一种利用薄层色谱快速鉴别杜仲叶和皮三种活性成分的方法
阅读说明：本技术 一种利用薄层色谱快速鉴别杜仲叶和皮三种活性成分的方法 (Method for rapidly identifying three active ingredients of folium cortex eucommiae and cortex eucommiae by thin-layer chromatography ) 是由 王志宏 彭密军 王翔 杨秋玲 于 2019-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用薄层色谱快速鉴别杜仲叶和皮三种活性成分的方法。该方法包括以下步骤：1)分别配制桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和绿原酸对照品溶液；2)分别配制杜仲叶和皮的待测样品溶液；3)使用定量毛细管分别吸取对照品溶液和待测样品溶液适量,点样于GF 254硅胶板,以乙酸丁酯：甲醇：甲酸为混合溶剂作为展开剂,通过254nm紫外灯观察和5.0％硫酸-乙醇溶液为显色剂进行薄层色谱鉴别,观察样品溶液的薄层色谱硅胶板中出现斑点的位置和颜色。结果显示,所得的色谱图中杜仲叶和皮的三种活性成分呈现不同的斑点。本发明鉴别方法专属性强,操作方便,可用于同时快速准确鉴别杜仲叶和皮中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和绿原酸。(The invention discloses a method for rapidly identifying three active ingredients of folium cortex eucommiae and cortex eucommiae by using thin-layer chromatography. The method comprises the following steps: 1) respectively preparing aucubin, geniposide and chlorogenic acid reference substance solutions; 2) respectively preparing to-be-detected sample solutions of eucommia ulmoides leaves and cortex; 3) respectively sucking appropriate amounts of a reference substance solution and a sample solution to be detected by using a quantitative capillary, spotting on a GF 254 silica gel plate, and adding butyl acetate: methanol: formic acid is used as a mixed solvent as a developing agent, thin-layer chromatography identification is carried out by using a 254nm ultraviolet lamp for observation and using a 5.0% sulfuric acid-ethanol solution as a color developing agent, and the position and the color of spots appearing in a thin-layer chromatography silica gel plate of a sample solution are observed. The results show that the obtained chromatogram shows different spots of the three active ingredients of the leaves and the bark of eucommia ulmoides. The identification method has strong specificity and convenient operation, and can be used for simultaneously, rapidly and accurately identifying aucubin, geniposide and chlorogenic acid in eucommia ulmoides leaves and barks.)
技术领域
本发明属于中药药材鉴别技术领域，具体涉及一种利用薄层色谱快速鉴别杜仲叶和皮三种活性成分的方法。
背景技术
杜仲叶(Eucommia ulmoides Oliv.leaves)是杜仲科杜仲属植物杜仲的干燥的叶，主要采集于夏秋两季枝叶茂盛时期，经微波杀青后，晒干或低温烘干。现代研究表明，杜仲叶与皮化学成分较为相近，部分可以叶代皮。杜仲叶中富含多酚、环烯醚萜类以及黄酮类等活性成分，具有降血压、降血脂、增强免疫、抗炎、抗氧化、抑菌等活性功效，具有较高的开发价值。杜仲叶从2005年开始被收载于《中国药典》，其中杜仲叶的鉴别方法主要是按照薄层色谱法，通过硅胶H薄层板，以绿原酸为观察指标，在紫外灯365nm条件下检视，观察荧光斑点。该方法虽然可以较为明显的识别到绿原酸化合物，但是就鉴别杜仲叶资源，由于目标化合物较为单一，所以该方法仍有改进空间。目前关于杜仲叶鉴别的方法，除检视绿原酸以外，已报道的文献还有以桃叶珊瑚苷为特征化合物，但是由于不同化合物的极性差异、显色方法以及检视方法的不同，通常以单一化合物和单一检视方法居多。因此能够建立一种快速且更为准确的方法鉴别杜仲叶、识别其中特征化合物具有非常广泛的应用前景。2018年4月，国家卫健委拟将杜仲叶作为既是食品又是中药材的物质管理，所以确保杜仲资源的道地性，从源头严格控制杜仲资源的质量品质对于杜仲叶行业的发展具有重要的意义。通过对杜仲叶化学成分分析结果发现，杜仲叶中绿原酸含量较高，除此之外，与其它化合物相比，桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸的含量也较为可观，并且也属于是杜仲叶中有代表性的特征化合物。杜仲皮是我国传统的珍贵中药材，具有“三降六抗一增”等功效，药用价值非常高，同时绿原酸、桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸也是杜仲皮中的主要特征成分。因此开发一种高效并且能够同时定性分析桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和绿原酸的方法对于快速且更为准确的鉴别杜仲叶与皮以及相关化合物的识别具有重要的研究价值。
尽管从技术层面讲，通过精密仪器分析(如高效液相色谱等)可以实现对杜仲叶和皮中三种化合物的鉴别与区分，然而目前尚未见到有用简便易行、高效准确的方法实现杜仲叶和皮中三种特征成分的同时鉴别区分。而这一现实问题也是本领域技术人员迫切解决的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用薄层色谱快速鉴别杜仲叶和皮三种活性成分的方法。
本发明采取的技术方案如下：
一种利用薄层色谱快速鉴别杜仲叶和皮三种活性成分的方法，包括以下步骤：
(1)分别准确称取桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和绿原酸对照品，用甲醇或乙醇溶液溶解，配制各对照品溶液；
(2)准确称取杜仲叶和皮待测样品粉末，分别置于具塞锥形瓶中，用甲醇或乙醇溶液溶解，超声或加热辅助处理，室温冷却，过滤，滤液即为待测样品溶液；
(3)使用定量毛细管分别吸取步骤(1)制得的不同对照品溶液和步骤(2)制得的不同待测样品溶液5～15μL，依次点样于同一GF 254薄层硅胶板中的同一水平线的不同位置；
(4)以乙酸丁酯-甲醇-甲酸为展开剂，按照一定体积比进行薄层层析，待层析结束后，将薄层硅胶板取出，晾干；
(5)对薄层硅胶板的斑点进行检出，鉴别桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和绿原酸。
所述步骤(5)对薄层硅胶板的斑点进行检出，是通过以下方法进行的：
通过紫外灯分析仪于254nm波长检视步骤(4)中得到的薄层硅胶板，比较色谱图中的特征斑点；
对照品溶液与待测样品溶液中的绿原酸在比移值Rf在0.48～0.71范围内，出现明显的斑点；
对照品溶液与待测样品溶液中京尼平苷酸在比移值Rf为0.37～0.61范围内，也出现明显斑点；
在上述紫外灯下检视之后的同一块薄层硅胶板，均匀的喷洒5.0％硫酸-乙醇显色剂，并于105℃条件下加热5min，观察薄层色谱硅胶板的斑点变化；
经过显色与加热之后的薄层硅胶板，对照品溶液与待测样品溶液中的桃叶珊瑚苷在比移值Rf为0.25～0.50范围内出现相应的斑点。依据展开溶剂比例的不同，杜仲中三种不同活性成分会在对应范围内出现相应斑点，且呈现较好的分离效果。另外展开剂使用量体积比超出本范围，样品分离效果不明显。
优选，所述步骤(1)的甲醇或乙醇溶液为含甲醇或乙醇的体积分数为60～100％的水溶液，对照品溶液的浓度为1.0mg/mL。
优选，所述步骤(2)的待测样品粉末过20～100目筛，称取量为0.1～1.0g。
优选，所述步骤(2)的甲醇或乙醇溶液为含甲醇或乙醇的体积分数为50～100％的水溶液。
优选，所述步骤(2)的超声或加热辅助处理具体为：超声辅助溶解10～30min，或70℃水浴加热10～30min。
优选，所述步骤(4)的展开剂为乙酸丁酯-甲醇-甲酸按体积比为(6.0～8.5):(1.5～4.5):(0.5～2.5)组成。
优选，所述步骤(4)的进行薄层层析是一次展开，且在展开之前，层析缸内的溶剂应预饱和20～30min。
优选，所述步骤(2)的待测样品粉末是按照以下方法制备得到：将新鲜的杜仲叶和皮微波杀青后，于45-60℃下烘干或烤干，去除杂质，避光干燥保存；将干燥的杜仲叶和皮分别通过高速万能粉碎机进行粉碎，过20～100目筛，得到样品粉末；将样品粉末用50～80％v/v乙醇溶液超声辅助提取两次，每次0.5h，料液比1:1～20，待提取结束，提取液在60℃条件下减压浓缩，当固形物含量达到20％时，通过喷雾干燥得到棕黄色均一粉末样品，过80目筛，混合均匀，密封保存，得到待测样品粉末。
优选，所述步骤(2)的待测样品溶液是按照以下方法配制的：取待测样品粉末样品0.1g置于具塞比色管中，加入10mL体积分数为50～100％甲醇或乙醇溶液，充分摇匀，超声辅助或加热辅助溶解10min，室温冷却，过滤，滤液即为待测样品溶液。
上述步骤(4)的薄层层析是在双槽薄层色谱层析缸中进行展开的，所述的展开是按照以下步骤(a)和(b)进行：
(a)准确移取适量的乙酸丁酯、甲醇和甲酸溶液，按照体积比(6.0～8.5):(1.5～4.5):(0.5～2.5)混合均匀，得到展开剂；将展开剂置于干燥洁净的双槽薄层层析缸的第一个槽中；
(b)将点样后的薄层板置于上述步骤(a)的双槽薄层层析缸的第二个槽中，密闭缸盖，预饱和5-30min(优选20-30min)后，将上述双槽薄层色谱层析缸第一个槽的展开剂转移至放置有薄层色谱板的第二个操作进行展开，展开剂液面不应高于点样的水平线，层析距离为9.0cm，待结束层析，取出薄层硅胶板，晾干。
本发明的GF 254薄层硅胶板可以是自制薄层硅胶板，也可以是从市售途径得到的。
本发明的有益效果为：
本发明的薄层色谱鉴别方法专属性强，操作方便，所得的薄层色谱图中杜仲叶和皮的三种不同特征成分(桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和绿原酸)呈现不同的斑点，可用于同时快速准确鉴别杜仲叶和皮中的桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和绿原酸。
附图说明
图1为实施例1的薄层色谱图。其中A与B为同一薄层硅胶板，图1(A)为在紫外灯条件下薄层色谱斑点的呈现，图1(B)为在喷洒显色剂之后，在加热条件下，对应斑点的变化情况。
图2为实施例2的薄层色谱图。其中A与B为同一薄层硅胶板，图2(A)为在紫外灯条件下薄层色谱斑点的呈现，图2(B)为在喷洒显色剂之后，在加热条件下，对应斑点的变化情况。
图3为实施例3的薄层色谱图。其中A与B为同一薄层硅胶板，图3(A)为在紫外灯条件下薄层色谱斑点的呈现，图3(B)为在喷洒显色剂之后，在加热条件下，对应斑点的变化情况。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
一种利用薄层色谱快速鉴别杜仲叶和皮三种活性成分的方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
依次准确称取桃叶珊瑚苷对照品10.1mg、京尼平苷酸对照品10.0mg和绿原酸对照品10.3mg，分别用体积分数为60％的甲醇溶液充分溶解，定容至10mL，配制成桃叶珊瑚苷浓度为1.01mg/mL、京尼平苷酸浓度为1.00mg/mL和绿原酸浓度为1.03mg/mL的标准对照品溶液。
(2)杜仲叶和皮待测样品溶液的制备
于7-8月份采集新鲜的杜仲叶和皮，微波杀青后，于45℃低温烘干，去除杂质，避光干燥保存；将干燥的杜仲叶和皮分别通过高速万能粉碎机进行粉碎，过100目筛，得到样品粉末，将样品粉末用50％v/v乙醇溶液超声辅助提取两次，每次0.5h，料液比1:15，待提取结束，提取液在60℃条件下减压浓缩，当固形物含量达到20％时，得到棕黄色均一粉末样品，过80目筛，混合均匀，密封保存，得到杜仲叶或皮的待测样品粉末；
分别称取杜仲叶或皮的待测样品粉末约0.1g，分别置于具塞比色管中，加入10mL体积分数为50％的甲醇溶液，充分摇匀，超声辅助溶解10min，室温冷却，过滤，滤液即为杜仲叶或皮的待测样品溶液。
(3)点样
使用定量毛细管分别吸取上述步骤(1)制得的不同对照品溶液和步骤(2)制得的不同待测样品溶液各10μL，依次点样于同一GF 254薄层硅胶板的同一水平线的不同位置，样品之间应有合适的间隔(约1.0cm)，并且两端点样原点应距离薄层硅胶板边缘大于0.5cm，避免边缘效应。
(4)展开
将点样后的薄层硅胶板在双槽薄层色谱层析缸中进行展开，所述的展开是按照以下步骤(a)和(b)进行：
(a)准确移取适量的乙酸丁酯、甲醇和甲酸溶液，按照体积比6.3:1.5:1.0混合均匀，得到展开剂；将展开剂置于干燥洁净的双槽薄层层析缸的第一个槽中；
(b)将点样后的薄层硅胶板置于上述步骤(a)的双槽薄层层析缸的第二个槽中，密闭缸盖，常温密封保存，预饱和30min，将上述双槽薄层色谱层析缸第一个槽中的展开剂转移至放置有薄层色谱板的第二个槽中进行展开，在展开剂转移的过程中，展开剂体积需适量，展开剂液面不应高于点样的水平线，在常温环境中进行薄层层析，层析距离为9.0cm，待结束层析，取出薄层硅胶板，晾干，完成薄层层析。
(5)斑点的检出
将步骤(4)中的薄层硅胶板置于254nm波长的紫外灯下检视，比较色谱图中的特征斑点。
对照品溶液与待测样品溶液中的绿原酸在比移值Rf为0.53，出现明显的斑点；
对照品溶液与待测样品溶液中京尼平苷酸在比移值Rf为0.41，出现明显斑点；
配制5.0％硫酸-乙醇溶液显色剂(取5mL硫酸加乙醇稀释至100mL)，混合均匀。通过薄层手动喷雾器，在上述紫外灯下检视之后的同一块薄层硅胶板，均匀的喷洒5.0％硫酸-乙醇显色剂，并于105℃条件下加热5min，观察薄层色谱硅胶板的斑点变化；
经过显色与加热之后的薄层硅胶板，对照品溶液与待测样品溶液中的桃叶珊瑚苷在比移值Rf为0.30的位置出现相应的斑点，同时在Rf为0.41和0.53位置，没有明显的观察到京尼平苷酸与绿原酸相应的斑点。具体分析结果见图1，A与B为同一薄层硅胶板，其中图1(A)为在紫外灯条件下薄层色谱斑点的呈现，图1(B)为在喷洒显色剂之后，在加热条件下，对应斑点的变化情况。
实施例2
一种利用薄层色谱快速鉴别杜仲叶和皮三种活性成分的方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
依次准确称取桃叶珊瑚苷对照品10.1mg、京尼平苷酸对照品10.0mg和绿原酸对照品10.3mg，分别用体积分数为100％的甲醇溶液充分溶解，定容至10mL，配制成桃叶珊瑚苷浓度为1.01mg/mL、京尼平苷酸浓度为1.00mg/mL和绿原酸浓度为1.03mg/mL的标准对照品溶液。
(2)杜仲叶和皮待测样品溶液的制备
于7-8月份采集新鲜的杜仲叶和皮，微波杀青后，于60℃低温烘干，去除杂质，避光干燥保存；将干燥的杜仲叶和皮分别通过高速万能粉碎机进行粉碎，过100目筛，得到样品粉末，将样品粉末用80％v/v乙醇溶液超声辅助提取两次，每次0.5h，料液比1:20，待提取结束，提取液在60℃条件下减压浓缩，当固形物含量达到20％时，得到棕黄色均一粉末样品，过80目筛，混合均匀，密封保存，得到杜仲叶或皮的待测样品粉末；
分别称取杜仲叶或皮的待测样品粉末约0.1g，分别置于具塞比色管中，加入10mL体积分数为100％的甲醇溶液，充分摇匀，70℃水浴加热辅助溶解10min，室温冷却，过滤，滤液即为杜仲叶或皮的待测样品溶液。
(3)点样
使用定量毛细管分别吸取上述步骤(1)制得的不同对照品溶液和步骤(2)制得的不同待测样品溶液各15μL，依次点样于同一GF 254薄层硅胶板的同一水平线的不同位置，样品之间应有合适的间隔(约1.0cm)，并且两端点样原点应距离薄层硅胶板边缘大于0.5cm，避免边缘效应。
(4)展开
将点样后的薄层硅胶板在双槽薄层色谱层析缸中进行展开，所述的展开是按照以下步骤(a)和(b)进行：
(a)准确移取适量的乙酸丁酯、甲醇和甲酸溶液，按照体积比6.5:2.0:1.5混合均匀，得到展开剂；将展开剂置于干燥洁净的双槽薄层层析缸的第一个槽中；
(b)将点样后的薄层硅胶板置于上述步骤(a)的双槽薄层层析缸的第二个槽中，密闭缸盖，常温密封保存，预饱和20min，将上述双槽薄层色谱层析缸第一个槽中的展开剂转移至放置有薄层色谱板的第二个槽中进行展开，在展开剂转移的过程中，展开剂体积需适量，展开剂液面不应高于点样的水平线，在常温环境中进行薄层层析，层析距离为9.0cm，待结束层析，取出薄层硅胶板，晾干，完成薄层层析。
(5)斑点的检出
将步骤(4)中的薄层硅胶板置于254nm波长的紫外灯下检视，比较色谱图中的特征斑点。
对照品溶液与待测样品溶液中的绿原酸在比移值Rf为0.60，出现明显的斑点；
对照品溶液与待测样品溶液中京尼平苷酸在比移值Rf为0.48，出现明显斑点；
配制5.0％硫酸-乙醇溶液显色剂(取5mL硫酸加乙醇稀释至100mL)，混合均匀。通过薄层手动喷雾器，在上述紫外灯下检视之后的同一块薄层硅胶板，均匀的喷洒5.0％硫酸-乙醇显色剂，并于105℃条件下加热5min，观察薄层色谱硅胶板的斑点变化；
经过显色与加热之后的薄层硅胶板，对照品溶液与待测样品溶液中的桃叶珊瑚苷在比移值Rf为0.36的位置出现相应的斑点，同时在Rf＝0.48附近也会出现京尼平苷酸对应的斑点，但是在Rf＝0.60位置没有观察到绿原酸相应的斑点。具体分析结果见图2，A与B为同一薄层硅胶板，其中图2(A)为在紫外灯条件下薄层色谱斑点的呈现，图2(B)为在喷洒显色剂之后，在加热条件下，对应斑点的变化情况。
实施例3
一种利用薄层色谱快速鉴别杜仲叶和皮三种活性成分的方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
依次准确称取桃叶珊瑚苷对照品10.1mg、京尼平苷酸对照品10.0mg和绿原酸对照品10.3mg，分别用体积分数为60％的乙醇溶液充分溶解，定容至10mL，配制成桃叶珊瑚苷浓度为1.01mg/mL、京尼平苷酸浓度为1.00mg/mL和绿原酸浓度为1.03mg/mL的标准对照品溶液。
(2)杜仲叶和皮待测样品溶液的制备
于7-8月份采集新鲜的杜仲叶和皮，微波杀青后，于50℃低温烘干，去除杂质，避光干燥保存；将干燥的杜仲叶和皮分别通过高速万能粉碎机进行粉碎，过20目筛，得到样品粉末，将样品粉末用70％v/v乙醇溶液超声辅助提取两次，每次0.5h，料液比1:10，待提取结束，提取液在60℃条件下减压浓缩，当固形物含量达到20％时，得到棕黄色均一粉末样品，过80目筛，混合均匀，密封保存，得到杜仲叶或皮的待测样品粉末；
分别称取杜仲叶或皮的待测样品粉末约0.1g，分别置于具塞比色管中，加入10mL体积分数为50％的乙醇溶液，充分摇匀，70℃水浴加热辅助溶解30min，室温冷却，过滤，滤液即为杜仲叶或皮的待测样品溶液。
(3)点样
使用定量毛细管分别吸取上述步骤(1)制得的不同对照品溶液和步骤(2)制得的不同待测样品溶液各5μL，依次点样于同一GF 254薄层硅胶板的同一水平线的不同位置，样品之间应有合适的间隔(约1.0cm)，并且两端点样原点应距离薄层硅胶板边缘大于0.5cm，避免边缘效应。
(4)展开
将点样后的薄层硅胶板在双槽薄层色谱层析缸中进行展开，所述的展开是按照以下步骤(a)和(b)进行：
(a)准确移取适量的乙酸丁酯、甲醇和甲酸溶液，按照体积比6.7:2.5:2混合均匀，得到展开剂；将展开剂置于干燥洁净的双槽薄层层析缸的第一个槽中；
(b)将点样后的薄层硅胶板置于上述步骤(a)的双槽薄层层析缸的第二个槽中，密闭缸盖，常温密封保存，预饱和20min，将上述双槽薄层色谱层析缸第一个槽中的展开剂转移至放置有薄层色谱板的第二个槽中进行展开，在展开剂转移的过程中，展开剂体积需适量，展开剂液面不应高于点样的水平线，在常温环境中进行薄层层析，层析距离为9.0cm，待结束层析，取出薄层硅胶板，晾干，完成薄层层析。
(5)斑点的检出
将步骤(4)中的薄层硅胶板置于254nm波长的紫外灯下检视，比较色谱图中的特征斑点。
对照品溶液与待测样品溶液中的绿原酸在比移值Rf为0.64，出现明显的斑点；
对照品溶液与待测样品溶液中京尼平苷酸在比移值Rf为0.54，出现明显斑点；
配制5.0％硫酸-乙醇溶液显色剂(取5mL硫酸加乙醇稀释至100mL)，混合均匀。通过薄层手动喷雾器，在上述紫外灯下检视之后的同一块薄层硅胶板，均匀的喷洒5.0％硫酸-乙醇显色剂，并于105℃条件下加热5min，观察薄层色谱硅胶板的斑点变化；
经过显色与加热之后的薄层硅胶板，对照品溶液与待测样品溶液中的桃叶珊瑚苷在比移值Rf为0.41的位置出现相应的斑点，同时在Rf＝0.54和0.64位置没有观察到京尼平苷酸和绿原酸相应的斑点。具体分析结果见图3，A与B为同一薄层硅胶板，其中图3(A)为在紫外灯条件下薄层色谱斑点的呈现，图3(B)为在喷洒显色剂之后，在加热条件下，对应斑点的变化情况。
实施例4
一种利用薄层色谱快速鉴别杜仲叶和皮三种活性成分的方法，其步骤与实施例2比较，区别在于所述的展开剂为乙酸丁酯-甲醇-甲酸按照体积比8.5:4.5:2.5混合组成，其余步骤同实施例2相同，结果为如下：
将薄层硅胶板置于254nm波长的紫外灯下检视，比较色谱图中的特征斑点。
对照品溶液与待测样品溶液中的绿原酸在比移值Rf为0.71，出现明显的斑点；
对照品溶液与待测样品溶液中京尼平苷酸在比移值Rf为0.61，出现明显斑点；
配制5.0％硫酸-乙醇溶液显色剂(取5mL硫酸加乙醇稀释至100mL)，混合均匀。通过薄层手动喷雾器，在上述紫外灯下检视之后的同一块薄层硅胶板，均匀的喷洒5.0％硫酸-乙醇显色剂，并于105℃条件下加热5min，观察薄层色谱硅胶板的斑点变化；
经过显色与加热之后的薄层硅胶板，对照品溶液与待测样品溶液中的桃叶珊瑚苷在比移值Rf为0.50的位置出现相应的斑点，同时在Rf＝0.61和0.71位置没有观察到京尼平苷酸和绿原酸相应的斑点。
实施例5
一种利用薄层色谱快速鉴别杜仲叶和皮三种活性成分的方法，其步骤与实施例2比较，区别在于所述的展开剂为乙酸丁酯：甲醇：甲酸按照体积比6.0:1.5:0.5混合组成，其余步骤同实施例2相同，结果为如下：
将薄层硅胶板置于254nm波长的紫外灯下检视，比较色谱图中的特征斑点。
对照品溶液与待测样品溶液中的绿原酸在比移值Rf为0.48，出现明显的斑点；
对照品溶液与待测样品溶液中京尼平苷酸在比移值Rf为0.37，出现明显斑点；
配制5.0％硫酸-乙醇溶液显色剂(取5mL硫酸加乙醇稀释至100mL)，混合均匀。通过薄层手动喷雾器，在上述紫外灯下检视之后的同一块薄层硅胶板，均匀的喷洒5.0％硫酸-乙醇显色剂，并于105℃条件下加热5min，观察薄层色谱硅胶板的斑点变化；
经过显色与加热之后的薄层硅胶板，对照品溶液与待测样品溶液中的桃叶珊瑚苷在比移值Rf为0.26的位置出现相应的斑点，同时在Rf＝0.37和0.48位置没有观察到京尼平苷酸和绿原酸相应的斑点。
本发明通过大量试验发现，依据展开溶剂比例的不同，杜仲中三种不同活性成分会在对应范围内出现相应斑点，且呈现较好的分离效果。但当展开剂使用量体积比超出本发明的范围—乙酸丁酯-甲醇-甲酸体积比＝(6.0～8.5):(1.5～4.5):(0.5～2.5)，样品分离效果不明显。同时，改变展开剂的组成同样不能将绿原酸、京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷有效分离。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。