鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记、引物、试剂盒及应用
阅读说明：本技术 鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记、引物、试剂盒及应用 (Molecular marker, primer, kit and application for identifying genetic sex of yellow river carp ) 是由 殷战 翟刚 贾景怡 舒婷婷 贺江燕 娄气永 石闯 于 2021-03-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记、引物、试剂盒及应用。该鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记为从黄河鲤基因组信息中筛选到的雄性特异序列,其存在于黄河鲤的雄性遗传性特征区域(即相当于性别遗传决定型Y的表征),而不出现于雌性黄河鲤基因组中(即对应于XX性别遗传型)。并针对该鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记设计了相应的特异性引物和试剂盒,并基于上述引物和试剂盒,建立了用于黄河鲤遗传性别鉴定的PCR技术,可以快速、准确区分黄河鲤的遗传性别；该鉴别体系可用于对不同生长阶段和不同群体的黄河鲤性别鉴定和筛选,对研究黄河鲤性别决定和分化机制、实现其性别控制具有重要意义。(The invention provides a molecular marker, a primer, a kit and application for identifying the genetic sex of Cyprinus carpiod. The molecular marker for identifying the genetic sex of the yellow river carp is a male specific sequence screened from genome information of the yellow river carp, exists in a male genetic characteristic region of the yellow river carp (namely, the characteristic corresponding to the sex genetic determinant Y), and does not exist in a female yellow river carp genome (namely, the sex genetic determinant XX corresponds). Corresponding specific primers and a corresponding kit are designed aiming at the molecular marker for identifying the genetic sex of the yellow river carp, and a PCR (polymerase chain reaction) technology for identifying the genetic sex of the yellow river carp is established based on the primers and the kit, so that the genetic sex of the yellow river carp can be quickly and accurately distinguished; the identification system can be used for identifying and screening the sex of the yellow river carps in different growth stages and different groups, and has important significance for researching the sex determination and differentiation mechanism of the yellow river carps and realizing the sex control of the yellow river carps.)
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记、引物、试剂盒及应用。
背景技术
鱼类等水产动物的养殖已成为人类获取动物蛋白的一个主要途径，鱼类养殖对世界动物蛋白的持续供给做出了至关重要的贡献。鱼类中广泛存在个体大小和外部形态、颜色特征的两性差异，称为鱼类的两性异形或者性别二态性。不少鱼类在个体大小等重要生产性状上表现出显著的两性异形，而这种生产性状的经济价值与性别密切相关。
例如：黄河鲤雌性的生长速度显著快于雄性(尤其是幼年期后)，使得开发黄河鲤的单性育种与单性养殖技术具有较为重要的经济价值。尽管个体在性别上存在大小差异，但在性腺发育成熟之前，黄河鲤的雌鱼和雄鱼却很难从外部形态上加以区分，胚胎和幼体阶段雌雄鱼形态上更是难以区别，这给其单性育种、养殖以及对研究黄河鲤性别决定和分化机制等相关的遗传学基础研究带来很大的阻碍。
随着分子生物学技术的发展，基于DNA多态性的分子标记被开发出来，如：限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、微卫星标记(microsatellite)和单核苷酸多态性(SNP)等等。一些鱼类的性别特异分子标记已经被开发出来，而不同物种其基因组DNA序列结构不同，其不能对不同种的遗传性别进行鉴定，只能针对不同物种分别进行开发。迄今为止，可以鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记国内外都未见报道。
有鉴于此，有必要设计一种改进的鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记、引物、试剂盒及应用，以解决上述问题。
发明内容
为解决现有依据形态学鉴定方式存在的外观形态难以鉴定区分黄河鲤雌雄性别的问题，本发明的目的在于提供一种鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记、引物、试剂盒及应用，有助于快速准确鉴别黄河鲤遗传性别，为开展黄河鲤单性育种工作以及生殖发育与性别分化遗传学研究建立基础。
为实现上述发明目的，本发明提供了一种鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
作为本发明的进一步改进，所述鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记为黄河鲤雄性特异性序列，其存在于黄河鲤的雄性遗传性特征区域，但在雌性黄河鲤的基因组中缺失。
为实现上述发明目的，本发明还提供了一种用于检测上述鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记的引物。所述引物针对所述鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记的核苷酸序列进行设计，包括上游引物和下游引物；
所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
作为本发明的进一步改进，所述引物的检测过程为：利用所述引物对待测黄河鲤基因组DNA进行PCR扩增，并检测扩增片段的长度；
当扩增片段为一条1209bp的条带时，所述待测黄河鲤含有具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的雄性遗传性特征区域，鉴别为遗传性别为雄性的黄河鲤；
当没有出现扩增条带时，所述待测黄河鲤鉴别为遗传性别为雌性的黄河鲤。
作为本发明的进一步改进，所述PCR扩增的体系为：浓度为50ng/μL的DNA 模板1μL、10×buffer 2μL、浓度为2.5mM的dNTP 1μL、浓度为10μM的上下游引物各0.5μL、浓度为5Units/μL的Taq酶0.3μL，补充水至20μL。
作为本发明的进一步改进，所述PCR扩增的程序为：94℃5min；94℃30s、56℃30s、72℃30s，38个循环；72℃5min延伸。
为实现上述发明目的，本发明还提供了一种用于检测上述鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记的试剂盒，其包括上述引物。
作为本发明的进一步改进，所述试剂盒的检测方法为：利用所述试剂盒对待测黄河鲤基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增片段的长度；基于所述扩增片段的长度，鉴别所述待测黄河鲤的遗传性别；
所述PCR扩增的体系为：浓度为50ng/μL的DNA模板1μL、10×buffer 2μL、浓度为2.5mM的dNTP 1μL、浓度为10μM的上下游引物各0.5μL、浓度为 5Units/μL的Taq酶0.3μL，补充水至20μL；
所述PCR扩增的程序为：94℃5min；94℃30s、56℃30s、72℃30s，38 个循环；72℃5min延伸。
作为本发明的进一步改进，基于所述扩增片段的长度，当扩增片段为一条 1209bp的条带时，所述待测黄河鲤含有具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的雄性遗传性特征区域，鉴别为遗传性别为雄性的黄河鲤；
当没有出现扩增条带时，所述待测黄河鲤鉴别为遗传性别为雌性的黄河鲤。
为实现上述发明目的，本发明还提供了上述鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记，或者上述引物，或者上述试剂盒在黄河鲤遗传性别鉴定中的应用。
本发明的有益效果是：
1、基于黄河鲤是一种雄性异配遗传决定型(即XX/XY性别遗传型)的二倍体养殖鱼类的特性，本发明提供的鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记，为从黄河鲤基因组信息中筛选到的雄性特异序列，其存在于黄河鲤雄性遗传特征性区域，但在雌性黄河鲤的基因组中缺失；本发明还针对该鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记设计了特异性引物和试剂盒，并基于上述引物和试剂盒，建立了用于黄河鲤遗传性别鉴定的PCR扩增技术，可以快速、准确地区分黄河鲤遗传性别；该鉴别体系可用于对不同生长阶段和不同群体的黄河鲤性别鉴定和筛选，对研究黄河鲤性别决定和分化机制、实现其性别控制具有重要意义；有效克服了传统依据形态学鉴定方式存在的外观形态难以鉴定区分黄河鲤雌雄性别的技术缺陷。
2、本发明提供的用于检测鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记而设计的特异性引物和试剂盒，有助于快速准确鉴别黄河鲤遗传性别，为开展黄河鲤单性育种工作以及生殖发育与性别分化遗传学研究建立基础；同时，该引物和试剂盒的制备方法简单可控，检测鉴别结果准确可靠，适用于大规模生产和推广，在黄河鲤遗传性别鉴定领域具有巨大的应用前景。
附图说明
图1为本发明提供的应用上游引物MYC-F和下游引物MYC-R对黄河鲤养殖群体中的12尾同胞/非同胞雄鱼(♂)和12尾同胞/非同胞雌鱼(♀)进行遗传性别鉴定电泳图(M表示DNA分子量标准DL2000 plus)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
另外，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
本发明提供了一种鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
优选的，所述鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记为黄河鲤雄性特异性序列，其存在于黄河鲤的雄性遗传性特征区域，但在雌性黄河鲤的基因组中缺失。
为实现上述发明目的，本发明还提供了一种用于检测上述鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记的引物。所述引物针对所述鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记的核苷酸序列进行设计，包括上游引物和下游引物；
所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述引物的检测过程为：利用所述引物对待测黄河鲤基因组DNA 进行PCR扩增，并检测扩增片段的长度；
当扩增片段为一条1209bp的条带时，所述待测黄河鲤含有具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的雄性遗传性特征区域，鉴别为遗传性别为雄性的黄河鲤；
当没有出现扩增条带时，所述待测黄河鲤鉴别为遗传性别为雌性的黄河鲤。
优选的，所述PCR扩增的体系为：浓度为50ng/μL的DNA模板1μL、10 ×buffer 2μL、浓度为2.5mM的dNTP 1μL、浓度为10μM的上下游引物各0.5μL、浓度为5Units/μL的Taq酶0.3μL，补充水至20μL。
优选的，所述PCR扩增的程序为：94℃5min；94℃30s、56℃30s、72℃30s， 38个循环；72℃5min延伸。
本发明还提供了一种用于检测上述鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记的试剂盒，其包括上述引物。
优选的，所述试剂盒的检测方法为：利用所述试剂盒对待测黄河鲤基因组 DNA进行PCR扩增，检测扩增片段的长度；基于所述扩增片段的长度，鉴别所述待测黄河鲤的遗传性别；
所述PCR扩增的体系为：浓度为50ng/μL的DNA模板1μL、10×buffer 2μL、浓度为2.5mM的dNTP 1μL、浓度为10μM的上下游引物各0.5μL、浓度为 5Units/μL的Taq酶0.3μL，补充水至20μL；
所述PCR扩增的程序为：94℃5min；94℃30s、56℃30s、72℃30s，38 个循环；72℃5min延伸。
优选的，基于所述扩增片段的长度，当扩增片段为一条1209bp的条带时，所述待测黄河鲤含有具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的雄性遗传性特征区域，鉴别为遗传性别为雄性的黄河鲤；
当没有出现扩增条带时，所述待测黄河鲤鉴别为遗传性别为雌性的黄河鲤。
实施例1
本发明实施例1提供了一种鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。所述鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记为黄河鲤雄性特异性序列，其存在于雄性黄河鲤遗传性特征区域，但在雌性黄河鲤的基因组中缺失。
在本实施方式中，所述鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记的筛选过程如下：
S1，黄河鲤基因组测序：对3雌3雄黄河鲤尾鳍组织的DNA进行基因组重测序，构建双末端基因组DNA文库，利用Illumina Novaseq6000测序平台，进行Pair-End 150bp测序。利用SOAPDenovo2(V 2.04)软件以多Kmer 组装策略进行基因组序列组装，根据测序数据的overlap关系和Pair-End关系，将测序数据组装为scaffold序列，经GapCloser后用作后续分析的参考基因组序列。其中雌性基因组(Female)采用3例雌性测序数据合并后进行组装；雄性基因组(Male)采用3例雄性测序数据合并后进行组装。最终分别获得黄河鲤雌性和雄性的参考基因组序列。
S2，测序reads比对：序列比对采用bwa(V 0.7.17-r1188)序列比对软件，分别将雌性样品双端测序序列与雄性样品双端测序序列比对到雌性与雄性参考基因组，比对采用mem比对方法和默认参数，采用python分析进行测序reads的筛选，筛选双端正确比对的测序reads用于后续分析。
S3，雄性特异序列检测：根据筛选后的双端序列比对结果，统计在雄性参考基因组的条件下，筛选符合被所有雄性样品覆盖，而不被任一雌性样品以及雌性混池样品覆盖的序列为雄性特异序列。以此得到一个序列在3尾雄黄河鲤中均出现，但是在3尾雌黄河鲤中均没出现，此序列即雄黄河鲤特异短序列，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2
本发明实施例2提供了一种用于检测上述鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记的引物。针对所述鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记的核苷酸序列进行特异性引物的设计，其包括上游引物和下游引物；
所述上游引物MYC-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述下游引物MYC-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
具体来讲，该引物的核苷酸序列如下所示：
上游引物MYC-F：5’-GAGCATCCACTGTCAACTT-3’；
下游引物MYC-R：5’-ACTCTTCCCAAACACTGATT-3’。
利用所述引物对待测黄河鲤基因组DNA进行PCR扩增，并检测扩增片段的长度，基于所述扩增片段的长度，鉴别所述待测黄河鲤的遗传性别，具体检测鉴别过程为：
P1，待测黄河鲤基因组DNA的提取：取黄河鲤尾鳍组织样品，使用高盐法进行尾鳍基因组DNA提取，并用紫外分光光度计检测DNA浓度，于-20℃冰箱存放备用。
P2，分子特异性标记引物(MYC-F/MYC-R)的PCR扩增：
所述PCR扩增的体系为：浓度为50ng/μL的DNA模板1μL、10×buffer 2μL、浓度为2.5mM的dNTP 1μL、浓度为10μM的上下游引物各0.5μL、浓度为 5Units/μL的Taq酶0.3μL，补充水至20μL。
所述PCR扩增的程序为：94℃5min；94℃30s、56℃30s、72℃30s，38 个循环；72℃5min延伸。
P3，利用上述引物和PCR扩增体系与扩增程序对12尾同胞/非同胞雌性黄河鲤和12尾同胞/非同胞雄性黄河鲤基因组DNA进行PCR扩增。
P4，电泳检测：取8μL PCR产物，用1.5％琼脂糖凝胶电泳(150V，150mA， 10min)，EB染料染色，凝胶成像系统检测，电泳图谱如图1所示。
当扩增片段为一条1209bp的条带时，所述待测黄河鲤含有具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的雄性遗传性特征区域，鉴别为遗传性别为雄性的黄河鲤；
当没有出现扩增条带时，所述待测黄河鲤鉴别为遗传性别为雌性的黄河鲤。
实施例3
本发明实施例3提供了一种用于检测上述鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记的试剂盒，其包括上述引物。
所述试剂盒的检测方法为：利用所述试剂盒对待测黄河鲤基因组DNA进行 PCR扩增，检测扩增片段的长度；基于所述扩增片段的长度，鉴别所述待测黄河鲤的遗传性别，具体过程为：
A1，待测黄河鲤基因组DNA的提取：取黄河鲤尾鳍组织样品，使用高盐法进行尾鳍基因组DNA提取，并用紫外分光光度计检测DNA浓度，于-20℃冰箱存放备用。
A2，试剂盒中的分子特异性标记引物(MYC-F/MYC-R)的PCR扩增：
所述PCR扩增的体系为：浓度为50ng/μL的DNA模板1μL、10×buffer 2μL、浓度为2.5mM的dNTP 1μL、浓度为10μM的上下游引物各0.5μL、浓度为 5Units/μL的Taq酶0.3μL，补充水至20μL。
所述PCR扩增的程序为：94℃5min；94℃30s、56℃30s、72℃30s，38 个循环；72℃5min延伸。
A3，利用上述引物和PCR扩增体系与扩增程序对12尾同胞/非同胞雌性黄河鲤和12尾同胞/非同胞雄性黄河鲤基因组DNA进行PCR扩增。
A4，电泳检测：取8μLPCR产物，用1.5％琼脂糖凝胶电泳(150V，150mA， 10min)，EB染料染色，凝胶成像系统检测，电泳图谱如图1所示。
当扩增片段为一条1209bp的条带时，所述待测黄河鲤含有具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的雄性遗传性特征区域，鉴别为遗传性别为雄性的黄河鲤；
当没有出现扩增条带时，所述待测黄河鲤鉴别为遗传性别为雌性的黄河鲤。
综上所述，本发明提供了一种鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记、引物、试剂盒及应用。基于黄河鲤是一种雄性异配遗传决定型(即XX/XY性别遗传型)的二倍体养殖鱼类的特性，该鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记为从黄河鲤基因组信息中筛选到的雄性特异序列，其存在于黄河鲤的雄性遗传性特征区域(即相当于性别遗传决定型Y的表征)，而不出现于雌性黄河鲤基因组中(即对应于XX性别遗传型)。并针对该鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记设计了相应的特异性引物和试剂盒，并基于上述引物和试剂盒，建立了用于黄河鲤遗传性别鉴定的PCR技术，可以快速、准确地区分黄河鲤的遗传性别；该鉴别体系可用于对不同生长阶段和不同群体的黄河鲤性别鉴定和筛选，对研究黄河鲤性别决定和分化机制、实现其性别控制具有重要意义。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
SEQ ID NO.1
GAGCATCCACTGTCAACTTTTATCTGTGCTCAGCCCTTATTGTTTTCTCC AGTGAAAACATTAGCCTAACATTTAAATTTAAAGATAATTTTATCTAAA AATCTGAGTTGATGCAAAGGAGATTACATTATTCAACATATTATGACAT CTGATCAACATCTGTGAATCTGAGCTGATTTGACAGAAGAGTTGTGAA ATGTTATGATAACAAATCAAGAAAATATTTTTTACGATGCAATGACAG ACAGCATTCAGTCAATTAAACTGCTGTAATCAGAGTGAATGACAGACACAGAAACAACATGTGGAGATATTGACCCAGCAGCTGTTTATGGCATTT ATAGAGTAAAGGAATTGTGTTTTTTTTATGTCACTTTGACTTATAGAAG TATATTTTGGTCTTTGCCCTCCTGAAGCCAGTGCTTCTTGTTTAAGTTCA GTATCCTATGCTATGAGTTATTAATAAAACGATTGACAGTGACCTTGTT GTTTGTGGTGCTGTGGACAAACTAGTGCTCTTTAAATCCTTATTATTGTT GTGTCCCTGCAGGAGCTGTATCGGATACAAGGCCCTGATGTGTTTTCAG GTTTGAAAATGTGTAATGCGCACCGTACTGCCTTTTTTTGTTTTATTTTT ATTTTGTTTTATGTTGTTTACCAAATCAGCTGTCCATTTGCATTTATACT TGTCTCTTCTCTTTTTTTCAGTTCTTTTAGTTCCTATTTCCTTCAGTGATT TAGTTGTTCATTATAAATGCTTAATTATCACTTAATCACACAGTGACAG GACACAGATCGAGAAAGATCACAACTCTGCTTAACATGTAATAACATT CACACATTGTGAAGAACCTTGAGATTAAATATTACTATTAATAGACAA ATGATTATAGTTCACTATGACAAATCACACAAACCAGTCCAGCTTGCA ATGAAATAATTCTATAAGTTAAACACTGTTGGATCAGCCTCATAAAAAT GCTGCCTGTTTAGACTTCTTTTGGAAAACTTTTTTTTTTTACCTTTTCAC CGAAACCTGCTTGACTTAAATAAATGAATGTGTTGAAACATTGAGTTTT AAGTCTTTTGTTTTTATGTATTCATATCATAAATATTTAATTAGCTGATC AGCACAGTCCGTAAGAGCTATAGGGCTGATCTCAGAAACATTGAGTTT ATTTTTAACATGAATCAGTGTTTGGGAAGAGT
SEQ ID NO.2
GAGCATCCACTGTCAACTT
SEQ ID NO.3
ACTCTTCCCAAACACTGATT。
序列表
<110> 中国科学院水生生物研究所
<120> 鉴别黄河鲤遗传性别的分子标记、引物、试剂盒及应用
<141> 2021-03-15
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1209
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagcatccac tgtcaacttt tatctgtgct cagcccttat tgttttctcc agtgaaaaca 60
ttagcctaac atttaaattt aaagataatt ttatctaaaa atctgagttg atgcaaagga 120
gattacatta ttcaacatat tatgacatct gatcaacatc tgtgaatctg agctgatttg 180
acagaagagt tgtgaaatgt tatgataaca aatcaagaaa atatttttta cgatgcaatg 240
acagacagca ttcagtcaat taaactgctg taatcagagt gaatgacaga cacagaaaca 300
acatgtggag atattgaccc agcagctgtt tatggcattt atagagtaaa ggaattgtgt 360
tttttttatg tcactttgac ttatagaagt atattttggt ctttgccctc ctgaagccag 420
tgcttcttgt ttaagttcag tatcctatgc tatgagttat taataaaacg attgacagtg 480
accttgttgt ttgtggtgct gtggacaaac tagtgctctt taaatcctta ttattgttgt 540
gtccctgcag gagctgtatc ggatacaagg ccctgatgtg ttttcaggtt tgaaaatgtg 600
taatgcgcac cgtactgcct ttttttgttt tatttttatt ttgttttatg ttgtttacca 660
aatcagctgt ccatttgcat ttatacttgt ctcttctctt tttttcagtt cttttagttc 720
ctatttcctt cagtgattta gttgttcatt ataaatgctt aattatcact taatcacaca 780
gtgacaggac acagatcgag aaagatcaca actctgctta acatgtaata acattcacac 840
attgtgaaga accttgagat taaatattac tattaataga caaatgatta tagttcacta 900
tgacaaatca cacaaaccag tccagcttgc aatgaaataa ttctataagt taaacactgt 960
tggatcagcc tcataaaaat gctgcctgtt tagacttctt ttggaaaact tttttttttt 1020
accttttcac cgaaacctgc ttgacttaaa taaatgaatg tgttgaaaca ttgagtttta 1080
agtcttttgt ttttatgtat tcatatcata aatatttaat tagctgatca gcacagtccg 1140
taagagctat agggctgatc tcagaaacat tgagtttatt tttaacatga atcagtgttt 1200
gggaagagt 1209
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagcatccac tgtcaactt 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actcttccca aacactgatt 20