阅读说明：本技术 白虎汤颗粒的制备工艺及质量标准研究 (Preparation process and quality standard research of Baihu decoction granules ) 是由 闫雪生 于蓓蓓 王平 刘瑾 孙丹丹 生立嵩 李富欣 王文静 杜立遥 于 2019-10-23 设计创作，主要内容包括：本发明属于中药制剂技术领域,具体涉及一种白虎汤颗粒的制备方法及质量标准的检测方法。提供了一种白虎汤颗粒的制备方法,以CaSO<Sub>4</Sub>·2H<Sub>2</Sub>0保留率、新芒果苷保留率、芒果苷保留率、除杂率为考查指标,确定了所述制备方法,该制备方法制备的白虎汤颗粒质量稳定,有效成分利用率高；本发明建立了白虎汤颗粒的质量控制方法,对制剂中的知母和炙甘草进行薄层色谱鉴别,对制剂中的知母和甘草进行含量测定,建立的方法操作简便,专属性强,结果准确,可用于白虎汤颗粒的质量控制。(The invention belongs to the technical field of traditional Chinese medicine preparations, and particularly relates to a preparation method of a Baihu decoction granule and a quality standard detection method. A method for preparing BAIHUTANG granule with CaSO is provided 4 ·2H 2 0 retention rate, new mangiferin retention rate, mangiferin retention rate and impurity removal rate are considered indexes, the preparation method is determined, the quality of the prepared white tiger soup particles is stable, and the utilization rate of active ingredients is high; the invention establishes a quality control method of the Baihu decoction granules, carries out thin-layer chromatography identification on rhizoma anemarrhenae and radix glycyrrhizae preparata in the preparation, carries out content measurement on the rhizoma anemarrhenae and the radix glycyrrhizae preparata in the preparation, has simple and convenient operation, strong specificity and accurate result, and can be used for the quality control of the Baihu decoction granules.)

白虎汤颗粒的制备工艺及质量标准研究

技术领域

本发明属于中药制剂技术领域,具体涉及一种白虎汤颗粒的制备方法及质量标准的检测方法。

背景技术

经方是“医方之祖”，指汉代张仲景所著《伤寒杂病论》（分为《伤寒论》及《金匮要略》）所记载之方剂，具有“普、简、廉、效”的特色和优势。其中，白虎汤出自《伤寒论》，是治疗阳明气分热盛证的代表方，由生石膏、知母、炙甘草、粳米4味药材组成，具有清热生津的功效。

白虎汤作为《伤寒论》中的经典名方，目前的研究主要集中在不同配伍组合对化学成分溶出的影响以及白虎汤的临床应用方面，由白虎汤制成适宜的剂型，达到古方新用的目的方面研究较少。

当前，在现代临床治疗中善于运用经方的大夫较少，导致这种现状的原因：首先是不会用，因为用经方需要在中医基础理论的基础上，熟悉并掌握药物之间的相互配伍及用量，再经过临床实践的总结体会，具有较强的实践性与经验性；然后是不敢用，经方固有其好的作用但并不是万能方，正确运用对治疗疾病有好的效果，如果误用不但无效果，还可能对患者造成伤害，因此出现与其担负责任，还不如不用的情况；再就是不想用，大多数经方药味较少，比不上开大方具有经济效益，尤其以第一种原因更为常见。由于现代科学技术及现代医学的迅速进步发展，当今的临床症状与古代比较有较大的差异，经方的临床作用的发挥受到了非常大的冲击与挑战，因此，通过结合张仲景原方要旨和当今科技对经方进行物质基础研究以及临床实践研究，可以为经方进一步的发展和提高奠定更多的参考价值。

发明内容

为克服现有技术的缺陷,本发明的目的在于提供了一种白虎汤颗粒的制备方法和质量标准的检测方法，利用该检测方法使得白虎汤颗粒的质量。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

白虎汤颗粒的制备方法 ,采用以下步骤:

（1）称取配方比的生石膏、知母、炙甘草、粳米，第1次加入8倍量的水，浸泡0.5 h后煎煮，第2、3次分别加入6倍量的水煎煮，三次均煎煮0.5 h，用纱布滤过，合并三次滤液，并浓缩至相对密度为1.02；

（2）在60 ℃下，在步骤（1）所述的浓缩滤液中加入羧甲基壳聚糖溶液，搅拌20 min后静置12 h，离心，滤过，取滤液浓缩至相对密度为1.10～1.12的稠膏；

（3）加入辅料A，减压干燥，粉碎成细粉，然后加入辅料B加入88%乙醇制备软材，制粒，干燥，整粒，包装即得白虎汤颗粒。

优选地，步骤（1）所述的生石膏、知母、炙甘草、粳米的质量配比为50：18：6：9。

优选地，步骤（2）所述的羧甲基壳聚糖溶液的质量浓度为0.5%；所述浓缩滤液与羧甲基壳聚糖溶液的体积比为1:5。

优选地，步骤（3）所述的辅料A和辅料B组成总辅料；步骤（2）所述的稠膏和总辅料的质量比为1:0.3；其中步骤（3）所述的辅料A和辅料B的质量比为 2:1；辅料中糊精与可溶性淀粉的配比为3:2。

一种上述的白虎汤颗粒的质量标准的检测方法，包括：利用TLC法对其中的知母和炙甘草进行定性鉴别，以及利用HPLC法对其中的知母和甘草的含量进行测定。

进一步地，所述知母和炙甘草进行定性鉴别，方法如下:

A．称取2 g白虎汤颗粒中，研细，分别加甲醇10 mL超声处理30 min，取上清液作为供试品溶液；分别精密称取芒果苷、新芒果苷对照品，加甲醇分别制成芒果苷浓度为0.25 mg·mL^-1、新芒果苷浓度为0.23 mg·mL^-1的溶液，作为对照品溶液；称取知母药材粉末0.5 g，同供试品溶液制法制成知母对照药材溶液；按白虎汤颗粒配比称取除知母外的其它处方药材，按该颗粒的制备工艺制成缺知母阴性颗粒，按供试品溶液制备方法制成缺知母阴性对照溶液；照薄层色谱法（2015版中国药典第四部通则0502)进行试验，分别吸取芒果苷对照品溶液、新芒果苷对照品溶液、知母对照药材溶液、缺知母阴性对照溶液、供试品溶液各5 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以体积比为1∶1的乙醇-水为展开剂展开，取出，晾干，置紫外光灯365 nm下检视，结果供试品、知母对照药材色谱与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，而缺知母阴性颗粒处无斑点；

B. 称取15 g白虎汤颗粒，加***40 mL，加热回流1 h，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇30mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水40 mL使溶解，用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，作为供试品溶液；取甘草苷对照品，加甲醇制成每1mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液；按白虎汤颗粒配比称取除甘草外的其它处方药材，按颗粒的制备工艺制成缺甘草阴性颗粒，按供试品溶液制备方法制成缺甘草阴性对照溶液；照薄层色谱法(2015版中国药典第四部通则0502)试验，吸取缺甘草阴性对照溶液、甘草苷对照品溶液、三批供试品溶液各5 μL，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制成的硅胶G薄层板上，以体积比为15∶1∶1∶2的乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，均匀喷10%硫酸乙醇溶液显色，置105 ℃下加热5〜10 min，置紫外光灯（365 nm)下检视，结果三批供试品与对照品色谱相应的位置上，显相同顔色的荧光斑点，缺甘草阴性颗粒处无斑点。

进一步地，所述方法A还可采用以下方法:

称取1 g白虎汤颗粒中，研细，加30%丙酮10 mL超声处理30 min，取上清液作为供试品溶液；精密称取知母皂苷BⅡ对照品，加30%丙酮制成浓度为0.56 mg·mL^-1的溶液，作为对照品溶液；按处方比例称取除知母外的其它处方药材，按颗粒的制备工艺制成缺知母阴性颗粒，按供试品溶液制备方法制成缺知母阴性对照溶液；照薄层色谱法（2015版中国药典第四部通则0502)进行试验，分别吸取对照品溶液、缺知母阴性对照溶液、供试品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以体积比为4∶1∶5正丁醇-冰醋酸-水为展开剂展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸乙醇试液，置105 ℃下加热至斑点显色清晰，结果供试品与对照品色谱相应的位置上，显相同顔色的斑点，而缺知母阴性颗粒处无斑点。

进一步地，所述利用HPLC法对其中的知母和甘草的含量进行测定的方法为：

（1）色谱条件：Lichrospher C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）高效液相色谱柱；流动相：A乙腈—B 25 mmol·L^-1磷酸二氢钾，梯度洗脱（0-2 min，98% B；2-8 min，98%-85% B；8-15min，85%-78% B；15-20 min，78%-72% B；20-30 min，72%-50% B），柱温30 ℃，流速1 mL·min^-1，检测波长257 nm，进样量10 μL；

（2）混合对照品溶液的制备：称取新芒果苷、芒果苷、甘草苷、甘草酸单铵盐4种对照品适量，用甲醇溶解并定容，制备成混合对照品溶液，其中新芒果苷浓度为26.22 μg·mL^-1、芒果苷浓度为20.38 μg·mL^-1、甘草苷浓度为26.46 μg·mL^-1、甘草酸单铵盐浓度为30.67 μg·mL^-1，经0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

（3）供试品溶液的制备：白虎汤颗粒研细，取1 g，加入甲醇25 mL，称定重量，功率250 W，频率40 KHz的超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

（4）阴性对照溶液的制备

称取除知母、炙甘草以外的其它药材，按白虎汤颗粒的制备方法及供试品溶液的制法制成缺知母、炙甘草的阴性对照溶液，阴性对照溶液在与对照品溶液色谱峰相应位置上，未见有色谱峰，表明处方中的石膏、粳米对测定无干扰；

（5）分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL注入高效液相色谱仪，在257 nm处按上述色谱条件检测，表明混合对照品溶液和供试品溶液在相同保留时间均呈现吸收峰，而缺知母、甘草阴性对照未出现色谱峰；

（6）测定法：分别吸取混合对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪中，本品每1克含知母以新芒果苷和芒果苷的含量计，新芒果苷不得少于 0.4毫克，芒果苷不得少于0.5毫克；本品每1克含甘草以甘草苷和甘草酸单铵盐的含量计，甘草苷不得少于0.3毫克，甘草酸单铵盐0.3毫克。

有益效果

（1）本发明提供了一种白虎汤颗粒的制备方法，以CaSO4·2H20保留率、新芒果苷保留率、芒果苷保留率、除杂率为考查指标，确定了所述制备方法，该制备方法制备的白虎汤颗粒质量稳定， 有效成分利用率高。

（2）本发明建立了白虎汤颗粒的质量控制方法，对制剂中的知母和炙甘草进行薄层色谱鉴别，对制剂中的知母和甘草进行含量测定，建立的方法操作简便，专属性强，结果准确，可用于白虎汤颗粒的质量控制。

附图说明

图1为白虎汤颗粒的制备流程；

图2为知母和炙甘草TLC图；其中图2A为芒果苷、新芒果苷TLC图，图2A-1为芒果苷对照品TLC图，图2A-2为新芒果苷对照品TLC图，图2A-3为知母对照药材芒果苷、新芒果苷TLC图，图2A-4为缺知母阴性颗粒芒果苷、新芒果苷TLC图；图2A-5，2A -6，2A-7为三批白虎汤颗粒供试品芒果苷、新芒果苷TLC图；其中图2B为知母皂苷BⅡ TLC图，图2B-1为知母皂苷BⅡ对照品， 2B-2为缺知母阴性颗粒知母皂苷BⅡ TLC图，图2B -3，2B -4，2B 5三批白虎汤颗粒供试品知母皂苷BⅡ TLC图；图2C为甘草TLC图，图2C-1缺甘草阴性颗粒；图2C-2甘草苷对照品；图2C-3，图2C-4，图2C-5三批白虎汤颗粒供试品。

图3为4种混合对照品（A），缺知母甘草阴性对照（B），供试品（C）HPLC图；

图4为对照品HPLC图，其中图中1为新芒果苷， 2为芒果苷 ，3为甘草苷， 4为甘草酸单铵盐；

图5为白虎汤颗粒指纹图谱，其中图中6为新芒果苷，8为芒果苷，12为甘草苷，18为甘草酸单铵盐；

图6 为10批白虎汤颗粒样品指纹图谱，图中S1～S10.为10批白虎汤颗粒样品，R为对照图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下属说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

以下实施例所用的原料和试剂分别为：生石膏（山西，批号：170502），知母（河北，批号：161101），炙甘草（甘肃，批号：170201），以上三种药材均购于山东百味堂中药饮片有限公司，粳米为市售金龙鱼东北大米。知母对照药材（批号：121070-201105，中国食品药品检定研究院）。芒果苷对照品（批号：B20837-20 mg，≥98%），新芒果苷对照品（批号：B21397-20 mg，≥98%），甘草苷对照品（批号：B20414-20 mg，≥98%），甘草酸单铵盐对照品(批号：B20418-20 mg，≥98%)，以上对照品均购于上海源叶生物科技有限公司。磷酸二氢钾（液相，天津市科密欧化学试剂有限公司100 g），液相用乙腈、甲醇均为色谱纯，液相用水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

实施例1

按处方比例准确称取生石膏（粗粉）500 g，知母180 g，粳米90 g，炙甘草60 g，共计830g，第1次加入8倍量的水，浸泡0.5 h，第2、3次分别加入6倍量的水，煎煮3次，每次煎煮0.5h，用纱布滤过，合并三次滤液，药液浓缩至相对密度为1.02，在60 ℃条件下，按20 mL·100mL^-1的药液比加入0.5%的羧甲基壳聚糖溶液，搅拌20 min后静置12 h，离心，滤过，取滤液浓缩至相对密度为1.10～1.12的稠膏（60 ℃），按糊精：可溶性淀粉为3:2的配比加入适量混合辅料，60 ℃减压干燥，粉碎成细粉，按辅料用量为稠膏量的0.3倍加入剩余辅料，加入88%乙醇制备软材，以12目筛制粒，60 ℃干燥，整粒，包装，12 g/袋，即得,采用上述方法制备三批白虎汤颗粒（三批白虎汤颗粒的编号分别为20171013，20171015，20171017）。

实施例2

知母中芒果苷、新芒果苷的TLC鉴别

供试品溶液的制备：从三批白虎汤颗粒中各称取2 g，研细，分别加甲醇10 mL超声处理30 min，取上清液作为供试品溶液。

芒果苷、新芒果苷对照品溶液的制备：分别精密称取芒果苷、新芒果苷对照品，加甲醇分别制成芒果苷浓度为0.25 mg·mL-1、新芒果苷浓度为0.23 mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。

知母对照药材溶液的制备：称取知母药材粉末0.5 g，同供试品溶液制法制成知母对照药材溶液。

缺知母阴性对照溶液的制备：按处方比例称取除知母外的其它处方药材，按该颗粒的制备工艺制成缺知母阴性颗粒，按供试品溶液制备方法制成缺知母阴性对照溶液。

薄层层析方法：照薄层色谱法（2015版中国药典第四部通则0502)进行试验，分别吸取芒果苷对照品溶液、新芒果苷对照品溶液、知母对照药材溶液、缺知母阴性对照溶液、供试品溶液各5 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇-水（1∶1）为展开剂展开，取出，晾干，置紫外光灯365 nm下检视。结果三批供试品、知母对照药材色谱与对照品色谱相应的位置上，显相同顔色的荧光斑点，而缺知母阴性颗粒处无斑点。结果见图2A-1。

知母中知母皂苷BⅡ的TLC鉴别

供试品溶液的制备：从三批白虎汤颗粒中各称取1 g，研细，分别加30%丙酮10 mL超声处理30 min，取上清液作为供试品溶液。

知母皂苷BⅡ对照品溶液的制备：精密称取知母皂苷BⅡ对照品，加30%丙酮制成浓度为0.56 mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。

缺知母阴性对照溶液的制备：按处方比例称取除知母外的其它处方药材，按颗粒的制备工艺制成缺知母阴性颗粒，按供试品溶液制备方法制成缺知母阴性对照溶液。

薄层层析方法：照薄层色谱法（2015版中国药典第四部通则0502)进行试验，分别吸取对照品溶液、缺知母阴性对照溶液、供试品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶5）为展开剂展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸乙醇试液，置105 °C下加热至斑点显色清晰。结果三批供试品与对照品色谱相应的位置上，显相同顔色的斑点，而缺知母阴性颗粒处无斑点。结果见图2B。

甘草（炙）的TLC鉴别

供试品溶液的制备:从三批白虎汤颗粒中各称取15 g，分别加***40 mL，加热回流1h，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇30 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水40 mL使溶解，用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，作为供试品溶液。

甘草苷对照品溶液的制备:取甘草苷对照品，加甲醇制成每1mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。

缺甘草阴性对照溶液的制备:按处方比例称取除甘草外的其它处方药材，按颗粒的制备工艺制成缺甘草阴性颗粒，按供试品溶液制备方法制成缺甘草阴性对照溶液。

薄层层析方法:照薄层色谱法(2015版中国药典第四部通则0502)试验，吸取缺甘草阴性对照溶液、甘草苷对照品溶液、三批供试品溶液各5 μL，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制成的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，均匀喷10%硫酸乙醇溶液显色，置105 ℃下加热5〜10 min，置紫外光灯（365 nm)下检视。结果三批供试品与对照品色谱相应的位置上，显相同顔色的荧光斑点，缺甘草阴性颗粒处无斑点。结果见图2C。

实施例3

按照2015年版《中国药典》四部通则0104颗粒剂项下的要求对实施例1制备的三批白虎汤颗粒进行粒度、水分、溶化性、装量差异的检查，结果见表1。

表1 三批白虎汤颗粒检查结果

实施例4

1.知母、甘草的HPLC色谱含量测定

1．1色谱条件

色谱柱：Lichrospher C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）高效液相色谱柱；流动相：A乙腈—B25 mmol·L^-1磷酸二氢钾，梯度洗脱（0-2 min，98% B；2-8 min，98%-85% B；8-15 min，85%-78% B；15-20 min，78%-72% B；20-30 min，72%-50% B），柱温30 ℃，流速1 mL·min^-1，检测波长257 nm，进样量10 μL。

1.2 混合对照品溶液的制备

精密称取新芒果苷、芒果苷、甘草苷、甘草酸单铵盐4种对照品适量，用甲醇溶解并定容，制备成混合对照品溶液，其中新芒果苷浓度为26.22 μg·mL^-1、芒果苷浓度为20.38 μg·mL^-1、甘草苷浓度为26.46 μg·mL^-1、甘草酸单铵盐浓度为30.67 μg·mL^-1，经0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

1.3 供试品溶液的制备

白虎汤颗粒研细，取1 g，精密称定，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理（功率250W，频率40 KHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.4 阴性对照溶液的制备

称取除知母、炙甘草以外的其它药材，按本品的制备方法及供试品溶液的制法制成缺知母、炙甘草的阴性对照溶液。阴性对照溶液在与对照品溶液色谱峰相应位置上，未见有色谱峰，表明处方中的石膏、粳米对测定无干扰。

1.5 系统适应性试验

分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL注入高效液相色谱仪，在257 nm处按上述色谱条件检测。结果表明混合对照品溶液和供试品溶液在相同保留时间均呈现吸收峰，而缺知母、甘草阴性对照未出现色谱峰。HPLC图谱见图3。表明该方法无干扰、专属性好。

1.6 线性关系考查

取上述混合对照品溶液，分别进样2、4、6、8、10、12 μL，按“1”项下色谱条件进行HPLC分析，以各对照品峰面积Y（A）为纵坐标，以进样量X（μg）为横坐标，进行线性回归分析，得回归方程与相关系数见表2。结果表明新芒果苷、芒果苷、甘草苷、甘草酸单铵盐进样量分别在0.05244～0.3146 μg，0.04076～0.2446 μg，0.05292～0.3175 μg，0.06134～0.3680 μg范围内线性关系良好。结果分别见表3、4、5、6。

表2 线性关系考查

表3 新芒果苷线性考查结果

表4 芒果苷线性考查结果

表5 甘草苷线性考查结果

表6 甘草酸单铵盐线性考查结果

峰面积（A）

0.755

1.439

2.119

2.682

3.443

4.089

1.7 精密度试验

分别精密吸取混合对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪中，连续测定6次，测定其峰面积积分值，结果新芒果苷、芒果苷、甘草苷、甘草酸单铵盐峰面积的RSD分别为0.063%、0.172%、0.271%、0.293%（n=6）。结果见表7。

表7 精密度考查结果

1.8 稳定性试验

分别精密吸取“3”项下的供试品溶液10 μL，在0、2、4、8、12、24 h各进样一次，共测定6次，测定其峰面积积分值，结果新芒果苷、芒果苷、甘草苷、甘草酸单铵盐峰面积的RSD分别为0.434%、0.645%、0.895%、0.599%（n=6）。可知供试品溶液在24 h内稳定性良好。结果见表8。

表8 稳定性试验结果

1.9 重复性试验

取同一批次白虎汤颗粒样品，按“1.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，测定峰面积积分值，并计算其含量，结果新芒果苷、芒果苷、甘草苷、甘草酸单铵盐的RSD分别为1.147%、1.734%、2.752%、2.123%（n=6），结果表明该方法重复性良好。结果见表9。

表9 重复性试验结果

1.10 加样回收率试验

同一批白虎汤颗粒样品取6份，每份0.5 g，精密称定，分别精密加入新芒果苷、芒果苷、甘草苷、甘草酸单铵盐对照品溶液，以甲醇定容于25 mL容量瓶中，按照“1.1”项下色谱条件分析，分别测定新芒果苷、芒果苷、甘草苷、甘草酸单铵盐的含量，并计算各自的回收率。结果新芒果苷平均回收率为100.31%，RSD=1.731%；芒果苷平均回收率为101.84%，RSD=1.567%；甘草苷平均回收率为99.16%，RSD=2.093%；甘草酸单铵盐平均回收率为99.41%，RSD=2.204%，表明此测定方法回收率良好。结果见表10。

表10 加样回收率试验结果（n=6）

1.11三批样品的含量测定

取3批样品，按“1.3”项下方法制备供试品溶液进行测定，每批次测定2次，测得各成分的平均含量见表11。

表4-11 3批次白虎汤颗粒含量测定结果

白虎汤颗粒由生石膏、知母、炙甘草、粳米4味药材组成，本发明对白虎汤颗粒质量标准的研究中，还对生石膏中的CaSO₄·2H₂0含量进行了测定，结果显示三批白虎汤颗粒中的含量平均为3.9%，而缺石膏阴性颗粒中的含量为1.8%，占样品含量的46%左右，因此没有将CaSO₄·2H₂0含量作为本颗粒的质量标准。

采用HPLC法进行含量测定选择流动相时，对知母中的成分测定时分别选用乙腈-25 mmol·L^-1磷酸二氢钾、乙腈-0.1%甲酸水作流动相，发现都能检测出新芒果苷、芒果苷，对甘草中的成分测定时分别选用乙腈-25 mmol·L^-1磷酸二氢钾、乙腈-0.05%磷酸作流动相，发现都能检测出甘草苷和甘草酸单铵盐，因此，为了节约成本，选用乙腈-25 mmol·L^-1磷酸二氢钾作为流动相同时测定四种成分。

综上，通过运用TLC法建立知母和甘草的鉴别方法，运用HPLC法确定新芒果苷、芒果苷、甘草苷和甘草酸单铵盐的含量测定方法，作为本颗粒的质量标准，此标准较合适，能够比较好的控制白虎汤颗粒的质量。

2.指纹图谱的测定

2.1 测定方法的建立

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Lichrospher C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（C），梯度洗脱：0-4 min，98% A；4-8 min，98%-85% A；8-15 min，85%-78% A；15-20 min，78%-72% A；20-30 min，72%-50% A；30-50 min，50%-35% A；50-60 min，35%-15% A。流速：1.0 mL·min^-1；检测波长：258 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL 。

2.1.2 供试品溶液的制备

白虎汤颗粒研细，取5 g，精密称定，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 对照品溶液的制备

取“2.1.2”项下的混合对照品溶液作为对照品溶液。

2.1.4 精密度试验

精密吸取同一批号的白虎汤颗粒供试品溶液，注入高效液相色谱仪，连续进样6次，每次10 μL，记录色谱图，以6号峰作为参比峰，测定各个共有峰的相对保留时间及相对峰面积，结果6次测定的RSD值均小于3%，说明仪器精密度良好，符合指纹图谱的技术要求（RSD＜5.0%），结果见表12，13。

表12 精密度考查结果（相对保留时间）

表13 精密度考查结果（相对峰面积）

2.1.5 稳定性试验

精密吸取同一批号的白虎汤颗粒供试品溶液，分别在 0、3、6、9、12、24 h各进样一次，每次10 μL，以6号峰作为参比峰，测定各个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果6次测定的RSD值均小于3%，表明白虎汤颗粒样品在24 h内稳定性良好，符合指纹图谱的技术要求，结果见表14，15。

表14 稳定性试验结果（相对保留时间）

表15 稳定性试验结果（相对峰面积）

2.1.6 重复性试验

取同一批号的白虎汤颗粒样品，按“2.1.2”项下的方法制备6份供试品溶液，以6号峰作为参比峰，分别测定各个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果6次测定的RSD值均小于3%，说明该方法重复性良好，符合指纹图谱的技术要求，结果见表16，17。

表16 重复性试验结果（相对保留时间）

表17 重复性试验结果（相对峰面积）

2.2 指纹图谱的建立

取10批白虎汤颗粒研细，每批取5 g，精密称定，按“2.1.2”项下方法分别制备10 批白虎汤颗粒供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，得到10批白虎汤颗粒HPLC指纹图谱，采用中国药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A），采用中位数法对10批样品进行多点校正，时间窗为0.10，自动匹配，形成白虎汤颗粒HPLC指纹图谱共有模式，结果各图谱的相似度均＞96%，结果见表18。

表18 10批样品相似度结果

经分析确定有20个共有峰，以6号峰作为参比峰，计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积，结果见表19、20。通过与对照品HPLC谱图比较，指认6号峰为新芒果苷，8号峰为芒果苷，12号峰为甘草苷，18号峰为甘草酸单铵盐，见图4。实验中对流动相的考查分别用乙腈-25 mmol·L^-1磷酸二氢钾、乙腈-0.1%甲酸水，比较发现乙腈-0.1%甲酸水条件下的峰数更多且峰形也较好，因此选择乙腈-0.1%甲酸水溶液作流动相。提取溶剂的选择分别对甲醇、稀乙醇、70%乙醇、70%甲醇进行比较，结果用甲醇作为提取溶剂时峰数更多，所以选择甲醇作为提取溶剂。对检测波长进行考查，分别选取220 nm、230 nm、240 nm、250 nm、258 nm、268nm、280 nm、300 nm波长进行检测，结果在258 nm波长下的峰个数较多且峰形较好，所以将258 nm作为检测波长。

制剂质量标准的研究，采用薄层色谱法分别对知母中的新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ，炙甘草中的甘草苷进行了鉴别，结果知母、炙甘草的TLC鉴别阴性无干扰，且斑点显色清晰，重复性好。对白虎汤颗粒中的新芒果苷、芒果苷、甘草苷、甘草酸单铵盐采用HPLC法同时进行含量测定，结果所建立的方法简便、灵敏、准确性、重复性好，可以作为本制剂的含量测定方法。建立了白虎汤颗粒的指纹图谱，确定有20个共有峰，其中6号峰为新芒果苷，8号峰为芒果苷，12号峰为甘草苷，18号峰为甘草酸单铵盐，10批白虎汤颗粒的相似度均＞96%。制剂的初步稳定性研究，采用留样观察法进行了6个月的初步稳定性试验，结果三批颗粒均没有明显变化，质量稳定。

表19 10批白虎汤颗粒指纹图谱相对保留时间

表20 10批白虎汤颗粒指纹图谱相对峰面积