具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中实施例涉及的方法，除非另有说明，否则均为相关领域的常规技术和方法。实施例中所用的材料、试剂、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例中所采用的核酸序列下表1所示，寡核苷酸由上海生工生物技术有限公司合成，使用前通过高效液相色谱进行纯化。荧光光谱由日立RF-5301荧光光谱仪(日立公司，日本)测量。凝胶电泳结果由凝胶记录系统(汇福兴业，北京，中国)获得。96孔板在BioTek Synergy 4微板阅读器(BioTek Instruments Inc.，USA)上进行测量。

表1本发明实施例中所采用的核酸序列

注：Lock中若碱基后有*代表该碱基被硫代磷酸修饰。

实施例1：合成探针P1、P2和Lock-In

本发明的核酸纳米传感器包含三个部分：a，探针1(P1)，分别由五种DNA单链(S1，S2，S3，S4和H1)构成四面体刚性纳米结构；b，探针2(P2)，分别由五种DNA单链(S1，S2，S3，S4和H2)构成四面体刚性纳米结构，其中H1和H2构成无酶扩增反应如杂交链式反应(HCR)的两个单元；c，探针3(Lock-In)，硫代磷酸修饰的核酸构成锁链(Lock)，能够引发杂交链式反应的引发链(In)，其中In最初被Lock锁上，无法引发HCR，当有目标物髓过氧化物酶时，催化H₂O₂和氯离子(Cl-)产生次氯酸(HOCl)，硫代磷酸链断裂，随后释放In，引发H1和H2发生无酶扩增反应。

(1)将S1、S2、S3、S4、h1、h2、H1、H2、Lock和In这些DNA单链(表1)用无酶水稀释至20μM，涡旋10s，使单链充分混匀。分装后放置在4℃下短暂存放，长期存放则在-20℃冰箱。获得的探针无需进一步分离或纯化，直接用于后续实验。

(2)探针P1的合成：将1μM的S1、S2、S3和S4与4μM H1混合在Tris-HCl-Mg²⁺缓冲液(20mM Tris-HCl，50mM MgCl₂，pH＝8.0)后，混匀离心，在95℃下加热5min，立即放在冰块上冷却制得，于4℃下保存待用。获得的探针无需进一步分离或纯化，直接用于后续实验。

(3)探针P2的合成：将1μM的S1、S2、S3和S4与4μM H2混合在Tris-HCl-Mg²⁺缓冲液(20mM Tris-HCl，50mM MgCl₂，pH＝8.0)后，混匀离心，在95℃下加热5min，立即放在冰块上冷却制得，于4℃下保存待用。获得的探针无需进一步分离或纯化，直接用于后续实验。

(4)探针Lock-In的合成：将等比例的锁链(Lock，10μM)和引发链(In，10μM)混合在1×PBS(0.01M，pH 7.4)缓冲液中，混匀离心，在95℃下加热5min，缓慢降到25℃，继续反应30min，于4℃下保存待用。

实施例2：探针的电泳表征

(1)HOCl切割Lock-In：荧光标记的Lock(2μM)或荧光标记的Lock-In(2μM)与不同浓度的次氯酸在1×PBS缓冲液，37℃下孵育1h。利用10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳对Lock-In及裂解产物进行表征。在4℃、120V条件下，电泳分离80min。室温下将凝胶放入GelImage系统中进行成像观察。

(2)HOCl引发经典的HCR：h1，h2，In或Lock-In各2μM与不同浓度的次氯酸在1×PBS缓冲液，37℃下孵育4h。利用10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳对锁链及裂解产物进行表征。在4℃、120V条件下，电泳分离80min。室温下将凝胶放入GelRed中染色15min后，再将凝胶放入GelImage系统中进行成像观察。

(3)探针P1和P2的构建：将1μMS1、S2、S3、S4和4μM H1、H2按照精确的配比加入到200μL PCR管内，在Tris-HCl-Mg²⁺缓冲液(20mM Tris-HCl，50mM MgCl₂，pH＝8.0)混匀离心。95℃下加热5min，立即放在冰块上冷却。利用6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表征。在4℃、120V条件下，电泳分离80min。室温下将凝胶放入GelRed中染色15min后，再将凝胶放入GelImage系统中进行成像观察。

(4)HOCl引发TDN-HCR：将500nM P1和P2，2μM Lock-In和In与不同浓度的次氯酸在1×PBS缓冲液，37℃下孵育30min。利用2％的琼脂糖凝胶电泳对组装产物进行表征。在4℃、80V条件下，电泳分离30min。凝胶事先用GelRed染色，分离操作完成后，将凝胶放入GelImage系统中进行成像观察。

实施例3：探针体外检测次氯酸

(一)合成探针

(1)荧光标记的探针P1的合成：将1μM的S1、S2、S3和S4与4μMH1(Cy3标记)混合在Tris-HCl-Mg²⁺缓冲液(20mM Tris-HCl，50mM MgCl₂，pH＝8.0)后，混匀离心，在95℃下加热5min，立即放在冰块上冷却制得，于4℃下保存待用。获得的探针无需进一步分离或纯化，直接用于后续实验。

(2)荧光标记的探针P2的合成：将1μM的S1、S2、S3和S4与4μM H2(Cy5标记)混合在Tris-HCl-Mg²⁺缓冲液(20mM Tris-HCl，50mM MgCl₂，pH＝8.0)后，混匀离心，在95℃下加热5min，立即放在冰块上冷却制得，于4℃下保存待用。获得的探针无需进一步分离或纯化，直接用于后续实验。

(二)体外识别及结果

次氯酸响应的荧光光谱：将50nM P1、50nM P2和500nM Lock-In混匀在100μL PBS缓冲液(pH＝7.4)中，与不同浓度的HOCl(0至10μM)在37℃下孵育30min。然后，在548nm的激发下，收集该混合物在550至800nm的荧光光谱。其中，F_A和F_D分别是Cy5在665nm和Cy3在561nm的荧光。所有实验至少重复三次。

动力学研究：将50nM P1、50nM P2和500nM Lock-In混匀在100μL PBS缓冲液(pH＝7.4)中，温度控制37℃，开始测量561nm和665nm处的初始荧光强度。加入HOCl后每隔1min在561nm和665nm通道拍摄光谱。以每个时间点的F_A/F_D与时间作图。

特异性实验：NaOCl(ε_292nm＝350M^-1cm^-1)水溶液作为HOCl供体。H₂O₂(ε_240nm＝43.6M^{- 1}cm^-1)水溶液作为H₂O₂供体。黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶作为超氧化物(O₂ ^-)供体。通过向含有过量H₂O₂的溶液中加入Fe²⁺产生·OH。TBHP储备溶液(10mM)是通过在998.8μL的H₂O中加入1.2μL的70％TBHP获得的。NO储备液(10mM)是通过将2.98mg硝普钠溶解在1mL的H₂O中获得的。在100μL PBS缓冲液(pH＝7.4)中向探针(50nM P1、50nM P2和500nM Lock-In)添加ROS/RNS发生器，最终浓度为干扰物浓度为10μM，HOCl浓度为1μM。样品在37℃下孵育30min，并记录荧光光谱。

实施例4：探针体外检测MPO

(一)合成探针

方法同实施例3(一)

(二)体外识别及结果

MPO响应的荧光光谱：MPO溶液是通过将MPO溶解在1mL水中(含20％的甘油)来制备的。该溶液储存在4℃，并在2周内使用。将50nM P1、50nM P2和200nM Lock-In混匀在100μLPBS缓冲液(pH＝6.0)中，与不同浓度的MPO(0至1μg/mL)在37℃下孵育30min。然后，在548nm的激发下，收集该混合物在550至800nm的荧光光谱。其中，F_A和F_D分别是Cy5在665nm和Cy3在561nm的荧光。所有实验至少重复三次。

动力学研究：将50nM P1、50nM P2和200nM Lock-In混匀在100μL PBS缓冲液(pH＝6.0)中，温度控制37℃，开始测量561nm和665nm处的初始荧光强度。再加入MPO，每隔1min在561nm和665nm通道拍摄光谱。以每个时间点的F_A/F_D与时间作图。

为了探索卤素离子对该系统的影响，MPO标准溶液应在裂解反应前用10k超滤管(10k，Amicon Ultra-0.5)离心3次以去除氯化物。

将MPO的抑制剂(4-ABAH)用DMSO稀释。在本实验中，将4-ABAH直接加入MPO(50ng/mL)溶液中，然后在裂解反应前在37℃下孵育30min。

实施例5：探针在复杂基质中检测MPO

(一)合成探针

方法同实施例3(一)

(二)回收率实验

(1)血清/血浆：我们从商业渠道购买人血清和血浆，用PBS稀释100倍后使用。在稀释的人血清和血浆样品中加入不同量的MPO进行回收测试。

(2)细胞裂解液：小鼠单核巨噬细胞RAW264.7来自中国科学院类型培养库细胞库(中国上海)，在含有10％FBS和1％青霉素-链霉素(PS，10000IU青霉素和10000μg/mL链霉素)的DMEM(GIBCO)培养基中培养。细胞每3天传代一次，30次传代后，从库存中重新开始培养。细胞裂解液是通过将细胞与哺乳动物细胞裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％SDS，0.5％脱氧胆酸和蛋白酶抑制剂)混合制备的，随后离心以去除核DNA和细胞膜碎片。在稀释100倍的细胞裂解液样品中加入不同含量的MPO进行回收测试。

(3)唾液：未受刺激的全人类唾液样品是在清晨食用任何食物/饮料之前收集的。样品在10,000g下离心30min，清澈的上清液被转移到微离心管中，不使用时储存在-20℃的冰箱中。在稀释100倍的人唾液样品中加入不同含量的MPO进行回收测试。

实施例6：便携式设备检测MPO活性

(一)合成探针

(1)FAM/BHQ1标记的探针P1的合成：将1μM的S1、S2、S3和S4与4μM H1(FAM/BHQ1标记)混合在Tris-HCl-Mg²⁺缓冲液(20mM Tris-HCl，50mM MgCl₂，pH＝8.0)后，混匀离心，在95℃下加热5min，立即放在冰块上冷却制得，于4℃下保存待用。获得的探针无需进一步分离或纯化，直接用于后续实验。

(2)探针P2的合成：将1μM的S1、S2、S3和S4与4μM H2混合在Tris-HCl-Mg²⁺缓冲液(20mM Tris-HCl，50mM MgCl₂，pH＝8.0)后，混匀离心，在95℃下加热5min，立即放在冰块上冷却制得，于4℃下保存待用。获得的探针无需进一步分离或纯化，直接用于后续实验。

(二)构建便携设备

将PCR管放在一个自制的室内，使用紫外线灯进行激发，用智能手机捕捉荧光图像。对于半定量的测试，结果可以直接用肉眼读取。所有的实验都进行了三次，以确保可重复性。智能手机摄像头拍摄的荧光图像被传输到电脑上，使用图像处理软件ImageJ进行进一步分析。通过选择每个检测区的整个区域，获得每个检测区的平均绿色通道值。空白样品的平均绿色通道值被用作背景并从检测区的数值中减去。

对比例：

从表2和表3中可以看出本发明的等温核酸扩增传感器在检测次氯酸时，与其他基于比色或荧光检测的方法相比，该生物传感器的检测限是我们所知的最低的。当利用本发明的等温核酸扩增传感器检测MPO时，效果优于或可与报道的比色法、荧光法和电化学检测法相媲美。虽然比免疫测定法更高的LOD，但大大简化的操作和显著缩短的时间使我们的方法更适合于实际应用。

表2不同的荧光法检测HOCl的比较

表3不同的分析方法检测MPO的比较

下面结合附图详细说明本发明制备的等温核酸扩增传感器的结构和性能

实验例1：基于TDN-HCR的HOCl传感策略的工作机理分析

当核酸结构一个非桥接的氧被硫代磷酸(phosphorothioate，ps)修饰时，加入适量的HOCl会在特定的位点出现断裂(图1a)。由于硫代磷酸修饰的核酸只是稍微扰乱了DNA的结构，不影响碱基配对，保留了DNA的可编程性。

在这项工作中，我们开发了TDN-HCR纳米传感器检测HOCl(图1b)。杂交链式反应(HCR)是一种高度简便且兼具多重功能的无酶核酸等温扩增技术。在传统的HCR中，两个发夹探针(h1和h2)在引发链(In)触发下交替打开，组装成长的线性双链产物，并伴随着荧光共振能量转移(FRET)等信号输出。然而，传统的无酶反应依靠核酸分子在溶液中发生随机碰撞和相互作用，存在生物稳定性弱、反应动力学慢、杂化效率低等问题。为了加快HCR的反应动力学，我们利用四面体核酸纳米结构(tetrahedral DNA nanostructure，TDN)介导的超支化HCR策略。将h1和h2分别固定在TDN的四个顶点上。为了与TDN四条链的突出端互补，在h1和h2上延长T₂₂G₂设计H1和H2发夹。随后，通过将H1和H2连接到TDN的四个顶点，可以得到两组TDN发夹单元(P1和P2)。加入引发链(In)后，将P1中的H1发夹打开，释放出来的序列可以进一步将P2中的H2发夹打开，形成H1/H2复合物，最终组装形成超支化的核酸结构。与常规HCR不同的是，我们通过在TDN四个顶角上引入DNA发夹，可提高有效碰撞概率并增加局部浓度，从而大大加快反应动力学。接下来，我们根据引发链的序列特征，设计含有硫代磷酸修饰的锁链(Lock)，在没有添加HOCl的情况下，锁链与引发链形成一种复合物(Lock-In)，使HCR反应无法进行。当加入不同浓度的次氯酸时，锁链中硫代磷酸的位置被切割，锁链结构不稳定，从复合物(Lock-In)中释放出引发链，从而启动HCR反应来检测次氯酸(图1b)。在生理条件下，MPO介导H₂O₂对氯离子(Cl^-)的过氧化作用，产生HOCl。因此，我们提出的策略可以很容易地扩展到监测MPO活性(图1c)。

实验例2：电泳分析

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和琼脂糖凝胶电泳(AGE)初步评估了传感器的可行性，对设计方案进行了初步评价。(1)Lock-In被HOCl切割：如图2a所示，Lock与In杂交后形成稳定的Lock-In双链，其迁移率比Lock慢。同时，当用HOCl处理Lock-In时，出现了一条与荧光标记的Lock的裂解片段相对应的新条带，且断裂程度与HOCl浓度有关，表明Lock链被裂解并从Lock-In双链中释放出来。(2)HOCl引发传统HCR反应：如图2b所示，h1、h2和h1+h2分别表现为一条DNA带(泳道2、7、8)。加入In后，在凝胶上可以清楚地看到类似于交替共聚物的长缺口双链DNA带(泳道1)。当In被Lock-In取代时，HCR过程被抑制了(泳道6)。当In被HOCl从Lock中释放出来时，HCR过程又可以自动进行。从第3-5泳道的结果可以清楚地看到，HOCl的存在对于启动HCR过程是必要的。(3)HOCl启动的TDN-HCR：随着连续加入寡核苷酸S1、S2、S3、S4和H1或H2，观察到电泳迁移率明显下降，表明P1和P2已成功制备(图2c)。P1和P2可以分别取代h1和h2，进行HOCl启动的TDN-HCR。P1/P2和P1/P2/Lock-In混合物给出了类似的DNA条带(泳道1和2，图2d)，表明Lock-In不会自发启动TDN-HCR。然而，在HOCl的存在下，形成了大尺寸的HCR产物(泳道3-5，图2d)，它不能从上样孔迁移，表明HOCl成功地启动了TDN-HCR。应该指出的是，即使是0.5μM的HOCl也能有效地启动TDN-HCR，这意味着与传统的HCR相比，TDN-HCR的HOCl检测能力有很大的提高。

实验例3：基于FRET的HOCl比率型检测

基于FRET的荧光信号输出模式，由于能有效防止探针降解、浓度波动和激发光强度变化引起的假阳性信号，因此明显优于普通荧光/淬灭系统。为了实现对溶液中HOCl的FRET检测，分别在H1和H2适当的位置修饰了荧光基团供体Cy3和荧光受体Cy5。在HOCl成功触发TDN-HCR后，它们之间的FRET会从“关闭”变为“开启”状态(图3a)。为了证实我们提出的HOCl传感策略的可行性，首先进行了荧光分析。如图2b所示，P1/P2和P1/P2/Lock-In混合物给出了相同的荧光光谱(Line2，3)。当HOCl被添加到P1/P2/Lock-In混合物中时，TDN-HCR被成功启动，导致Cy3荧光大大减少，Cy5荧光明显增加(Line 1)。由荧光光谱中计算得出的FRET比(F_A/F_D)中显示，含HOCl的F_A/F_D比不加HOCl的对照组高约12.7倍(F_A是指在548nm处被激发后，Cy5在665nm处的发射信号值；F_D是Cy3在548nm处被激发后，561nm处的发射信号值)。

在证明了对HOCl进行比率检测的可行性后，为了达到最佳的检测效果，我们对传感器的设计和一些重要的实验条件进行了优化。首先，我们选择了最佳的Lock(图3c)。一个理想的Lock应该与In杂交并在没有HOCl的情况下保持沉默，但可以被HOCl迅速切割释放In，从而引发随后的HCR反应。因此，我们仔细选择Lock的长度以及Lock中PS修饰的数量及位置。我们比较了四条长度相同但PS修饰数量不同的Lock链(Lock0、Lock1、Lock2和Lock3，其中PS修饰位点分别为0、1、2和3)。由于缺乏PS修饰，Lock0-In双链对HOCl没有反应，不能启动HOCl依赖的TDN-HCR。相反，所有的Lock1-In、Lock2-In和Lock3-In可以对HOCl作出反应，使F_A/F_D大大增加。然而，当修饰点的数量为两个或更多时，背景信号急剧增加。据报道，与未修饰的双链相比，每个PS位点的Tm平均下降0.65℃。PS修饰对双链不稳定性的影响可以通过增加双链的长度来克服。当延长Lock的长度并逐渐增加PS修饰位点时，如Lock4-6，在没有HOCl的情况下，HCR保持沉默。其中，Lock5-In和Lock6-In可以被HOCl快速裂解以释放In，从而触发随后的HCR过程，而Lock4则不能。因此，PS修饰位点应设计在靠近锁的中间位置。这样可以在双链被HOCl切割后最大限度地释放In。

接下来，以R/R₀为标准(R和R₀分别为含HOCl和不含HOCl的F_A/F_D)，优化了HOCl检测的操作条件，包括DNA探针(P1、P2和Lock-In)的浓度和比例、缓冲液类型和pH、反应时间。其中，探针浓度、比例和反应时间对反应有明显影响，而缓冲液类型和pH值影响不大。优选地，在接下来的实验中选择了50nM的P1，50nM的P2，500nM的Lock-In，30分钟的反应时间，用于检测HOCl。

在优化的条件下，对HOCl传感平台的灵敏度进行了分析。随着HOCl浓度从0增加到10μM，F_A/F_D值逐渐增加(图3d)。F_A/F_D值在2.5nM到200nM的范围内与HOCl浓度呈线性相关(图3e)。回归方程为Y＝0.0089X+0.2025(其中Y和X分别代表F_A/F_D和HOCl浓度)，根据3σ/S规则(σ代表空白对照(N＝10)的标准偏差，S是校准曲线的斜率)，检测极限(LOD)估计为0.8nM。值得注意的是，与其他基于比色或荧光检测的方法相比(表2)，该生物传感器的LOD是我们所知的最低的。值得注意的是，尽管感应过程包括HOCl触发的Lock-In裂解和释放的In触发的TDN-HCR，但这两个步骤的操作可以结合起来，使整个HOCl检测在“一锅法”模式下完成，这大大简化了操作。

众所周知，由于生物系统中存在大量的活性氧和还原物种，具有高选择性和抗干扰性的生物传感器有利于准确检测HOCl。我们进一步研究了生物传感器对HOCl和其他潜在干扰分析物的选择性。如图3f所示，只有HOCl促成了荧光强度比(F_A/F_D)的显著增强，而其他干扰分析物即使在10倍高的浓度下也表现出可忽略的F_A/F_D变化。这些结果证实，我们的生物传感器可以在复杂的生物系统中实现对HOCl的高选择性检测。

实验例4：基于FRET的MPO比率型检测

在有Cl-和H2O2的情况下，加入MPO可以大大增加传感系统的FRET信号，证明了我们的方法在MPO检测上的可行性。相反，对于缺乏Cl-、H2O2或MPO的传感系统，几乎没有观察到FRET信号的变化。这一结果有力地证明了我们提出的检测机制，也就是说，只有在MPO存在下，MPO催化Cl-的氧化产生HOCl，然后启动TDN-HCR，使FERT信号输出增强(图3a)。为了获得最佳的MPO检测效果，一些关键的实验条件以R/R0为标准进行了优化，包括反应温度，Cl^-、H₂O₂和Lock-In的浓度，缓冲液类型和pH值，以及反应时间。优选地，我们选择了37℃、200nM的Lock-In、100μM的氯离子、100μM的H₂O₂、pH6.0的PB缓冲液和30min的反应时间来检测MPO(图3b)。

在优化的条件下，对所提方法的MPO检测性能进行了评估。如图3c所示，FRET信号与MPO浓度密切相关。F_A/F_D值与MPO在0到1000ng/mL的浓度范围内呈现S形曲线。在2至25ng/mL的范围内，F_A/F_D与MPO浓度的对数呈线性相关(R²＝0.9859)(图3d)。回归方程为Y＝3.682X-0.4307，其中Y和X分别代表F_A/F_D比率和MPO浓度的对数值。LOD约为3.75ng/mL，优于或可与报道的比色法、荧光法和电化学检测法相媲美。虽然比免疫测定法更高的LOD(表3)，但大大简化的操作和显著缩短的时间使我们的方法更适合于实际应用。

然后，通过检测其他几种常见的酶(辣根过氧化物酶、过氧化氢酶、黄嘌呤氧化酶、葡萄糖氧化酶和谷胱甘肽还原酶)、蛋白质(牛血清白蛋白)和各种生物相关分子，如金属离子、阴离子、氧化还原物质、氨基酸和葡萄糖，研究了MPO检测的特异性。如图3e和3f所示，与空白对照相比，所有测试的生物分子和离子都没有给出正的FRET信号。

MPO浓度和活性的升高与许多导致炎症事件的发生和发展的病理因素有关。最近的研究表明，MPO可以作为一个重要的生物诊断标志物和治疗目标。因此，筛选能够有效抑制MPO活性，从而减弱炎症反应的活性化合物是目前研究的重点。为了评估生物传感器在筛选MPO抑制剂方面的潜力，我们用4-氨基苯甲酸酰肼(4-ABAH)作为模型，这是一种广泛用于MPO不可逆抑制剂的药物。如图3g所示，F_A/F_D比率随着4-ABAH浓度的增加而下降(0至15μM)。经计算，半最大抑制浓度(IC₅₀)为0.77μM，这与最近的研究报告相似。这一结果表明，我们提出的生物传感器可用于筛选MPO抑制剂并评估其抑制活性，在抗炎药物的开发方面显示出巨大的潜力。

一个稳定可靠的生物传感器对于诊断试剂盒的开发至关重要。我们将所提出的传感系统在4℃下保存不同的时间，并对其MPO检测能力进行了6个月的跟踪。如图3h所示，传感系统的背景值从开始到6个月后几乎没有变化，同时MPO传感性能变化很小，表明生物传感器即使在长期储存后也有良好的稳定性。

实验例5：测定实际样品中的MPO活性

该生物传感器被进一步用于检测真实样品中的MPO活性。以血浆为例，首先，测试了血浆稀释率对MPO检测的影响。在不同稀释度的样品中加入相同浓度的HOCl或MPO，结果发现大约100倍稀释的血浆对MPO的检测没有明显影响。然而，在10倍稀释的血浆中，无法检测MPO，通过添加更多的H₂O₂也无法抵消和中和传感系统中的还原物质。接下来，不同浓度的MPO被添加到100倍稀释的血浆样品中，通过比较测量的MPO活性和添加量来计算回收率。为了进行比较，还用一个商业检测试剂盒测定了真实样品中的MPO加标量。我们的方法测定的血浆中MPO的回收率为95.6％至102.3％，相对标准偏差为2.9％至14.2％，这与商业试剂盒的结果一致(表4)。这表明我们提出的方法具有良好的精度和高准确性。最后，将我们的生物传感器还应用于其他三种真实样品：血清、细胞裂解液和唾液(表5)。结果表明，该生物传感器可用于复杂生物样品中MPO的定量测定。

表4在血浆中检测MPO的回收率及与市售试剂盒对比

表5在血清、细胞裂解液及唾液中检测MPO的回收率

实验例6：生物传感器的便携性

MPO的异常导致个体对一些疾病易感性的差异，与许多人类疾病的发生和发展密切相关，因此其快速检测越来越受到国内外学者的关注。我们的生物传感器还可以设计与低成本的便携式检测设备相结合，实现MPO的即时检测(Point-of-care testing，POCT)。因此，我们使用了一对荧光/淬灭剂(FAM/BHQ1)来标记H1。由于发夹结构中的荧光基团和淬灭剂之间的紧密接触，FAM的荧光被淬灭了。MPO可以触发P1和P2之间的TDN-HCR，导致发夹结构的打开，从而恢复FAM的荧光。通过利用手持式紫外灯照射传感系统，四个MPO阳性的真实样品发出了明亮的绿色荧光(图4)。检测结果可以通过肉眼或智能手机来判断，它可以半定量地对荧光强度进行分级。也就是说，我们提出的方法可用于开发便携式MPO检测试剂盒，甚至可以在资源短缺或偏远地区使用。

本发明核酸传感器利用杂交链式反应进行扩增，它是一种无酶扩增反应，通过改变核酸序列也可以达到本发明的实验目的。

本发明核酸传感器中Lock-In中，Lock的碱基数通过延长或增加硫代磷酸修饰位点也可以达到目标。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 南开大学

<120> 一种等温核酸扩增传感器的制备方法及应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列 S1

<400> 1

ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaacattc ctaagtctga aacattacag cttgctacac 60

gagaagagcc gccatagta 79

<210> 2

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列 S2

<400> 2

ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaatatcac caggcagttg acagtgtagc aagctgtaat 60

agatgcgagg gtccaatac 79

<210> 3

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列 S3

<400> 3

ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaatcaact gcctggtgat aaaacgacac tacgtgggaa 60

tctactatgg cggctcttc 79

<210> 4

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列 S4

<400> 4

ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaattcaga cttaggaatg tgcttcccac gtagtgtcgt 60

ttgtattgga ccctcgcat 79

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列 Lock

<400> 5

aacatcagtg tgatatgc 18

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列 In

<400> 6

tagcatatca cactgatgtt ga 22

<210> 7

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列 H1

<400> 7

tttttttttt tttttttttt ttggtcaaca tcagtgtgat atgctactaa gttagcatat 60

cacactg 67

<210> 8

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列 H2

<400> 8

tttttttttt tttttttttt ttggtagcat atcacactga tgttgacagt gtgatatgct 60

aacttag 67

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列 h1

<400> 9

tcaacatcag tgtgatatgc tactaagtta gcatatcaca ctg 43

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列 h2

<400> 10

tagcatatca cactgatgtt gacagtgtga tatgctaact tag 43