基于light-up银簇探针的荧光生物传感器及其在miR-122检测中的应用
阅读说明：本技术 基于light-up银簇探针的荧光生物传感器及其在miR-122检测中的应用 (light-up silver cluster probe-based fluorescence biosensor and application thereof in miR-122 detection ) 是由 王玉 张雪 刘素 黄加栋 宋晓蕾 李莎莎 王敬锋 王海旺 孙文玉 王业茹 于 2019-09-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物传感器技术领域,特别涉及基于light-up银簇探针的荧光生物传感器及其制备方法,还涉及富G碱基增强银纳米簇方法。该发明的检测方式是通过荧光信号的产生来进行miR-122的检测,miR-122和其互补链的杂交引发三通路结构发生变化,暴露出toehold端,银簇探针借助toehold端和GrHP发夹杂交,从而引发链置换反应,使得富G序列靠近银簇部分,从而增强银簇的荧光强度。该传感器具有高效、高特异性、操作简便、经济、无标记的优点,并且体系中无需借助酶,可以弥补miR-122现有检测方法的缺陷与不足,实现对其快速、准确的定量检测及相关疾病的早期诊断。(The invention relates to the technical field of biosensors, in particular to a light-up silver cluster probe-based fluorescence biosensor and a preparation method thereof, and also relates to a G-rich base enhanced silver nano cluster method. The detection mode of the invention is to detect miR-122 through the generation of a fluorescence signal, the hybridization of miR-122 and a complementary chain thereof triggers the change of a three-way structure, a toehold end is exposed, a silver cluster probe hybridizes with a GrHP hairpin through the toehold end, thereby triggering a chain displacement reaction, a G-rich sequence is close to the silver cluster part, and the fluorescence intensity of the silver cluster is enhanced. The sensor has the advantages of high efficiency, high specificity, simple and convenient operation, economy and no mark, does not need enzyme in a system, can make up the defects and shortcomings of the existing miR-122 detection method, and realizes quick and accurate quantitative detection and early diagnosis of related diseases.)
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于light-up银簇探针的荧光生物传感器及其制备方法，还涉及富G碱基增强银纳米簇方法。
背景技术
MicroRNAs（MiRNAs）是一组非编码的小RNA，在各种组织和器官中均有表达并且参与大部分生理过程。MiRNA的失调会导致一些疾病的发生，包括心血管疾病、帕金森病以及各种癌症。在众多的miRNA中，miR-122和肝脏疾病的发生密切相关，miR-122在正常人的肝脏中呈现高表达，但在肝癌患者的肝脏中表达量是下降的。此外，miR-122还和慢性C型肝炎病毒及药物诱导的肝损伤有关。因此，miR-122的灵敏检测对于研究肝病的发病机制和肝癌的早期诊断来说是非常重要的。
目前报道的miR-122检测技术有电化学法、比色法、PCR、表面等离子体共振等，这些方法中有些存在操作复杂、成本高、信号不稳定、重现性差等问题。因此，目前需要构建一种操作简单、高效、重现性好、可靠的技术用于miR-122的检测。
发明内容
针对目前缺乏一种操作简单、低成本的技术，本发明提供了一种基于三通路引发的toehold链置换反应及富G序列增强银簇发光的荧光生物传感器用于miR-122的检测，本实验主要是以DNA为模板合成银纳米簇用于产生荧光信号，并借助于toehold介导的链置换反应引起富G序列靠近银簇荧光基团从而增强荧光强度来实现miR-122的检测。本发明利用toehold介导的链置换反应可实现DNA链的快速迁移，显著提高DNA杂交的速率，更有利于miR-122在实际样本中的检测。
本发明是通过以下步骤得到的：
基于light-up银簇探针的荧光生物传感器，包括以下原料：IS链、GrHP探针、BS链、银簇、缓冲液、miR-122；
所述的GrHP碱基系列如SEQ No.1所示；
所述的IS碱基系列如SEQ No.2所示；
所述的BS碱基系列如SEQ No.3所示；
所述的AgNC-SP碱基系列如SEQ No.4所示；
所述的miR-122碱基系列如SEQ No.5所示。
上述荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）银纳米簇的制备；
（2）均相中银纳米簇和三通路结构发生链置换反应。
所述的步骤（1）的过程为：
将15μL，100μM AgNC-SP和4.5μL，2mM硝酸银的混合溶液加入到76μL，20 mM，pH6.5磷酸盐缓冲液中并于4℃反应15 min；之后，将4.5μL 2mM的硼氢化钠加入到体系中，于暗处放置6小时以上，既得银纳米簇。
所述的步骤（2）的过程为：
将IS链、GrHP探针、链及步骤（1）的银纳米簇加入到缓冲液中在37℃下反应半小时使其形成三通路结构，之后将miR-122加入到三通路体系中反应；最后，向反应体系中加入超纯水混合用荧光分光光度计进行检测。
优选地，所述的步骤（2）的过程为：
将3μL，5μM IS链、3μL，5μM GrHP探针、3μL，5μM BS链及3μL，5μM步骤（1）的银纳米簇加入到1×缓冲液中在37℃下反应半小时使其形成三通路结构，之后将miR-122加入到三通路体系中反应30min；最后，向反应体系中加入50μL超纯水混合用荧光分光光度计进行检测；荧光波谱测量条件：激发波长为565nm, 激发和发射的狭缝均为10nm。
所述的缓冲溶液为：50mM NaCl，10mM Tris-醋酸，10mM MgCl2，100μg·mL-1 BSA；25℃，pH7.9。
上述荧光生物传感器在miR-122检测中的应用。
本发明中一共用到了5条DNA链，其序列分别是：
GrHP: GCA ACG GGT GGG GTG GGG TGG GGC ACC CGT TGC CAA TGG TGT TTG TT G GCG CCG GCT TTC T
IS:GTG CGA ATTCAA ACA CCA TTG TCA CAC TCC A
BS: TTT AGA AAG CCG GCG CC T TCG CAC TTT
AgNC-SP: CAC CAT TGG CAA CGG GTGCCC TTA ATC CCC
miR-122: UGG AGU GUG ACA AUG GUG UUU G
在GrHP发夹结构中，富含G的序列（G-rich）用加粗表示，这些G-rich碱基能显著增强银簇的荧光强度。GrHP结构中加粗加下划线的碱基和IS链中的加粗加下划线的碱基是互补配对的，并且倾斜加下划线碱基和BS链中的倾斜加下划线碱基也是互补的。IS链中CAA ACA CCA TTG TCA CAC TCC A碱基和目标物miR-122完全互补配对。IS链中加粗的碱基用于封闭GrHP中的toehold部分和链置换部分。此外，IS链中加粗的碱基和BS链中的加粗碱基互补配对。在AgNC-SP链中的加粗碱基用来作为合成银簇的模板，在AgNC-SP 链中的斜体碱基和GrHP链中的斜体碱基是互补的。
体系中包含两种制备好的探针：一种是三通路探针；另一种是DNA-AgNCs信号探针（AgNC-SP）。AgNC-SP探针包含一段合成银纳米簇的DNA模板和一段能和包含G-rich的发夹（GrHP）互补的尾部序列。三通路结构（TWJ）是由GrHP、一条抑制链IS和一条基底链BS这三条链所组成的，这个TWJ结构包含一段10个碱基的toehold部分，该toehold部分被设计出来用于保证链置换反应的顺利进行。GrHP结构是由3’端包含G-rich序列的部分，一段能和AgNC-SP链中尾部互补的序列和一段和BS链互补的部分这三部分组成的。IS链中包含能和miR-122完全互补的序列以及5’端有一段能和基底链互补的部分。BS链作为用于支撑TWJ结构稳定存在的支架，这样的设计能够避免AgNC-SP和GrHP 链之间的自组装所产生的背景信号。
在体系中缺乏目标物miR-122时，因为GrHP中的toehold部分和链迁移部分都被IS链封闭，AgNC-SP不能从GrHP链上置换出IS链，因此只能测到银簇自身较弱的荧光强度。当体系中存在miR-122时，miR-122通过以IS链中3’末端暴露出的碱基作为toehold进行链杂交和置换，形成miR-122/IS杂交双链。 由于miR-122将IS链置换出来，导致原先被封闭住的位于GrHP链上的toehold部分暴露出来，因此AgNC-SP探针能通过被暴露出的toehold部分作为立足点，结合上去并进行链迁移直到将GrHP发夹杂交的部分完全打开，形成AgNC-SP/GrHP杂交双链。此时，由于AgNC-SP和GrHP杂交后，银簇部分靠近GrHP中G-rich部分，银簇的荧光强度被G-rich显著增强。因此，我们所设计的这个无标记的荧光体系可以被用于miR-122的检测及相关的临床应用。
本发明中，miR-122的检测是在均相溶液中实现的，通过三通路引发的toehold介导的链置换反应及富G序列增强银簇荧光强度从而产生很强的荧光信号，从而实现miR-122的检测并且检测的步骤较为简单、省时。
本发明的有益效果：
1、本发明利用miR-122和其互补链碱基互补配对从而引发后续的反应，具有高特异性的特点；
2、本发明借助三通路结构，可实现DNA链的有序组装，借助toehold介导的链置换反应可巧妙地进行DNA链的迁移，加快DNA链迁移的速率；
3、本发明借助富G序列显著增强银簇发光从而提高信噪比；
4、该传感器的反应条件温和，反应速度迅速。
5、本发明的检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速、简单、高信噪比的检测；
6、制备方法简单，性能稳定，适用于医疗卫生领域对于miR-122的检测以及为后续肿瘤的治疗打下基础以及生物传感器产业化的实际应用；
7、制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。
附图说明
图1为该实验的原理图。
图2为实施例1可行性研究的荧光波谱图；曲线a代表存在miR-122时的荧光强度，曲线b代表空白样品的荧光强度，曲线c代表miR-141代替miR-122时的荧光强度，曲线d代表miR-20a代替miR-122时的荧光强度，这些miR-122浓度均200nM。
图3为实施例2传感器检测的标准曲线；
图4为实施例2传感器检测的浓度线性关系曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）银纳米簇的制备；
（2）均相中银纳米簇和三通路结构发生链置换反应形成AgNC-SP/GrHP杂交结构；
所述的制备方法中，银纳米簇的制备：
银纳米簇的制备是根据文献报道的硼氢化钠还原法所制得的。用于合成银簇的DNA模板链AgNC-SP（15μL，100μM）和硝酸银（4.5μL，2mM）的混合溶液加入到76μL磷酸盐缓冲液（20mM, pH6.5）中并且于4℃反应15 min。之后，将4.5μL 2mM的硼氢化钠加入到体系中，于暗处放置6小时以上用来形成稳定的银纳米簇。
所述的制备方法中，均相中银纳米簇和三通路结构发生链置换反应形成AgNC-SP/GrHP杂交结构：
将IS链（3μL，5μM）、GrHP探针（3μL，5μM）、BS链（3μL，5μM）及事先合成好的银簇（3μL，5μM）加入到1×缓冲液（50 mM NaCl，10 mM Tris-醋酸，10 mM MgCl2，100 μg•mL-1 BSA（[email protected]℃）组成）中在37℃下反应半小时使其形成三通路结构，之后将3μL不同浓度的miR-122加入到三通路体系中反应30min。之后，向反应体系中加入50μL超纯水混合用荧光分光光度计进行检测。荧光波谱测量条件：激发波长为565nm, 激发和发射的狭缝均为10nm。
该发明的检测方式是通过荧光信号的产生来进行miR-122的检测，miR-122和其互补链的杂交引发三通路结构发生变化，暴露出toehold端，银簇探针借助toehold端和GrHP发夹杂交，从而引发链置换反应，使得富G序列靠近银簇部分，从而增强银簇的荧光强度。该传感器具有高效、高特异性、操作简便、经济、无标记的优点，并且体系中无需借助酶，可以弥补miR-122现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速、准确的定量检测及相关疾病的早期诊断。
实施例1
所述的制备方法中，银纳米簇的制备：
银纳米簇的制备是根据文献报道的硼氢化钠还原法所制得的。用于合成银簇的DNA模板链AgNC-SP（15μL，100μM）和硝酸银（4.5μL，2mM）的混合溶液加入到76μL磷酸盐缓冲液（20mM, pH6.5）中并且于4℃反应15 min。之后，将4.5μL 2mM的硼氢化钠加入到体系中，于暗处放置6小时以上用来形成稳定的银纳米簇。
至此已合成银纳米簇，均相溶液中反应过程的主要步骤如下：
将IS链（3μL，5μM）、GrHP探针（3μL，5μM）、BS链（3μL，5μM）及事先合成好的银簇（3μL，5μM）加入到1×缓冲液（50 mM NaCl，10 mM Tris-醋酸，10 mM MgCl2，100 μg•mL-1 BSA（[email protected]℃）组成）中在37℃下反应半小时使其形成三通路结构，之后将3μL 200nM的miR-122加入到三通路体系中反应30min得到曲线a。在三通路结构中，不加miR-122得到的曲线为b,将miR-122替换为miR-141和miR-20a分别得到曲线c和d。最后，向反应体系中加入50μL超纯水混合用荧光分光光度计进行检测。荧光波谱测量条件：激发波长为565nm, 激发和发射的狭缝均为10nm。
经检测，如图2，检测到的荧光强度在目标物miR-122存在的情况下很强（曲线a），在不存在目标物时荧光强度较低（曲线b）,将目标物miR-122替换为miR-141和miR-20a荧光强度较低（曲线c和d）。
实施例2
所述的制备方法中，银纳米簇的制备：
纳米簇的制备是根据文献报道的硼氢化钠还原法所制得的。用于合成银簇的DNA模板链AgNC-SP（15μL，100μM）和硝酸银（4.5μL，2mM）的混合溶液加入到76μL磷酸盐缓冲液（20mM, pH6.5）中并且于4℃反应15 min。之后，将4.5μL 2mM的硼氢化钠加入到体系中，于暗处放置6小时以上用来形成稳定的银纳米簇。
至此已合成银纳米簇，均相溶液中反应过程的主要步骤如下：
将IS链（3μL，5μM）、GrHP探针（3μL，5μM）、BS链（3μL，5μM）及事先合成好的银簇（3μL，5μM）加入到1×缓冲液（50 mM NaCl，10 mM Tris-醋酸，10 mM MgCl2，100 μg•mL-1 BSA（[email protected]℃）组成）中在37℃下反应半小时使其形成三通路结构，之后将3μL不同浓度的miR-122（0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nM、200nM）加入到三通路体系中反应30min。之后，向反应体系中加入50μL超纯水混合用荧光分光光度计进行检测。荧光波谱测量条件：激发波长为565nm, 激发和发射的狭缝均为10nm。
经检测，如图3，检测到的荧光信号强度随着miR-122浓度的增加，荧光强度也在逐渐增加。此外，如图4，miR-122浓度的对数值与荧光强度呈线性关系。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 济南大学
<120> 基于light-up银簇探针的荧光生物传感器及其在miR-122检测中的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 1
gcaacgggtg gggtggggtg gggcacccgt tgccaatggt gtttgttggc gccggctttc 60
t 61
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 2
gtgcgaattc aaacaccatt gtcacactcc a 31
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 3
tttagaaagc cggcgccttc gcacttt 27
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 4
caccattggc aacgggtgcc cttaatcccc 30
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 5
uggaguguga caaugguguu ug 22