一种核酸分析方法及应用
阅读说明：本技术 一种核酸分析方法及应用 (Nucleic acid analysis method and application ) 是由 丁显廷 苏静 于 2021-09-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及基因检测技术领域,公开了一种基于框架核酸DNA和CRISPR/Cas12a系统的电化学生物传感器制备方法及其应用,特点是包括界面上纳米材料AuNFs合成、构建四面体FNAs修饰的界面、CRISPR/Cas12a体系切割、电化学生物传感器信号输出四个步骤,构建基于CRISPR/Cas12a和框架核酸DNA的电化学生物传感平台,优点是实现了高稳定性、高灵敏度,且通过设计从四面体FNAs延伸出的DNA探针序列,可广泛应用于其他病毒、游离肿瘤DNA、miRNA和疾病相关的生物标记物的分析检测中。(The invention relates to the technical field of gene detection, and discloses a preparation method and application of an electrochemical biosensor based on frame nucleic acid DNA and a CRISPR/Cas12a system, which is characterized by comprising four steps of synthesizing AuNFs (nano material) on an interface, constructing a tetrahedral FNAs modified interface, cutting the CRISPR/Cas12a system, and outputting signals of the electrochemical biosensor, and constructing an electrochemical biosensing platform based on CRISPR/Cas12a and frame nucleic acid DNA.)
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种基于DNA框架核酸调控的CRISPR/Cas电化学核酸分析技术。
背景技术
核酸分析对疾病的预防、诊断和预后监测具有重要意义。传统的核酸分析方法包括恒温扩增、微阵列、二代测序和金标准定量聚合酶链式反应等，但这些方法都需要预扩增、专用设备和训练有素的专业人员才能获得准确可靠的结果，且具有耗时，检测成本高等缺陷。因此，开发一种快速、低成本、易用、灵敏度高核酸检测方法是必要的。
CRISPR/Cas作为细菌免疫系统的组成部分，在基因编辑方面有广泛应用。由于其独特的非特异性单链核酸裂解活性，基于CRISPR/Cas系统的新型核酸检测生物传感技术已被开发用于核酸检测。但大多数基于CRISPR/Cas系统的诊断平台依赖于非特异性单链DNA(ssDNA)报告探针的反式裂解，而单链DNA报告子通常是双标记的，包括一个荧光分子和一个猝灭分子，分别悬挂在单链DNA两端，信号读出方法主要依赖荧光检测设备，可能导致假阳性结果，增加了信号读出的成本。
电化学生物传感平台在分子诊断方面具有灵敏度高、检测时间短、价格低廉、易于集成等优点。然而，基于CRISPR/Cas的电化学核酸分析技术的灵敏度仍然受到Cas蛋白和靶分子对固定在非均相电极界面上相应探针的可达性的限制。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明的目的是提供一种高灵敏度、高选择性以及操作简单快速，集成性高的核酸分析方法。
本发明提供的一种技术方案为：利用CRISPR/Cas12a体系，在FNAs(DNA框架核酸)支撑的双相界面上进行顺、反式切割，构建新型电化学生物传感平台，具体包括以下步骤：
步骤1、纳米材料AuNFs合成；
步骤2、构建四面体FNAs(框架核酸DNA)修饰的SPCE界面；
步骤3、CRISPR/Cas12a体系切割过程；
步骤4、电化学生物传感器的信号输出。
优选的，所述步骤1包括：
步骤1.1、用10mM磷酸盐缓冲液冲洗SPCE；
步骤1.2、取50uL质量浓度为0.1％的氯金酸溶液滴加在所述SPCE上；
步骤1.3、设置16通道电化学检测仪参数待用：初始电位：-0.2V，采样间隔：0.1s，运行时间：300s，电流灵敏度：1*10-3A/V，静止时间：2s。
优选的，步骤2包括固定框架核酸DNA和单链DNA探针，具体操作步骤如下：
步骤2.1、将框架核酸DNA和单链DNA探针，分别滴加到SPCE工作电极上，室温，湿盒中过夜；
步骤2.2、10mM磷酸盐缓冲液冲洗SPCE；
步骤2.3、将50uL质量浓度为1％酪蛋白滴加到SPCE上，37℃孵育2h。
进一步，优选的，所述框架核酸DNA和单链DNA探针浓度为1uM，加量体积为5uL。
优选的，所述步骤3包括：
步骤3.1合成Cas12a/crRNA复合物；
步骤3.2混合靶标溶液与Cas12a/crRNA复合物；
步骤3.3取步骤3.2获得的混合物8μL，滴入FNAs修饰的SPCE阵列中；
步骤3.4用10mM PBS缓冲液冲洗SPCE，并取与用1％酪蛋白稀释的SA-HRP 3uL滴加在工作电极上，在25℃下孵育15分钟。
进一步，优选的，所述步骤3.1包括：将浓度为60nM Cas12a、60nM crRNA、1u/μLRNA酶抑制剂和10×NEB缓冲液在无核酸酶的水中混合，合成Cas12a/crRNA复合物。
优选的，所述步骤4包括：然后用10mM PBS冲洗SPCE，将50μL TMB溶液滴到电极上，在-0.3v～0.6v范围内，以100mv/s的扫描速率测定SPCE，在0.05v电压下测定SPCE，在100s稳态下测定电流。
本发明还一种HPV-16核酸分析方法的用途，所述核酸分析方法在病毒、游离肿瘤DNA、miRNA和疾病相关的一种以上生物标记物的同时检测中的应用。
本发明有点在于：
1.FNAs可以减少质量传递和表面拥挤效应，将FNAs固定在电极上，可以优化FNAs向上延伸的DNA探针与目标分子之间的识别，有效地最小化电化学界面上的非特异性相互作用，提高检测的灵敏度和稳定性。
2.通过简单地改变从FNAs延伸的DNA探针序列，可以扩展应用于其他病毒、游离肿瘤DNA、miRNA和疾病相关的生物标记物的检测。
3.使用16通道电化学生物传感平台对电流进行采集，核酸检测无需信号放大过程，即可获得超高的灵敏度，同时可实现多种核酸同时检测分析。
附图说明
图1是本发明检测HPV-16模型靶点流程图；
图2是本发明用于HPV-16模型靶点检测灵敏度实验结果示意图；
图3是本发明用于HPV-16模型靶点检测稳定性实验结果示意图。
具体实施方式
以下结合实施方式并配合附图详予说明。
利用我们首次建立的CRISPR/Cas12a体系，在框架核酸(FNAs)支撑的双相界面上进行顺、反式切割，构建了新型电化学生物传感平台。
我们将该平台应用于单链HPV-16模型靶点检测，在优化的条件下实现了低至100fM的检测限(LOD)。采用自制的16通道电化学工作站，实现了多个样品的同时分析。此外，我们的生物传感器被证实与血清样品相容，在临床应用中显示出巨大的转化潜力，可用于疾病的早期诊断。
如附图1所示本发明原理为，从四面体FNAs延伸出来的生物素修饰探针DNA被设计为报告DNA，可以与靶DNA杂交，通过Cas12a的顺式和反式切割活性，生物素修饰的报告DNA能被有效切割，固定化的FNAs能保证DNA报告探针具有良好的密度和方向控制，从而产生高效的杂交，使得Cas12a更易于接近报告探针，并保证其高效切割活性。
实施例1本发明用于HPV-16模型靶点检测灵敏度实验
(1)纳米材料AuNFs合成
取50uL质量浓度为0.1％的氯金酸溶液滴加在清洗好的丝网印刷电极上，保证每个三电极体系被全覆盖。
用16通道电化学检测仪的计时电流法，设置其参数分别为，初始电位：-0.2V，采样间隔：0.1s，运行时间：300s，电流灵敏度：1*10-3A/V,静止时间：2s。等运行时间结束，清洗电极，备用。
(2)固定四面体FNAs、单链DNA探针：
将合成好的1uM浓度的框架核酸DNA、单链DNA探针滴加5uL于工作电极上，并在室温下置于湿盒中过夜。
用10mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)缓冲液冲洗SPCE，并用50uL 1％酪蛋白(w/v)在37℃孵育2h。
将FNAs修饰的的SPCE在4℃下保存，即可使用。
(3)CRISPR/Cas12a体系非特异性切割过程
将终浓度为60nMCas12a、60nMcrRNA、1u/μLRNA酶抑制剂和10×NEB缓冲液在无核酸酶的水中混合，合成了Cas12a/crRNA复合物。
利用10倍梯度稀释法用上述溶液配制不同浓度的靶标溶液(HPV-16)，包括PBS溶液，100fM，1pM,10pM,100pM,1nM,10nM,100nM。
立即将8μL的Cas12a/crRNA和目标混合物滴入FNAs修饰的SPCE阵列中，在37℃下进行3小时的切割活动。
用10mM PBS(pH，7.4)缓冲液冲洗SPCE，并将1％酪蛋白稀释的SA-HRP 3uL滴加在工作电极上，在25℃下孵育15分钟。
(4)电化学生物传感器的信号输出
然后用10mM PBS(pH值7.4)冲洗SPCE，将50μL TMB溶液滴到电极上。
在-0.3v～0.6v范围内，以100mv/s的扫描速率测定SPCE，在0.05v电压下测定SPCE，在100s稳态下测定电流。
如附图2所示，A)CV和B)IT通过CRISPR/Cas12a系统的顺式和反式切割检测FNAs支持的界面上不同浓度的HPV-16靶点。从上到下：0、1pM、100pM和10nM。C)FNAs和D)ssDNA探针通过CRISPR/Cas12a系统的顺反式切割活性，绘制ΔI％与HPV-16浓度的关系图。E)HPV-16DNA系列中单链DNA和FNAs电化学生物传感器的ΔI％。F)通过CRISPR/Cas12a系统的切割活性比较FNAs和ssDNA修饰界面用来检测HPV-16的效果。结果显示在优化的条件下，本发明实现了单链HPV-16低至100fM的检测限(LOD)。
实施例2本发明用于HPV-16模型靶点检测稳定性实验
步骤(1)-(4)可参照实施例1操作，其中步骤(3)CRISPR/Cas12a体系非特异性切割过程中靶标溶液的准备如下：
准备7组空白组和10nM靶标溶液(HPV-16)，分别在第一天至第七天每天进行一次。
结果如附图3所示：A)目标链的错配数包括PAM和邻近区域。加粗位置代表碱基错配。B)FNAs支持的生物传感器不同错配数的评价。靶区和错配的DNA浓度为1nM。C)FNAs支持的HPV-16生物传感器在不同浓度血清中的检测。D)FNAs支持的生物传感平台对0-7天储存时间的稳定性研究。内嵌图代表空白和1nM HPV-16靶的电流值。本发明实现了对单链HPV-16高稳定性检测。
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