一种用于鹌鹑性别鉴定的pcr引物、试剂盒及其方法
阅读说明：本技术 一种用于鹌鹑性别鉴定的pcr引物、试剂盒及其方法 (PCR primer, kit and method for sex identification of quail ) 是由 高玉时 贾晓旭 陆俊贤 唐修君 樊艳凤 顾荣 张静 葛庆联 姬改革 黄胜海 张小 于 2021-01-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种用于鹌鹑性别鉴定的PCR引物、试剂盒及其方法,所述鹌鹑性别鉴定用PCR引物序列如SEQ ID NO.1和/SEQ ID NO.2所示。通过本发明的PCR引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳,利用电泳结果的条带数来确定鸭、鸡、鸽、番鸭、鹅或鹌鹑的性别,具有操作简单方便,鉴别结果快速准确,便于基层推广和使用,具有广阔的市场应用前景,此外,基于本发明方法开发的检测试剂盒,可产生可观的经济效益和良好的社会价值。(The invention provides a PCR primer, a kit and a method for quail sex identification, wherein the PCR primer sequence for quail sex identification is shown as SEQ ID NO.1 and/or SEQ ID NO. 2. The PCR primer is used for PCR amplification and agarose gel electrophoresis, and the sex of the duck, chicken, pigeon, Muscovy duck, goose or quail is determined by the number of bands of the electrophoresis result, so that the method has the advantages of simple and convenient operation, quick and accurate identification result, convenience for basic popularization and use, wide market application prospect, and considerable economic benefit and good social value based on the detection kit developed by the method.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于鹌鹑性别鉴定的PCR引物、试剂盒及其方法。
背景技术
商业化家禽品种大都是以配套系模式生产的，父系一般生长速度较快，母系一般繁殖效率较高，因此都需要早期进行性别鉴定，父系要提前淘汰母雏，母系要提前淘汰公雏。肉用型家禽的公禽一般生长速度较快，公母分群饲养，养殖效益会更好。蛋用型家禽出雏时只保留母雏，公雏直接淘汰。因此家禽早期性别鉴定在生产中具有重要的意义。
目前家禽早期的性别鉴定除了伴性遗传(金银色羽、横斑羽、快慢羽)等方法外，主要通过翻肛观察生殖突起进行鉴别。但翻肛鉴别须在雏禽出生24小时内进行，超过这个时间段，雏禽肛门难以翻开，生殖突起萎缩甚至陷入泄殖腔深处，不便观察翻肛鉴别劳动强度大、工作环境差、专业性高，误鉴率也较高。
因此，需要开发一种简单方便，能够快速、准确鉴别家禽性别的方法。
发明内容
本发明目的在于解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种设计合理，可用于家禽早期性别快速鉴定的PCR引物。
本发明通过以下技术方案实现本发明的目的：
本发明目的之一在于提供一种性别鉴定用PCR引物，所述引物序列如SEQ IDNO.1/SEQ ID NO.2所示。即所述引物的核苷酸序列为：
正向引物(SEQ ID NO.1)：5'-ATGAAAGAGTTTCAGCACTTGA-3'；
反向引物(SEQ ID NO.2)：5'-TTCATAATAGGAGCTCGAGCCA-3'。
本发明目的之二在于提供包含本发明所述的性别鉴定用PCR引物的试剂盒。
在本发明的一种实施例中，本发明所述的试剂盒包含本发明所述的PCR引物、PCR反应液，在一些实施例中，还可以包含DNA提取液。
本发明目的之三在于提供本发明所述的PCR引物或本发明所述的试剂盒在养殖业中的应用。
本发明目的之四在于提供本发明所述的PCR引物或本发明所述的试剂盒在鸭性别鉴定中的应用。
本发明所述的在鸭性别鉴定中的应用，通过本发明所述的引物进行PCR扩增，电泳结果呈现1147bp一条带的为公鸭，呈现1147bp和851bp的两条带时为母鸭。
本发明目的之五在于提供本发明所述的PCR引物或本发明所述的试剂盒在鸡性别鉴定中的应用。
本发明所述的在鸡性别鉴定中的应用，通过本发明所述的引物进行PCR扩增，电泳结果呈现983bp一条带的为公鸡，呈现983bp和798bp的两条带时为母鸡。
本发明目的之六在于提供本发明所述的PCR引物或本发明所述的试剂盒在鸽性别鉴定中的应用。
本发明所述的在鸽性别鉴定中的应用，通过本发明所述的引物进行PCR扩增，电泳结果呈现937bp一条带的为公鸽，呈现937bp和1153bp的两条带时为母鸽。
本发明目的之七在于提供本发明所述的PCR引物或本发明所述的试剂盒在番鸭性别鉴定中的应用。
本发明所述的在番鸭性别鉴定中的应用，通过本发明所述的引物进行PCR扩增，电泳结果呈现1153bp一条带的为公番鸭，呈现1153bp和832bp的两条带时为母番鸭。
本发明目的之八在于提供本发明所述的PCR引物或本发明所述的试剂盒在鹅性别鉴定中的应用。
本发明所述的在鹅性别鉴定中的应用，，电泳结果呈现1145bp一条带的为公鹅，呈现1145bp和833bp的两条带时为母鹅。
本发明目的之九在于提供本发明所述的PCR引物或本发明所述的试剂盒在鹌鹑性别鉴定中的应用。
本发明所述的在鹌鹑性别鉴定中的应用，电泳结果呈现1068bp一条带的为公鹌鹑，呈现1068bp和791bp的两条带时为母鹌鹑。
本发明还提供一种鸭、鸡、鸽、番鸭、鹅或鹌鹑性别快速鉴定方法，包括以下步骤：
1)提取待测家禽的基因组DNA；
2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用本发明所述引物对，进行PCR扩增反应；
3)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，
当待测家禽为鸭时，电泳结果呈现1147bp一条带的为公鸭公鸡，呈现1147bp和851bp的两条带时为母鸭；
当待测家禽为鸡时，电泳结果呈现983bp一条带的为公鸡，呈现983bp和798bp的两条带时为母鸡；
当待测家禽为鸽时，电泳结果呈现937bp一条带的为公鸽，呈现937bp和1153bp的两条带时为母鸽；
当待测家禽为番鸭时，电泳结果PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果呈现1153bp一条带的为公番鸭，呈现1153bp和832bp的两条带时为母番鸭；
当待测家禽为鹅时，电泳结果呈现1145bp一条带的为公鹅，呈现1145bp和833bp的两条带时为母鹅；
当待测家禽为鹌鹑时，电泳结果呈现1068bp一条带的为公鹌鹑，呈现1068bp和791bp的两条带时为母鹌鹑。
本发明所述的方法，步骤1)提取待测家禽的基因组DNA可以按照本领域常规方法提取，例如可以选用包括但不限于羽毛、血液、组织、器官等进行待测家禽的基因组DNA的提取。
本发明所述的方法，步骤2)中PCR反应体系可以为本领域的常规体系，在本发明的一种具体的实施方式中，为：2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正向和反向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
本发明所述的方法，步骤2)中PCR反应程序可以为本领域的常规体系，在本发明的一种具体的实施方式中，为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明通过设计的PCR引物，进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，利用电泳结果的条带数来确定家禽的性别，具有操作简单方便，鉴别结果快速准确，便于基层推广和使用，具有广阔的市场应用前景，此外，基于本发明方法开发的检测试剂盒，可产生可观的经济效益和良好的社会价值。
本发明的引物对家禽品种限制性小，因此对于所述的本发明所述的鸭、鸡、鸽、番鸭、鹅或鹌鹑没有具体品种的限制，其中，本发明中所述的“鸭”是指鸭科鸭属绿头鸭种，所述的“番鸭”又称洋鸭，是鸭科、栖鸭属疣鼻栖鸭。
附图说明
图1为本发明实施例1鸭的PCR扩增产物的电泳图谱。
图2为本发明实施例2鸭的PCR扩增产物的电泳图谱。
图3为本发明实施例3鸡的PCR扩增产物的电泳图谱。
图4为本发明实施例4鸡的PCR扩增产物的电泳图谱。
图5为本发明实施例6鸽子的PCR扩增产物的电泳图谱。
图6为本发明实施例7鸽子的PCR扩增产物的电泳图谱。
图7为本发明实施例8番鸭的PCR扩增产物的电泳图谱。
图8为本发明实施例9番鸭的PCR扩增产物的电泳图谱。
图9为本发明实施例10鹅的PCR扩增产物的电泳图谱。
图10为本发明实施例11鹅的PCR扩增产物的电泳图谱。
图11为本发明实施例12鹌鹑的PCR扩增产物的电泳图谱。
图12为本发明实施例13鹌鹑的PCR扩增产物的电泳图谱。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1
1已知性别鸭鉴定
1.1样品采集
采集10只已知性别的成年北京鸭，编号1-5为公鸭，6-10为母鸭，使用本发明设计引物扩增鸭基因组。
正向引物(SEQ ID NO.1)：5'-ATGAAAGAGTTTCAGCACTTGA-3'；
反向引物(SEQ ID NO.2)：5'-TTCATAATAGGAGCTCGAGCCA-3'。
1.2PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
1.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鸭电泳检测只有一条1147bp的条带，母鸭电泳检测时有1147bp和851bp的两条带，见结果如图1(其中1～5为公鸭，6～10为母鸭)。
以上结果表明本发明能够快速准确对鸭进行性别鉴定，并且简单易于操作。
实施例2
2未知性别鸭鉴定
2.1样品采集
采集16只未知性别的绍兴鸭雏鸭，使用本发明设计引物(SEQ ID NO.1)和(SEQ IDNO.2)扩增鸭基因组。
2.2 PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
2.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鸭电泳检测只有一条1147bp的条带，母鸭电泳检测时有1147bp和851bp的两条带，见结果如图2(其中3、4、6、7、11、12、15、16为公鸭，1、2、5、8、9、10、13、14为母鸭)。
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。
实施例3
1已知性别鸡鉴定
1.1样品采集
采集8只已知性别的成年崇仁麻鸡，编号1-4为公鸡，5-8为母鸡，使用本发明设计引物扩增鸡基因组。
正向引物(SEQ ID NO.1)：5'-ATGAAAGAGTTTCAGCACTTGA-3'；
反向引物(SEQ ID NO.2)：5'-TTCATAATAGGAGCTCGAGCCA-3'。
1.2 PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
1.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鸡电泳检测只有一条983bp的条带，母鸡电泳检测时有983bp和798bp的两条带，见结果如图3(其中1～4为公鸡，5～8为母鸡)。
以上结果表明本发明能够快速准确对鸡进行性别鉴定，并且简单易于操作。
实施例4
2未知性别鸡鉴定
2.1样品采集
采集24只未知性别的隐性白鸡的雏鸡，使用本发明设计引物(SEQ ID NO.1)和(SEQ ID NO.2)扩增鸡基因组。
2.2PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
2.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鸡电泳检测只有一条983bp的条带，母鸡电泳检测时有983bp和798bp的两条带，见结果如图4(其中1、4、5、7、8、9、12、14、17、20、21、22为公鸡，2、3、6、10、11、13、15、16、18、19、23、24为母鸡)。
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。
实施例5
3资源保护应用
3.1将本单位地方鸡血液样本基因库中的大骨鸡、白耳黄鸡、河南斗鸡、北京油鸡、仙居鸡、茶花鸡、丝羽乌骨鸡、狼山鸡、藏鸡、清远麻鸡、瓦灰鸡、金湖乌凤鸡、茶花鸡、寿光鸡、鹿苑鸡、东乡黑鸡、边鸡、文昌鸡、固始鸡等19个品种使用本发明设计引物(SEQ IDNO.1)和(SEQ ID NO.2)扩增鸡基因组。
3.2 PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
3.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鸡电泳检测只有一条983bp的条带，母鸡电泳检测时有983bp和798bp的两条带，鉴定结果与个体性别记录的结果一致，见表1。
表1 19个不同鸡地方品种检测结果
实施例6
1已知性别白羽王鸽鉴定
1.1样品采集
采集8只已知性别的成年白羽王鸽，编号1-4为公鸽，5-8为母鸽，使用本发明设计引物扩增鸽基因组。
正向引物(SEQ ID NO.1)：5'-ATGAAAGAGTTTCAGCACTTGA-3'；
反向引物(SEQ ID NO.2)：5'-TTCATAATAGGAGCTCGAGCCA-3'。
1.2PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
1.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鸽电泳检测只有一条937bp的条带，母鸽电泳检测时有937bp和1153bp的两条带，见结果如图5(其中1～4为公鸽，5～8为母鸽)。
以上结果表明本发明能够快速准确对鸽进行性别鉴定，并且简单易于操作。
实施例7
2未知性别欧洲肉鸽鉴定
2.1样品采集
采集17只未知性别的欧洲肉鸽的雏鸽，使用本发明设计引物(SEQ ID NO.1)和(SEQ ID NO.2)扩增鸽基因组。
2.2 PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
2.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鸽电泳检测只有一条937bp的条带，母鸽电泳检测时有937bp和1153bp的两条带，见结果如图6(其中1、2、4、7、8、12、14、15为公鸽，3、5、6、9、10、11、13、16、17为母鸽)。
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。
实施例8
1已知性别白羽番鸭鉴定
1.1样品采集
采集10只已知性别的成年白羽番鸭，编号1-5为公番鸭，6-10为母番鸭，使用本发明设计引物扩增番鸭基因组。
正向引物(SEQ ID NO.1)：5'-ATGAAAGAGTTTCAGCACTTGA-3'；
反向引物(SEQ ID NO.2)：5'-TTCATAATAGGAGCTCGAGCCA-3'。
1.2PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
1.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公番鸭电泳检测只有一条1153bp的条带，母番鸭电泳检测时有1153bp和832bp的两条带，见结果如图7(其中1～5为公番鸭，6～10为母番鸭)。
以上结果表明本发明能够快速准确对番鸭进行性别鉴定，并且简单易于操作。
实施例9
2未知性别黑羽番鸭鉴定
2.1样品采集
采集17只未知性别的黑羽番鸭雏番鸭，使用本发明设计引物(SEQ ID NO.1)和(SEQ ID NO.2)扩增番鸭基因组。
2.2PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
2.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公番鸭电泳检测只有一条1153bp的条带，母番鸭电泳检测时有1153bp和832bp的两条带，见结果如图8(其中2、3、5、7、10、11、13、14、17为公番鸭，1、4、6、8、9、12、15、16为母番鸭)。
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。
实施例10
1已知性别扬州鹅鉴定
1.1样品采集
采集10只已知性别的成年扬州鹅，编号1-5为公鹅，6-10为母鹅，使用本发明设计引物扩增鹅基因组。
正向引物(SEQ ID NO.1)：5'-ATGAAAGAGTTTCAGCACTTGA-3'；
反向引物(SEQ ID NO.2)：5'-TTCATAATAGGAGCTCGAGCCA-3'。
1.2 PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
1.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鹅电泳检测只有一条1145bp的条带，母鹅电泳检测时有1145bp和833bp的两条带，见结果如图9(其中1～5为公鹅，6～10为母鹅)。
以上结果表明本发明能够快速准确对鹅进行性别鉴定，并且简单易于操作。
实施例11
2未知性别莱茵鹅鉴定
2.1样品采集
采集17只未知性别的莱茵鹅雏鹅，使用本发明设计引物(SEQ ID NO.1)和(SEQ IDNO.2)扩增鹅基因组。
2.2PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
2.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鹅电泳检测只有一条1145bp的条带，母鹅电泳检测时有1145bp和833bp的两条带，见结果如图10(其中1、4、7、8、11、13、15、16为公鹅，2、3、5、6、9、10、12、14、17为母鹅)。
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。
实施例12
1已知性别日本鹌鹑鉴定
1.1样品采集
采集8只已知性别的成年日本鹌鹑，编号1-4为公鹌鹑，5-8为母鹌鹑，使用本发明设计引物扩增鹌鹑基因组。
正向引物(SEQ ID NO.1)：5'-ATGAAAGAGTTTCAGCACTTGA-3'；
反向引物(SEQ ID NO.2)：5'-TTCATAATAGGAGCTCGAGCCA-3'。
1.2PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
1.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鹌鹑电泳检测只有一条1068bp的条带，母鹌鹑电泳检测时有1068bp和791bp的两条带，见结果如图11(其中1～4为公鹌鹑，5～8为母鹌鹑)。
以上结果表明本发明能够快速准确对鹌鹑进行性别鉴定，并且简单易于操作。
实施例13
2未知性别中国白羽鹌鹑鉴定
2.1样品采集
采集17只未知性别的中国白羽鹌鹑雏鹌鹑，使用本发明设计引物(SEQ ID NO.1)和(SEQ ID NO.2)扩增鹌鹑基因组。
2.2PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
2.3电泳检测
反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。公鹌鹑电泳检测只有一条1068bp的条带，母鹌鹑电泳检测时有1068bp和791bp的两条带，见结果如图12(其中3、5、6、9、10、11、13、16为公鹌鹑，1、2、4、7、8、12、14、15、17为母鹌鹑)。
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。
序列表
<110> 江苏省家禽科学研究所
<120> 一种用于鹌鹑性别鉴定的PCR引物、试剂盒及其方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaagagt ttcagcactt ga 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttcataatag gagctcgagc ca 22