄虾夷扇贝基因组DNA进行扩增，检验其扩增效率和准确性，并对扩增体系、退火温度进行优化；

3)对步骤2获得的扩增产物，进行琼脂糖电泳，电泳结果用凝胶成像仪成像并拍照，通过扩增条带确定虾夷扇贝性别。

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。

实施例1：筛选虾夷扇贝性别特异性分子标记

采用经典酚氯仿法提取一个雌性虾夷扇贝闭壳肌的基因组DNA；通过Pabio-Sequel测序仪进行测序，深度为100×；利用Falcon进行序列拼接，获得雌性虾夷扇贝的基因组；通过mauve软件比较雌、雄虾夷扇贝基因组，发现两段只存在于雌性个体，而在雄性个体中不存在的序列，序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示。

实施例2：虾夷扇贝性别的检测

受检样品取材：采集雌性、雄性虾夷扇贝各20只，性别采用表型观察法鉴定：由于取材时性腺处于成熟期，此时雌雄性腺颜色具有明显区别，橙色的为雌性个体，白色的为雄性个体。

DNA提取：采用经典的酚氯仿法提取扇贝闭壳肌的基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳和核酸定量仪对所提的DNA进行质量检测。

引物合成：根据获得的雌性特异性片段设计雌性特异性引物进行扩增。具体引物序列见下表。

PCR扩增：将上述引物分别用于PCR扩增所采集的样品。反应体系为：DNA模板50ng，5×HF buffer 4μL；dNTP(10mM)0.6μL；上游引物(2μM)1μL；下游引物(2μM)1μL；Phusion酶0.2μL；灭菌水补至20μL。PCR反应程序为1,98℃30s；2,98℃,10s；3,60℃,15s；4,72℃,1min；2-4,30个循环；5,72℃,5min；6,4℃保存。

扩增结果检测及性别鉴定：配制1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，扩增出特异性条带为雌性个体，扩增不出特异性条带为雄性个体。FSP1引物扩增出的特异性条带长度为593bp，FSP2引物扩增出的特异性条带长度为477bp。FSP1和FSP2引物联合使用，对虾夷扇贝性别鉴定的准确率达100％。

上面以举例方式对本发明进行了说明，但本发明不限于上述具体实施例。

凡基于本发明所做的任何改动或变型均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种虾夷扇贝雌性特异性标记组合及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 593

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacacaagtc atcttcacct atggagctaa ggtcgtcatc ctcccccacc atttgtcggt 60

tcctttctga aaaaaacccc gcccggtttt aaaagttttc aaaaaaaata caacaaatac 120

agaaaaaaaa tcaaaaataa atatgaagat aatgcatgat ttttgtttca tttttttttt 180

ttttattgat ttttttcatt tcatagacat atacatattg gacatacatc aacatattat 240

acaagtaatt tcaaacacac atcaaataca tacatatatc cacatctgtg ctcctgtctc 300

cacaccgtct caccttcaat tcatataagc cttagtacat aattaggccc acattcctat 360

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atacacatac atacgcacaa cacgcataca tacatactcc acacacactg catatacata 480

catgcatcat tcatacatac atgtacatac atctgcacac atccacgcct atacacatac 540

tgtacaatgc atcacatgta tgcataataa tgcagcatac atatatcgag cgg 593

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacacaagtc atcttcacct a 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgctcgata tatgtatgct 20

<210> 4

<211> 477

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctgtctgtc cgtgaacaat ccttgttatc gctatttctt gagtactggc aggatatttc 60

tcaaatgtca catgtagtct ggttcccctt agtccctaga tgtgcccatt caattttgag 120

tctgatcggg aaaacaaaat ggccgatagg cagccatctt ggattttgac agtttaagat 180

tgttatcgct atctcttgag aagtactgga aggatgtttc tcaaacttca catgtaggtt 240

ccccttagtc cctagttgtg tccatttaat tttgattctg atcgggaaaa caaaatggcc 300

gactggaggc catcttggat tttatcagtt gaagtttgtt atcgctatgt cacagaaagt 360

tcttcttaga tctttcttag aattcatatg aagaattttc ttgttatcaa attgttaaag 420

ggaaatttaa agaataaaga acggaaaagt agagaaaaga tcagtcctac atggaac 477

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gttccatgta ggactgatct t 21