阅读说明：本技术 一种基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系和应用 (Multi-site cynoglossus semilaevis true and false male fish screening system based on SNaPshot technology and application ) 是由 张博 贾磊 赵娜 刘克奉 何晓旭 王群山 赵东康 鲍宝龙 于 2019-08-19 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系,所述体系包括具有标记指示作用的8个SNPs,该8个SNPs位于同一条染色体NC_024328.1上,位置信息如下：SNP1—13754040,SNP3-14518947,SNP4-14546665,SNP5-15320226,SNP6-14238006,SNP7-14546702,SNP9-14802286,SNP10-14802427。本体系只可在多种遗传分析仪器上操作,可实现自动分型并鉴定出雄鱼和伪雄鱼。相比于目前鉴定半滑舌鳎遗传性别的方法,该方法操作更快捷,检测通量更高,更重要的是,该方法具有极高的准确率。(The invention relates to a multi-site cynoglossus semilaevis true and false male fish screening system based on an SNaPshot technology, which comprises 8 SNPs with a marking indication function, wherein the 8 SNPs are positioned on the same chromosome NC-024328.1, and the position information is as follows: SNP 1-13754040, SNP3-14518947, SNP4-14546665, SNP5-15320226, SNP6-14238006, SNP7-14546702, SNP9-14802286, and SNP 10-14802427. The system can only be operated on various genetic analysis instruments, can realize automatic typing and identify the male fish and the pseudo-male fish. Compared with the existing method for identifying the genetic sex of the cynoglossus semilaevis, the method is quicker to operate and higher in detection flux, and more importantly, the method has extremely high accuracy.)

一种基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系 和应用

技术领域

本发明属于水产生物技术中的海水鱼类遗传性别鉴定技术领域，尤其是一种基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系和应用。

背景技术

半滑舌鳎是比目鱼的一种，雌性个体的生长速率是雄性个体的2-4倍，雄鱼生长缓慢、个体体型小，降低了半滑舌鳎的养殖产量，增加了养殖成本。研究表明半滑舌鳎性别决定机制为性染色体Z和W，半滑舌鳎正常雄鱼具有ZZ型的染色体，正常雌鱼具有ZW型的染色体。而伪雄鱼遗传的是雌性染色体，基因型都是ZW型。但从其体貌特征和生殖器官上均表现为雄性特征，也可以像雄鱼一样产生可育***和繁育后代。而且如果用伪雄鱼作为父本，那么后代也会遗传父本的特征成为伪雄鱼。这样通过逐代积累，就导致了半滑舌鳎养殖群体中生理雌性的比例的失衡。半滑舌鳎真伪雄鱼甄别、剔除伪雄鱼作父本对生产养殖具有重要的应用价值。

半滑舌鳎性别特异分子标记已经开发了多个。前人通过AFLP(amplifiedfragment length polymorphism，扩增片段长度多态性)标记技术分离到半滑舌鳎雌性特异AFLP标记(Chen et al.，2007)，由于AFLP标记是显性遗传，应用中不能区分ZW雌性和WW超雌个体，难以避免假阴性的结果，从而对ZZ雄鱼和ZW雌鱼产生误判。通过对半滑舌鳎共显性性别特异微卫星scaffold68-2标记筛选(刘洋等，2014)，可针对共显性性别特异标记位点设计引物对半滑舌鳎遗传性别进行鉴定，但实际应用中微卫星内INDEL短(小于50bp)，导致来自Z染色体和W染色体的两种PCR扩增产物片段长度差异较小，对在凝胶电泳判定其长短时造成不小的困难。此外以上的多种标记均为单位点标记，即针对某一特定位点的标记，而发明一种基于多个SNPs的共反应体系，以多位点共同作性别判定，可以极大地提高半滑舌鳎真伪雄鱼性别甄别的准确性，形成检验该鱼遗传性别的黄金标准。

通过检索，发现如下一篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

一种基于荧光分子标记体系的半滑舌鳎真伪雄鱼甄别方法(CN109825565A)，一种基于荧光分子标记体系的半滑舌鳎真伪雄鱼甄别方法。分子标记的设计和检测是基于五引物扩增阻碍突变体系(即PARMS)。利用对半滑舌鳎Z/W性染色体DNA序列的生物信息学分析和分子生物学方法成功寻找和确认了Z/W性染色体间DNA序列上的SNP多态性位点，并设计和验证了1组基于PARMS的荧光分子标记。通过对60条性别已知半滑舌鳎鱼样本的高通量qPCR分型实验验证表明该PARMS分子标记可成功鉴定所有样本中的真伪雄鱼。相比于目前鉴定方法和标记，该标记和相应的检测方法在保证准确率的前提下，使操作更快捷，成本更低廉，检出率更高，并可实现高通量检测。

通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系和应用，该体系只可在多种遗传分析仪器上操作，可实现自动分型并鉴定出雄鱼和伪雄鱼。相比于目前鉴定半滑舌鳎遗传性别的方法，该方法操作更快捷，检测通量更高，更重要的是，该方法具有极高的准确率。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系，所述体系包括具有标记指示作用的8个SNPs，该8个SNPs位于同一条染色体NC_024328.1上，位置信息如下：SNP1—13754040，SNP3-14518947，SNP4-14546665，SNP5-15320226，SNP6-14238006，SNP7-14546702，SNP9-14802286，SNP10-14802427。

而且，所述8个SNPs经过简化基因组测序GBS(Genotype by sequencing)测序和全基因组关联分析筛选而获得。

而且，所述8个SNPs的引物的名称、序列及长度为：

如上所述的基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系在半滑舌鳎真伪雄鱼甄别方面中的应用。

如上所述的基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系的制备方法，步骤如下：

S1、对45条半滑舌鳎雌雄鱼简化基因组测序后，利用全基因组关联分析筛选雌雄鱼差异SNPs位点；

S2、在寻找到的差异显著top300中，对全基因组关联分析给出的p值划定两条显著性水平线，该p值已经进行-log10转换，一条是FDR＝0.05时的p值，一条是经过Bonferroni矫正后的p＝0.05；选择显著性水平线以上的位点进行实验验证；Bonferroni校正后的显著差异水平为6.987842，该校正后的显著差异水平的计算为：-log10(0.05/number of SNP)；选取10^-7次方筛选的差异位点共70个作为候选SNPs位点；

S3、从70个位点中选取missense_variant、5_prime_UTR_variant、downstream_gene_variant、upstream_gene_variant不同类型的SNPs共10个作为标记验证和Snapshot体系开发的终选SNPs；

基于上述筛选的SNPs位点位于同一条染色体NC_024328.1上，SNP1—13754040，SNP2-13471049，SNP3-14518947，SNP4-14546665，SNP5-15320226，SNP6-14238006，SNP7-14546702，SNP8-15087253，SNP9-14802286，SNP10-14802427，设计出一组可用于半滑舌鳎性别鉴定的Snapshot标记引物；

S4、利用多重PCR反应体系进行分型实验，验证10标记反应体系是否可鉴定出半滑舌鳎的遗传性别；

S5、将SNaPshot测序结果与已知标记检测的结果进行准确性和检出率的比对，证明该反应体系能够鉴定出半滑舌鳎的遗传性别。

利用如上所述的基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系鉴别多位点半滑舌鳎真伪雄鱼的方法，步骤如下：

S1：利用酚-氯仿提取法从半滑舌鳎鱼鳍组织中提取基因组DNA；

S2：构建反应多重PCR反应体系：

反应程序：

每个样本的预扩增产物等比例混合后取4μl用于消化，ExoI酶稀释10倍后消化体系如下：

预扩增产物纯化程序：37℃1.0h，75℃20min；

延伸体系：

延伸条件：96℃10s，50℃5s，60℃30s，×30cycles；

S3：3730xl上机检测

1)96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液9μl，内标和甲酰胺混合液的体积比为0.5：8.5，PCR产物1.0μl；

2)95℃变性3min，上机检测。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明基于10个SNP位点的共检测体系，其中有效位点为8个，只需一个多重PCR反应体系和SNaPshot分型测序即可实现半滑舌鳎遗传性别的鉴定。该体系只可在多种遗传分析仪器上操作，可实现自动分型并鉴定出雄鱼和伪雄鱼。相比于目前鉴定半滑舌鳎遗传性别的方法，该方法操作更快捷，检测通量更高，更重要的是，该方法具有极高的准确率和累计排除率。

2、本发明体系是基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系。该体系基于半滑舌鳎雌雄鱼简化基因组测序(Genotype by sequencing)的全基因组关联分析(GWAS)筛选到的多个单核苷酸多态性(SNP，SingleNucleotide Polymorphism)位点而开发。体系的设计和检测是基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术——SNaPshot。体系将10个候选指示SNPs融合到同一个多重PCR反应中，特异性的扩增并分型检测了10个位点在两组样本中的指示准确性。通过对85尾性别已知的半滑舌鳎样本的SNaPshot分型验证，证明其中8个位点SNPs标记体系可成功鉴定所有样本中的真伪雄鱼。相比于目前鉴定方法和标记，该标记体系和检测方法极大地提高了半滑舌鳎真伪雄鱼的识别准确性，可以在多种遗传分析仪上进行快速、准确地基因分型，实现了SNP分析的自动化，可以方便高效实现高通量检测.

附图说明

图1为本发明中对45个半滑舌鳎鱼的10位点SNP测序分型结果示图；其中，纯合子等位基因1为单碱基，等位基因2与其相同，记为空，即N-；杂合子等位基因1和等位基因2均用实际碱基标出，记为NX，X为突变位点；

图2为本发明中利用已知标记(申请专利号：201910063591.X)indel标记对45个半滑舌鳎遗传性别进行鉴定图；其中，琼脂糖电泳显示，有在620bp和1.4kb处有两条带的是伪雄鱼，而只在1.4kb处有一条带的是雄鱼；

图3为本发明中40尾半滑舌鳎生理雄鱼用已知标记鉴定的琼脂糖凝胶电泳结果图；

图4为本发明中40尾半滑舌鳎生理雄鱼用本发明开发的SNaPshot体系鉴定的位点信息统计图；

图5为第一批45个半滑舌鳎海捕样品的SNaPshot原始测序峰值图的10个样本示例图；

图6为第二批40个养殖半滑舌鳎生理雄鱼样品的SNaPshot原始测序峰值图10个样本示例图。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系，所述体系包括具有标记指示作用的8个SNPs，该8个SNPs位于同一条染色体NC_024328.1上，位置信息如下：SNP1—13754040，SNP3-14518947，SNP4-14546665，SNP5-15320226，SNP6-14238006，SNP7-14546702，SNP9-14802286，SNP10-14802427。

较优地，所述8个SNPs经过GBS测序和全基因组关联分析筛选而获得。

较优地，所述8个SNPs的引物的名称、序列及长度为：

如上所述的基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系在半滑舌鳎真伪雄鱼甄别方面中的应用。

如上所述的基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系的制备方法，步骤如下：

S1、对45条半滑舌鳎雌雄鱼简化基因组测序后，利用全基因组关联分析筛选雌雄鱼差异SNPs位点；

S2、在寻找到的差异显著top300中，对全基因组关联分析给出的p值划定两条显著性水平线，该p值已经进行-log10转换，一条是FDR＝0.05时的p值，一条是经过Bonferroni矫正后的p＝0.05；选择显著性水平线以上的位点进行实验验证；Bonferroni校正后的显著差异水平为6.987842，该校正后的显著差异水平的计算为：-log10(0.05/number of SNP)；选取10^-7次方筛选的差异位点共70个作为候选SNPs位点；

S3、从70个位点中选取missense_variant、5_prime_UTR_variant、downstream_gene_variant、upstream_gene_variant不同类型的SNPs共10个作为标记验证和Snapshot体系开发的终选SNPs；

基于上述筛选的SNPs位点位于同一条染色体NC_024328.1上，SNP1—13754040，SNP2-13471049，SNP3-14518947，SNP4-14546665，SNP5-15320226，SNP6-14238006，SNP7-14546702，SNP8-15087253，SNP9-14802286，SNP10-14802427，设计出一组可用于半滑舌鳎性别鉴定的Snapshot标记引物；

S4、利用多重PCR反应体系进行分型实验，验证10标记反应体系是否可鉴定出半滑舌鳎的遗传性别；

S5、将SNaPshot测序结果与已知标记检测的结果进行准确性和检出率的比对，证明该反应体系能够鉴定出半滑舌鳎的遗传性别。

利用如上所述的基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系鉴别多位点半滑舌鳎真伪雄鱼的方法，步骤如下：

S1：利用酚-氯仿提取法从半滑舌鳎鱼鳍组织中提取基因组DNA；

S2：构建反应多重PCR反应体系：

反应程序：

每个样本的预扩增产物等比例混合后取4μl用于消化，ExoI酶稀释10倍后消化体系如下：

预扩增产物纯化程序：37℃1.0h，75℃20min；

延伸体系：

延伸条件：96℃10s，50℃5s，60℃30s，×30cycles；

S3：3730xl上机检测

1)96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液9μl，内标和甲酰胺混合液的体积比为0.5：8.5，PCR产物1.0μl；

2)95℃变性3min，上机检测。

具体地，一种基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系，其制备步骤包括：

S1、对45条半滑舌鳎雌雄鱼简化基因组测序(Genotype by sequencing)后，利用GWAS分析筛选雌雄鱼差异SNPs位点；

S2、在寻找到的差异显著top300中，对GWAS给出的p值划定两条显著性水平线(已经进行-log10转换)，一条是FDR＝0.05时的p值,一条是经过Bonferroni矫正后的p＝0.05.选择显著性水平线以上的位点进行实验验证。Bonferroni校正后的显著差异水平(-log10(0.05/number ofSNP))为6.987842。选取10^-7次方筛选的差异位点共70个作为候选SNPs位点(表1)。

表1选取10^-7次方筛选的差异位点共70个作为候选SNPs位点

S3、从70个位点中选取missense_variant、5_prime_UTR_variant、downstream_gene_variant、upstream_gene_variant不同类型的SNPs共10个作为标记验证和Snapshot体系开发的终选SNPs(表2)。

表2终选SNPs

基于上述筛选的SNPs位点位于同一条染色体(NC_024328.1)上，SNP1—13754040，SNP2-13471049，SNP3-14518947，SNP4-14546665，SNP5-15320226，SNP6-14238006，SNP7-14546702，SNP8-15087253，SNP9-14802286，SNP10-14802427，设计出一组可用于半滑舌鳎性别鉴定的Snapshot标记引物(表3)；

S4、利用多重PCR反应体系进行分型实验，验证10标记反应体系是否可鉴定出半滑舌鳎的遗传性别。

S5、将SNaPshot测序结果与已知标记(申请专利号：201910063591.X)检测的结果进行准确性和检出率的比对。

优选地，所述S3中筛选出半滑舌鳎性别鉴定的引物为：

表3S3中筛选出半滑舌鳎性别鉴定的引物

本发明所用候选SNP位点源于对半滑舌鳎雌雄鱼的简并基因组测序后的全基因组关联分析(GWAS)筛选。

一种基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系，包括以下步骤：

S1：利用酚-氯仿提取法从40条已经其他标记筛选的已知遗传性别的半滑舌鳎鱼鳍组织中提取基因组DNA；

40尾半滑舌鳎遗传性别的已知标记鉴定见图3；

S2：构建反应多重PCR反应体系：

反应程序：

每个样本的预扩增产物等比例混合后取4μl用于消化，ExoI酶稀释10倍后消化体系如下：

预扩增产物纯化程序：37℃1.0h，75℃20min。

延伸体系：

延伸条件：96℃10s，50℃5s，60℃30s，×30cycles。

S3：3730xl上机检测

1)96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液(分子内标是行业常用的定量marker，商品名为Rox500，内标和甲酰胺混合液体积比为0.5：8.5)9μl，PCR产物1.0μl；

2)95℃变性3min，上机检测。

40条半滑舌鳎8有效位点Snapshot标记体系鉴定结果图见图4。

结果和讨论：

采用针对候选的10个SNPs位点进行第一轮SNaPshot检测结果中，10对引物在同一体系下进行多重聚合酶链反应，用SNaPshot小测序在45个半滑舌鳎样本中均检测到10个单核苷酸多态位点。但只有8个单核苷酸多态性位点在雄性和伪雄性之间具有不同的基因型(见图1)，两个单核苷酸多态性位点(SNP2-13471049，SNP8-15087253)不能差异显示两种鱼的性别。SNaPshot检测结果中样本的性别信息如表4和图5。SNaPshot的结果与已开发的INDEL标记检测结果(见图2)完全一致，说明该体系的8位点单核苷酸多态性检测结果能很好地反映半滑舌鳎的遗传性别。

同时为了进一步验证该体系的普遍适用性，另从水产养殖场取额外的半滑舌鳎生理雄鱼样本40个，进行第二轮筛选。40个样品的SNaPshot检测遗传性别统计(见图4)所示，8位点SNaPshot体系中的每一个SNP都能有效的显示出雄性和伪雄性之间的差异。结合已知Indel标记的琼脂糖凝胶电泳验证(见图3)，13个伪雄鱼和27个真雄鱼都与SNapshot体系检测一致(见表5和图6)。说明这八个SNPs位点在指示半滑舌鳎遗传性别上具有普适性。

表4第一批45个海捕半滑舌鳎个体遗传性别信息

表5第二批40个养殖半滑舌鳎雄鱼个体遗传性别信息

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

序列表

<110> 天津渤海水产研究所

<120> 一种基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系和应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> SNP-1-F(Unknown)

<400> 1

gtagtctgac tgccttcacc ttg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> SNP-1-R(Unknown)

<400> 2

ctttctctgc tgtgtctgtt tgc 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> SNP-3-F(Unknown)

<400> 3

gcctttccct gaaacatcat c 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> SNP-3-R(Unknown)

<400> 4

atcctcagtg ggctgcagac 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> SNP-4-7-F(Unknown)

<400> 5

agccgtcagt cacatgctac tg 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> SNP-4-7-R(Unknown)

<400> 6

ctcttcgtcg ccgtcttcat 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> SNP-5-F(Unknown)

<400> 7

tagttgtcgg tcagatcggc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> SNP-5-R(Unknown)

<400> 8

atggtctacc tctgcccgag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> SNP-6-F(Unknown)

<400> 9

acctccacct ctgcttcgtc 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> SNP-6-R(Unknown)

<400> 10

aagtgcgatc tgctgggata c 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> SNP-9-F(Unknown)

<400> 11

tttgggtaaa ctggaagccg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> SNP-9-R(Unknown)

<400> 12

gctaacatca cgctgcagga 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> SNP-10-F(Unknown)

<400> 13

ggaatcacag ggacagcaga c 21

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> SNP-10-R(Unknown)

<400> 14

tgactgtgag ttcacggtct cc 22

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> SNP-1-YS-R(Unknown)

<400> 15

ttttttttgg agctggactt cctcttctcc 30

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> SNP-3-YS-R(Unknown)

<400> 16

tttttttttt ttttttgctc ggaccagccc atctac 36

<210> 17

<211> 47

<212> DNA

<213> SNP-4-YS-R(Unknown)

<400> 17

tttttttttt tttttttttt tttttttagt ccaacagcac ggccgac 47

<210> 18

<211> 42

<212> DNA

<213> SNP-5-YS-F(Unknown)

<400> 18

tttttttttt tttttttttt tttccggcat ctcaccgtag ga 42

<210> 19

<211> 52

<212> DNA

<213> SNP-6-YS-F(Unknown)

<400> 19

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tctccatcct cctcaatttc tg 52

<210> 20

<211> 69

<212> DNA

<213> SNP-7-YS-R(Unknown)

<400> 20

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttg agctccagcc 60

ctctggcca 69

<210> 21

<211> 61

<212> DNA

<213> SNP-9-YS-F(Unknown)

<400> 21

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tatgggaggc tgatggtgaa 60

t 61

<210> 22

<211> 72

<212> DNA

<213> SNP-10-YS-F(Unknown)

<400> 22

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttta cacaagtgca 60

ttatgggtat ac 72