联苯苄唑在制备治疗或预防流感病毒感染的药物中的应用
阅读说明：本技术 联苯苄唑在制备治疗或预防流感病毒感染的药物中的应用 (Application of bifonazole in preparation of medicine for treating or preventing influenza virus infection ) 是由 陈绪林 刘歌 于 2019-06-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了联苯苄唑(Bifonazole)在制备预防或治疗流感病毒感染药物中的应用。在人单核细胞U937模型上检测了联苯苄唑对细胞的毒性和抗流感活性以及抗炎活性。结果显示联苯苄唑具有显著的抗病毒活性,能够抑制由流感感染诱导的促炎细胞因子释放。在人肺上皮细胞系A549和犬肾细胞系MDCK上,联苯苄唑也具有显著的抗病毒活性。在致死性小鼠流感感染模型中,联苯苄唑可以有效降低感染小鼠肺洗液中的病毒滴度、延缓小鼠体重下降速度、延长小鼠存活时间并提高小鼠存活率。本发明披露的联苯苄唑是一种新型兼具免疫调理活性的抗流感病毒药物,具备安全性好、选择指数高且动物模型实验有效等优点,可以用于开发预防或治疗流感病毒感染的药物。(the invention discloses application of Bifonazole (Bifonazole) in preparing a medicament for preventing or treating influenza virus infection. Toxicity and anti-influenza activity and anti-inflammatory activity of bifonazole on cells were tested on a human monocyte U937 model. The results show that bifonazole has remarkable antiviral activity and can inhibit the release of proinflammatory cytokines induced by influenza infection. Bifonazole also has significant antiviral activity on the human lung epithelial cell line a549 and the canine kidney cell line MDCK. In a lethal mouse influenza infection model, the bifonazole can effectively reduce the virus titer in lung washing liquor of an infected mouse, delay the weight loss speed of the mouse, prolong the survival time of the mouse and improve the survival rate of the mouse. The bifonazole disclosed by the invention is a novel anti-influenza virus medicament with immunoregulation activity, has the advantages of good safety, high selection index, effective animal model experiment and the like, and can be used for developing medicaments for preventing or treating influenza virus infection.)
技术领域
本发明属于医药技术领域，主要涉及联苯苄唑在制备治疗或预防流感病毒感染的药物中的应用背景技术
流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，流感病毒属。根据病毒粒子核蛋白(NP)和基质蛋白(M)的抗原特性及基因特性的不同，流感病毒分为A、B、C三型，也称甲、乙、丙三型。A型流感病毒全基因组由8条大小不等的单股负链RNA组成，分别以节段1至节段8命名。病毒基因组全长约13.6kb，编码10种结构蛋白(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、PB1-F2和NS2/NEP)和非结构蛋白(NS1)。根据病毒粒子表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同，A型流感病毒可进一步分为17个H(H1-H17)和10个N(N1-N10)亚型。人流感病毒主要是H1,H2和H3亚型。而目前危害严重的高致病性禽流感多为H5、H7和H9亚型，其中以H5N1亚型致死率最高。B型流感病毒常引起流感局部流行，不引起世界性流感大爆发，仅在人和海豹中发现。C型流感病毒多以散在形式存在，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行，可感染人类和猪。
流感病毒自20世纪初发现以来已在全球范围内造成五次大流行，十年左右会产生一次暴发流行，在全球范围内造成了巨大的损失。流感流行每年可导25万～50万例死亡，300万～500万重病例，全球约共有5～15％的人被感染。目前，对抗流感感染的治疗策略主要可分为抗病毒疗法和抗炎免疫调理疗法两种。抗病毒治疗控制流感流行的首要方法，并且在大流行爆发时作为主要的预防和治疗药物发挥核心作用。迄今为止，只有两类抗病毒药物被全球批准并可用于治疗流感感染，分别是流感病毒M2离子通道阻滞剂和流感病毒神经氨酸酶(NA)抑制剂。尽管M2阻滞剂在过去具有很好的抗病毒效果，但随着耐药性毒株的不断出现，世界卫生组织已于2009年将金刚烷胺和金刚乙胺从推荐临床使用的抗流感药物清单中排除。因此，NA抑制剂是目前WHO推荐的唯一流感抗病毒药物。神经氨酸酶抑制剂的代表是奥斯他韦和扎拉米韦，此类药物对所有已知的人流感病毒及高致病性禽流感病毒均有效。但是近年来奥斯他韦的耐药株不断出现，因此，研究并开发新型抗流感病毒药物有重要意义。
另一方面，严重流感感染所诱发的炎症会导致多种病理情况的发生，包括氧化应激增加、细胞凋亡、坏死、粘连改变和免疫细胞向肺的迁移等。此外，这些病理反应会诱导额外的二级促炎因子和细胞因子的释放，导致炎症反应扩大、细胞和组织损伤增加。因此，针对流感诱导的过度炎症反应，单独使用抗炎免疫调理药物或者与抗病毒剂联合治疗可能会取得更好的疗效，并越来越引起研究者的注意。然而，不幸的是，针对流感感染引发的过度炎症以及其导致的致死性并发症，目前还没有一种抗炎药物完全的通过了临床试验，并确认对于人类患者具有治疗效果。因此，对于新型抗流感免疫调理药物的需求极为迫切。
联苯苄唑一种咪唑类抗真菌药物，它于1974年获得专利并于1983年批准用于医学用途。联苯苄唑通过抑制真菌细胞膜的必须成分麦角甾醇的产生而发挥作用。麦角甾醇的抑制会使真菌细胞色素p450不稳定，导致细胞裂解，进而杀死真菌。到目前为止，并未发现有关联苯苄唑抗流感病毒的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供了一种小分子化合物联苯苄唑在制备治疗或预防流感病毒感染药物中的应用，从而为临床上流感的治疗提供一种安全有效的小分子化合物。联苯苄唑在无毒性范围内能够有效地抑制流感病毒的复制，可进一步开发为治疗或预防流感病毒感染疾病的药物，具有广泛的应用前景。联苯苄唑的英文名为Bifonazole，化学名为(±)1-(α-联苯-4-基苄基)-1H-咪唑，具有结构式Ⅰ所示的结构：
为了实现上述的目的，本发明采用的技术方案是：
联苯苄唑在制备治疗或预防流感病毒感染药物中的应用：
1在U937流感感染模型中评价联苯苄唑的毒性、抗病毒活性以及对重要促炎因子CCL2和CXCL10的抑制活性，并计算其选择指数，其步骤如下：
(1)将人单核细胞系U937以合适密度铺至96孔板中，若要检测抗病毒效果，则同时感染合适浓度的流感病毒(A/PuertoRico/8/34(H1N1))。
(2)同时加入用培养基稀释成不同浓度梯度的联苯苄唑至上述孔中，培养48h。
(3)检测药物处理组与未处理组的细胞活力，以检测联苯苄唑的细胞毒性。
(4)检测药物处理组与未处理组上清中流感病毒神经氨酸酶活性，以评估联苯苄唑抗病毒活性。
(5)检测药物处理组与未处理组上清中促炎因子CCL2和CXCL10的含量，以评估联苯苄唑的抗炎活性。
(6)计算联苯苄唑在U937上的抗病毒和抗炎选择指数。
2在不同细胞系上评价联苯苄唑的毒性及抗病毒效果，其步骤如下：
(1)将人肺上皮细胞系A549和犬肾细胞系MDCK以合适密度铺至96孔板中，以合适密度铺至96孔板中，培养18-24h。待其长成单层后，加入用培养基稀释成不同浓度梯度的联苯苄唑，培养48h，以检测药物毒性。
(2)若检测抗病毒效果，则将上述单层细胞以适当浓度感染流感病毒(A/PuertoRico/8/34(H1N1))并加入不同浓度梯度的联苯苄唑，培养48h。
(3)检测药物处理组与未处理组的细胞活力，以检测联苯苄唑的细胞毒性。
(4)检测药物处理组与未处理组上清中流感病毒神经氨酸酶活性，以评估联苯苄唑抗病毒活性。
(5)计算联苯苄唑在两种细胞系上的选择指数。
3联苯苄唑抗病毒效果的广谱性分析
(1)将人肺上皮细胞系A549以合适密度铺至96孔板中，在细胞培养箱中培养18-24h且长成单层后，以1MOI的不同流感毒株感染细胞(包括A/Human/Hubei/1/2009(H1N1)，A/human/Hubei/3/2005(H3N2)，A/Duck/Hubei/216/1983(H7N8))，同时加入不同浓度梯度的药物，培养48h。
(2)检测药物处理组与未处理组上清中流感病毒神经氨酸酶活性，以评估药物抗病毒广谱性。
4在动物致死性流感感染模型中评价联苯苄唑在动物活体内的抗病毒效果，其步骤如下：
(1)建立小鼠致死性流感感染动物模型。
(2)通过腹腔给药的方式用联苯苄唑治疗感染小鼠，连续七天，每天两次。
(3)感染后第三天，即病毒复制高峰期，取对照组与药物处理组小鼠肺灌洗液，检测其中流感病毒滴度。
(4)每天记录小鼠体重，死亡率，并绘制体重变化曲线和小鼠存活率曲线。
(5)以感染后小鼠体重变化、存活率、肺灌洗液中病毒滴度来评价联苯苄唑效果。
所述的流感病毒包括但不限于：甲型流感病毒H1N1亚型(A/PuertoRico/8/1934)、H3N2亚型(A/Human/Hubei/3/2005)、H7N8亚型(A/Duck/Hubei/216/1983)。
本发明的保护范围还包括：
联苯苄唑在制备体外抑制流感病毒复制药物中的应用；
联苯苄唑作为唯一有效成分在制备治疗或预防流感病毒感染药物中的应用；
联苯苄唑在制备治疗小鼠流感病毒感染药物中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1联苯苄唑是小分子化合物，其在U937、A549和MDCK细胞中CC50(半数致死浓度)均大于150μM。其在三种细胞系上均能够剂量依赖的抑制H1N1PR8流感病毒的复制，其在U937细胞中的IC50(半数抑制浓度)仅为1.86μM，在A549上的EC50为5.7μM。通过计算，联苯苄唑的选择指数(SI)在U937大于80，在A549细胞上大于30，说明其具有安全高效的特点。
2联苯苄唑能够剂量依赖的抑制甲型流感H1N1亚型、H3N2亚型和H7N8亚型病毒的复制，具有良好的广谱抗病毒活性。
3联苯苄唑在小鼠致死性流感感染模型中有保护效果，可以显著降低小鼠体重下降程度，降低小鼠肺洗液中的病毒滴度，提高小鼠的存活时间和最终生存率。这使得联苯苄唑具有很大的临床治疗潜力。
4联苯苄唑已经在上市多年，安全性良好，且具有大量的临床实验数据，若将其作为流感治疗用药，可显著降低临床试验时间，节省大量成本。
附图说明
图1联苯苄唑在U937中的毒性、抗病毒及抗炎效果
图1中A为不同浓度联苯苄唑处理后U937细胞活力；
图1中B为不同浓度联苯苄唑在U937上对H1N1流感病毒的抑制率；
图1中C为不同浓度联苯苄唑对病毒诱导的促炎因子CCL2的抑制率；
图1中D为不同浓度联苯苄唑对病毒诱导的促炎因子CXCL10的抑制率。
图2联苯苄唑在A549和MDCK中的毒性及抗病毒效果
图2中A为不同浓度联苯苄唑处理后A549细胞活力；
图2中B为不同浓度联苯苄唑在A549上对H1N1流感病毒的抑制率；
图2中C为不同浓度联苯苄唑处理后MDCK细胞活力；
图2中D为不同浓度联苯苄唑在MDCK上对H1N1流感病毒的抑制率。
图3联苯苄唑广谱抗病毒活性检测
图3中A为不同浓度联苯苄唑处理后对不同流感病毒的抑制率。
图4联苯苄唑在小鼠致死性流感感染模型中的效果
图4中A为小鼠体重变化曲线；
图4中B为小鼠存活率曲线；
图4中C为小鼠感染后第三天肺洗液中病毒滴度。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术；所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
目前，抗流感病毒药物评价模型主要分为体外模型(in vitro model)和体内模型(in vivo model)。体外模型主要使用各种流感敏感细胞系或流感病理相关细胞系对药物进行评价，其优点在于可提供大量遗传性状相同的细胞为研究对象，操作方便，可消除其它外界因素的影响，并可以检测药物毒性、有效浓度和选择指数指数，为后期机理研究提供更多基础。体内模型一般使用各种模式动物感染模型，通过药物处理后的各种表型指标来衡量药物在活体动物内的整体效果。其优点是可对候选药物进行包括毒性、活性、代谢等特性在内的真实、系统的评价。本发明采用三种细胞模型，对联苯苄唑的体外抗流感活性进行定量分析。同时利用不同亚型的甲型流感病毒毒株检测了联苯苄唑的抗病毒广谱性。随后，采用小鼠致死性流感感染模型，对联苯苄唑的体内抗流感效果进行真实系统的评价。
实验材料：
(1)实验所需细胞系、实验动物及病毒
U937、A549和MDCK细胞购自美国菌种保藏中心(ATCC)；
SPF级6至8周龄Balb/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；
所用毒株：A型流感病毒H1N1亚型(A/PuertoRico/8/1934)、
H3N2亚型(A/Human/Hubei/3/2005)和H7N8亚型(A/Duck/Hubei/216/1983)。
(2)实验所需药物
联苯苄唑购自大连美仑生物技术公司；细胞实验时，药物用DMSO溶解；动物实验时采用无菌PBS溶解。
(3)实验所需试剂：
RPMI-1640培养基，胎牛血清(FBS)均购自于GIBCO公司；
4-methylumbelliferyl-α-N-acetyl-neuraminate(MUNANA)购自Sigma；
MTS细胞增殖检测试剂盒购自Promega公司；
AlphaLISA蛋白检测试剂盒购自Perkin Elmer公司。
(4)实验所需仪器：
EnSpire多功能酶标仪购自PerkinElmer公司；
CO2细胞培养箱购自Thermo公司。
实施例1：联苯苄唑在U937细胞系中的抗病毒、抗炎活性评价
1细胞培养
取冻存复苏后的细胞经过2次传代后，用含10％胎牛血清和双抗(青霉素100U/ml，链霉素100ug/ml)的RPMI-1640培养基扩培，接种密度不低于5x105cell/ml，传代密度不高于2x106cell/ml。
2联苯苄唑的细胞毒性检测
U937细胞按1.5×105细胞/孔(体积100μL)接种于96孔细胞培养板中；用每孔100μL培养基液(RPMI-1640培养基+10％血清+双抗)配制药物，并加入相应细胞孔中混匀。药物设定8个浓度，从400μM起始，2倍梯度稀释至3.125μM。培养48h后，细胞培养板500×g离心3min，弃上清。向剩余细胞中加入含有20％MTS试剂的无血清RPMI-1640培养基100μL，37℃孵育1h，500×g离心3min后用EnSpire酶标仪检测OD 490读数，计算细胞存活率。
细胞活力(％)＝药物处理组/未处理对照组×100％
结果如图1中A所示，不同浓度的联苯苄唑处理U937细胞48h后，其半数毒性浓度CC50约为150μM。
3联苯苄唑对流感病毒株A/PuertoRico/8/34(H1N1)的抗病毒活性
3.1实验原理：MUNANA(4-methylumbelliferyl-α-N-acetyl-neuraminate)是流感病毒神经氨酸酶的特异性底物，在神经氨酸酶作用下产生的催化产物在355nm激发光照射下，可以产生460nm荧光，荧光强度的强弱代表了病毒神经氨酸酶表达量的多少，反映了培养细胞上清中的病毒量。
3.2将U937细胞按1.5×105细胞/孔(体积100μL)接种于96孔细胞培养板中，感染组加入0.1MOI的H1N1PR8病毒，同时加入各梯度浓度的药物至总体积为200μL的培养液(RPMI-1640培养基+10％血清+双抗)，于细胞培养箱中37℃培养48h后取各实验孔上清进行神经氨酸酶表达量的检测。
3.3在黑底不透明96孔微量板中加入20μL缓冲液(32.5mM MES，pH 6.5，4mMCaCl2)配制的底物20μM MUNANA，再加入各实验孔培养上清40μL，37℃避光孵育60min，加入反应终止液(0.014μM NaOH，83％乙醇)100μL/孔，微孔读板仪上测定荧光值(激发光波长355nm，发射光波长465nm)。
3.4计算各检测孔中药物对流感病毒复制的抑制率
抑制率(％)＝100-(药物处理孔-空白对照)/(病毒对照孔-空白对照)×100％
结果如图1中B所示，联苯苄唑显著抑制了流感病毒复制，并且呈剂量依赖关系，其半数抑制浓度IC50约为1.86μM。
3.5药物选择指数计算
药物选择指数(SI)用于判断药物效果的安全范围，选择指数大于1.00以上为有效，指数越大安全范围越大。其计算公式为：SI＝CC50/EC50
结合上述数据，联苯苄唑在U937上抗流感病毒的选择指数为80.6，属于安全高效的抗流感病毒药物。
实施例2：联苯苄唑在A549和MDCK细胞系中的抗流感病毒活性的评价
本实验使用类似实施例1的方法在人源肺上皮细胞A549以及犬肾细胞MDCK中，评价联苯苄唑的抗病毒效果。
由于A549和MDCK为贴壁细胞，在检测药物毒性和抗病毒活性时，其在96孔板中所需细胞数为1.5×104细胞/孔，并需要提前24小时铺细胞，在感染前换液，其余操作与实施例1一致。
1药物毒性
结果如图2中A和C所示，不同浓度的联苯苄唑处理细胞48h后，检测细胞活力。结果表明，联苯苄唑在A549上的半数毒性浓度CC50为171μM，而在MDCK细胞上，联苯苄唑的毒性与其余两种细胞系类似，其CC50约为189μM。
2抗病毒活性
结果如图2中的B和D所示，联苯苄唑明显抑制了流感病毒复制，并且呈剂量依赖关系，其在A549细胞中抑制病毒复制的半数有效浓度IC50约为5.7μM，在MDCK细胞中的IC50约为25.5μM。
3药物选择指数计算
结合上述数据，联苯苄唑在A549上抗流感病毒的选择指数约为30，在MDCK细胞上的选择指数约为7.4。联苯苄唑在人源细胞系上的抗病毒活性显著高于其在犬源细胞上的活性，提示联苯苄唑可能在人类流感感染中发挥更好效果，且其抗病毒活性可能通过人类宿主靶标实现。
实施例3：联苯苄唑抗病毒效果的广谱性分析
本实施例用包括A/Human/Hubei/1/2009(H1N1)、A/human/Hubei/3/2005(H3N2)和A/Duck/Hubei/216/1983(H7N8)在内的三种不同流感病毒亚型分别感染A549细胞系，方法同实施例1。如图3所示，联苯苄唑明显抑制了这三种种流感病毒复制，并且呈剂量依赖关系，这说明其具有良好的抗病毒广谱性。
实施例4：联苯苄唑在小鼠致死性流感感染模型中的抗病毒效果评价
1实验流程：
1)将6-8周龄BALB/c小鼠随机分为药物评价组、阴性对照组(PBS)，每组6只。正式实验前，老鼠适应环境2～3d。
2)正式感染前24h始给药，一直持续到感染后第6天，共计给药7天。采用腹腔注射给药，剂量为25mg/kg早晚各一次，间隔12小时，每天定时称量每组动物体重，观察小鼠生存状况。
3)染毒当天，小鼠经1％戊巴比妥钠轻度麻醉(每克体重约0.1ml***)，然后用移液枪采用滴鼻方式感染2LD50的H1N1鼠肺适应株病毒液20μL。
4)染毒后3d，每组小鼠处死3只，解剖取肺，每只肺用0.2ml肺灌洗液(含0.1％BSAEDTA的PBS)反复洗3-4次，收集肺洗液，通过TCID50实验测定各组药物处理肺部病毒滴度平均值。
5)给药完成后，继续每天观察记录小鼠的体重和症状，定时更换和添加垫料、饮水和食物，及时取出死亡小鼠，直至实验完成。
6)根据统计结果，绘制出体重变化曲线和存活率曲线。
2实验结果
体重变化结果如图4A中所示，小鼠给药后，相比病毒对照组，联苯苄唑组处理给药期间小鼠平均体重下降趋势显著减低。
存活率结果如图4B中所示，病毒对照组小鼠于感染后第9天开始出现死亡，第11天出现死亡高峰，实验结束后，仅有17％小鼠存活。而联苯苄唑处理后，小鼠的存活率上升到了50％，说明药物可以显著提高小鼠存活率。
肺洗液病毒滴度检测结果如图4C所示，感染后第三天肺灌洗液中,对照组病毒滴度为5.3Log10TCID50/mL，而联苯苄唑处理组为4.5Log10TCID50/mL，病毒滴度相比对照组显著降低。
上述结果说明，联苯苄唑在体内有明显的抗病毒效果。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。