阅读说明：本技术 一种用于早期滇杨性别鉴定的方法 (Method for sex identification of early populus yunnanensis ) 是由 辛培尧 李启少 杨沁雨 陈棋 董章宏 辛静 沈伟祥 赵文植 徐剑 王正德 夏茂甜 于 2021-08-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于早期滇杨性别鉴定的方法,包括以下步骤：步骤一：配制试剂和随机选取滇杨雌雄株幼嫩无病虫害的叶片提取DNA；步骤二：RAPD引物获取；步骤三：将叶样DNA与引物进行PCR扩增,筛选特异性条带的RAPD引物；步骤四：通过有特异性条带的RAPD引物在已知性别的滇杨雌雄株间进行验证；步骤五：对特异性条带的RAPD引物(OPT-06)进行PCR扩增并对目的片段进行克隆和测序,设计出重复性和特异性更好的SCAR标记引物,并在已知性别的滇杨雌雄株间进行验证；本发明通过使用RAPD-SCAR标记技术,相较于传统的形态学标记和同工酶标记,不易受环境以及发育阶段的影响,其鉴定结果准确,通过这种方式能够实现对滇杨幼苗进行早期性别鉴定,进而能够加速滇杨的育种进程。(The invention discloses a method for identifying the sex of populus yunnanensis at an early stage, which comprises the following steps: the method comprises the following steps: preparing a reagent and randomly selecting young leaves of male and female populus yunnanensis plants without diseases and insect pests to extract DNA; step two: obtaining an RAPD primer; step three: carrying out PCR amplification on the leaf sample DNA and the primer, and screening an RAPD primer of a specific band; step four: verifying the male and female plants of populus yunnanensis of known sex by RAPD primers with specific bands; step five: carrying out PCR amplification on RAPD primers (OPT-06) of specific bands, cloning and sequencing target fragments, designing SCAR marker primers with better repeatability and specificity, and verifying the primers among male and female populus yunnanensis plants with known sex; compared with the traditional morphological marker and isozyme marker, the method disclosed by the invention is not easily influenced by the environment and the development stage by using the RAPD-SCAR marker technology, has an accurate identification result, and can realize early sex identification of populus yunnanensis seedlings and further accelerate the breeding process of populus yunnanensis.)

一种用于早期滇杨性别鉴定的方法

技术领域

本发明属于植物工程技术领域，具体涉及一种用于早期滇杨性别鉴定的方法。

背景技术

滇杨是杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus)，属于雌雄异株的落叶乔木树种，又称白杨树、云南白杨、东川杨柳等名。乔木，则高达20m。树皮呈灰色，有纵裂。幼枝有棱，呈黄褐色，无毛，老枝无梭，呈紫褐色。幼芽为椭圆形，无毛，有粘质。叶为纸质，叶形呈多种形状，如卵形、椭圆状卵形、广卵形或三角状卵形，长5-16cm，宽2-7.5cm，先端长渐尖，基部为宽楔形或圆形，边缘有细腺圆状锯齿，初有睫毛，后无毛，叶上面为绿色，有光泽，沿中脉上稍有柔毛，叶下面为灰白色，无毛，中脉为黄色或红色；叶柄长1-4cm，带红色；短枝着生的叶呈卵形，较大，长7.5-17cm，宽4-12cm，先端长渐尖，或钝尖，基部圆形或浅心形，稀楔形；叶柄长2-9cm，或与叶片近等长。雄花序长12-20cm，花轴光滑，雄蕊数为20-40；苞片呈掌状，丝状条裂，光滑，赤褐色；雌花序长10-15cm；蒴果3-4瓣裂，近无柄。花期为4月上旬，果期4月中、下旬。

在滇杨性别鉴定过程中，传统的鉴定方法是在田间进行生态学鉴定，该方法具有简单易行、成本较低、可操作性强等优点。在其它鉴定方法未出现之前，田间形态特征鉴定曾起过很大的作用，目前仍在采用。但是该鉴定方法比较费时、费地、浪费人力物力，且很多雌雄异株植物在性器官分化和发育成熟之前，雌雄株形态差异不明显。另外，植物的外部形态易受环境以及发育阶段的影响，鉴定结果准确性不高、可靠性差。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种用于早期滇杨性别鉴定的方法，以解决上述背景技术中提出的鉴定结果准确性不高、可靠性差的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于早期滇杨性别鉴定的方法，包括以下步骤：

步骤一：随机选取滇杨雌雄株幼嫩无病虫害的叶片，配制试剂；

步骤二：提取滇杨基因组DNA；

步骤三：将叶样DNA与引物进行PCR扩增，筛选特异性条带的RAPD引物；

步骤四：通过特异性条带的RAPD引物在已知性别的滇杨雌雄株间进行验证；

步骤五：对步骤四获得的能在滇杨雌雄株间产生差异条带的RAPD引物(OPT-06)进行PCR扩增并对目的片段进行克隆和测序，设计重复性和特异性更好的SCAR标记引物；

步骤六：使用SCAR引物在已知性别的滇杨雌雄株间进行验证；

步骤七：得到滇杨植株进行性别鉴定RAPD-SCAR标记。

优选的，所述步骤一中，在云南省滇西北滇杨自然分布区内随机摘选新鲜幼嫩的雌雄株叶样。

优选的，所述步骤二中，用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒法提取滇杨基因组DNA。

优选的，所述步骤三中，其中RAPD引物配制为12.5μL的2×Taq MasterMix、9.5μL的ddH20(超纯水)、2μL的RAPD引物的混合液。

优选的，所述步骤三中，将RAPD引物的混合液加入叶样DNA内，进行PCR扩增。

优选的，所述步骤三中，使用水平式琼脂糖凝胶电泳法对扩增后产物进行检测，筛选出特异性条带的RAPD引物。

优选的，所述步骤四中，取已知性别滇杨植株叶样DNA，并按照性别进行分类，在叶样DNA内加入特异性条带的RAPD引物，测定特异性条带的RAPD引物性别鉴定结果。

优选的，所述步骤五中，对RAPD引物(OPT-06)进行PCR扩增并对目的片段进行克隆和测序，设计出重复性和特异性更好的SCAR标记引物。

优选的，所述步骤六中，取已知性别滇杨植株叶样DNA，并按照性别对叶样DNA进行分类，在叶样DNA内加入特异性条带的SCAR引物，测定SCAR引物性别鉴定结果。

与现有技术相比，本发明提供了一种用于早期滇杨性别鉴定的方法，具备以下有益效果：

1、本发明通过使用RAPD标记技术，本发明通过使用RAPD-SCAR标记技术，标记更加稳定，结果更加可靠，相较于传统的形态学标记和同工酶标记，容易受环境以及发育阶段的影响，导致鉴定结果不准确，通过这种方式能够实现对滇杨幼苗进行早期性别鉴定；

2、本发明通过使用特异性条带的RAPD引物对现有自然分布区内的早期滇杨植株进行性别鉴定，通过观察鉴定后的雌性植株性别比例情况，能够使科研人员了解在不同环境因素作用下对滇杨植株性别造成的影响，从而便于了解环境因素对滇杨植株的性别影响，能够为滇杨雌株濒危原因的探讨提供理论依据与实践指导。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制，在附图中：

图1为本发明提出的用于早期滇杨性别鉴定的标记研究方法的系统流程图；

图2是OPT-06-c-650在20份滇杨材料扩增结果示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

请参阅图1，本发明提供以下技术方案：一种用于早期滇杨性别鉴定的方法，包括以下步骤：

步骤一：随机选取滇杨雌雄株叶样，配制试剂；；

步骤二：提取滇杨基因组DNA和获取RAPD引物；

步骤三：将叶样DNA与引物进行PCR扩增，筛选特异性条带的RAPD引物；

步骤四：通过特异性条带的RAPD引物验证已知雌雄株叶样DNA；

步骤五：对步骤四获得的能在滇杨雌雄株间产生差异条带的RAPD引物(OPT-06)进行PCR扩增并对目的片段进行克隆和测序，设计重复性和特异性更好的SCAR标记引物；

步骤六：通过特异性条带的SCAR引物在已知性别的滇杨雌雄株间进行验证；

步骤七：得到滇杨植株进行性别鉴定RAPD-SCAR标记。

优选的，所述步骤一中，在云南省滇西北滇杨种植区域内随机摘选新鲜幼嫩的雌雄株叶样，对叶样进行冲洗，等待自然晾干。

优选的，所述步骤二中，用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒法提取滇杨基因组DNA。

优选的，所述步骤三中，其中RAPD引物配制为12.5μL的2×Taq MasterMix、9.5μL的ddH20(超纯水)、2μL的RAPD引物的混合液。

优选的，所述步骤三中，将叶样DNA加入到RAPD引物的混合液中，进行PCR扩增。

优选的，所述步骤三中，使用水平式琼脂糖凝胶电泳法对扩增后产物进行检测，筛选出特异性条带的RAPD引物。

优选的，所述步骤四中，取已知性别滇杨植株叶样DNA，并按照性别进行分类，将DNA加入有特异性条带的RAPD引物中，检测有特异性条带RAPD引物的性别鉴定结果。

优选的，所述步骤五中，对RAPD引物进行PCR扩增、克隆和测序后设计SCAR引物。

优选的，所述步骤六中，取已知性别滇杨植株叶样DNA，并按照性别对叶样DNA进行分类，在叶样DNA内加入特异性条带的SCAR引物，测定特异性条带的SCAR引物性别鉴定结果；有特异性条带的为雄性，没有的为雌雄。

实施例2

通过基于实施例1的方法设计的RAPD-SCAR引物对10株雄性和10株雌性滇杨的DNA进行PCR扩增，并进行三次重复实验，扩增产物用2.0％琼脂糖凝胶水平电泳进行检测，结果如图2所示；由图2可以得出，10株滇杨雄性植株当中均有特异性扩增条带，而10柱雌性植株中，均没有出现扩增条带；表明了RAPD转化成SCAR标记时具有特异性，转化成功。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。