阅读说明：本技术 一种3D DNA行走机器耦合催化发夹自组装的microRNA生物传感器 (3D DNA walking machine coupling catalysis hairpin self-assembly microRNA biosensor ) 是由 谢国明 杨廷燕 方杰 于 2019-05-20 设计创作，主要内容包括：在本专利中,我们提出了一种新的、熵驱动的三维DNA步行机器,它结合了催化发夹组装反应(CHA)成功的用于检测microRNA。此步行机器使用了链霉亲合素包裹的聚苯乙烯微球作为3-D轨道基质,以保证良好的重复性。其制备方法是将miRNA-21作为一个靶目标,通过熵驱动链置换反应不断地在DNA功能化的聚苯乙烯微球轨道上行走,导致聚苯乙烯微球上DNA三核酸复合底物的分解,从而实现miRNA 21的循环。此外,从DNA三核酸复合底物中释放大量辅助链可以催化CHA反应并伴随着获得荧光信号的增加。这种复合生物传感器的线性范围在50pM-20nM之间,检测限低至41pM。此外,在重复性试验(1.05％至4.22％)和回收率试验(99.5％至104.8％)中均获得了满意的结果。结果表明,该方法在疾病诊断方面具有潜在的应用价值。(In this patent, we propose a new, entropy-driven, three-dimensional DNA walking machine that incorporates the catalytic hairpin assembly reaction (CHA) for the successful detection of micrornas. The walking machine used streptavidin-coated polystyrene microspheres as the 3-D orbital matrix to ensure good reproducibility. The preparation method comprises the steps of taking miRNA-21 as a target, continuously walking on a polystyrene microsphere track with DNA functionalization through entropy-driven strand displacement reaction, and causing decomposition of a DNA trinucleotide composite substrate on the polystyrene microsphere, so that circulation of miRNA21 is realized. In addition, the release of a large number of helper strands from the DNA trinucleotide complex substrate may catalyze the CHA reaction with a concomitant increase in the fluorescent signal obtained. The linear range of the composite biosensor is between 50pM and 20nM, and the detection limit is as low as 41 pM. In addition, satisfactory results were obtained in both the reproducibility test (1.05% to 4.22%) and the recovery test (99.5% to 104.8%). The result shows that the method has potential application value in disease diagnosis.)

一种3D DNA行走机器耦合催化发夹自组装的microRNA生物传 感器

技术领域

本发明涉及一种生物传感器，特别涉及一种简便的、熵驱动的3-D DNA行走机器耦合催化发夹自组装反应用于microRNA检测的生物传感器

背景技术

DNA机器是由DNA构建的分子机器，由于Watson Crick碱基配对规则的通用性和可预测性，可以对其进行逻辑设计。各种DNA机器都是通过高度可编程的方法构建和合成的，它包括DNA镊子、DNA马达、DNA步行者和DNA机器人。其中，DNA步行者可以在微米尺度或纳米尺度的程序化寡核苷酸轨道中进行精确控制，在生物传感器、生物计算、药物递送中具有重要的应用潜力。之前的研究已经报道了DNA步行机沿着一维(1D)轨道、二维(2D)折纸、或三维(3D)轨道上进行移动。其中3D DNA步行者拥有更加强大的信号放大能力，这归因于其所有的反应局限在微米级或者是纳米级的材料上，提高了反应物的局部浓度产生了更稳定的信号输出。因此，3D DNA步行者的应用已经引起了人们的广泛关注。例如，Li和同事设计了一种酶驱动的DNA walker传感器，它具有三维轨迹，能够实现对特定核酸的检测；Fan等人设计了一种由核酸外切酶III驱动的随机DNA步行者，可用于超灵敏的生物分析和级联信号放大。Liu和他的同事描述了一种用于检测8-羟基-2’-脱氧鸟苷的三维DNA步行者，它比以前报道的方法低了三个数量级。虽然这些方法具有较高的灵敏度，但它们都依赖于酶，易受复杂条件(如缓冲液和温度)的影响，检测成本高，不易长期储存。因此，研究非酶的三维DNA步行者引起了了人们的强烈关注。

最近，Ye和他的同事报道了一个由熵驱动反应(EDR)促发的在金纳米粒子(AuNPs)上行走的三维DNA漫步者。与依赖酶的信号放大系统相比，熵驱动反应是一种不需要酶或精确温度循环的催化放大信号策略。在熵增加的情况下，利用一串单核酸链通过toehold介导的链置换反应在催化电路中发挥多重作用。由于其独特和非凡的驱动力，系统的总碱基对数在放大过程中保持不变，从而减少了电路泄漏的机会，为准确检测提供了更可靠的平台。在EDR的帮助下，上述三维DNA步行者在miRNA的成像方面具有较高的敏感性。然而，AuNPs作为三维轨道基质有着不可避免的局限性。一方面，DNA与AuNPs之间的作用通常是通过金硫键进行连接的。这种连接作用力不够强，难以避免非特异的DNA吸附，严重阻碍了DNA杂交，降低了胶体稳定性。另一方面，它需要将亲和配体和三核酸复合物固定在AuNPs表面，并对他们的比例进行相应的优化，导致DNA和AuNPs共轭产物的重复性较差。

的比例进行相应的优化，导致DNA和AuNPs共轭产物的重复性较差。

解决上述问题的一个可行方法是寻找用来固定DNA的其他底物。单分散的聚苯乙烯微球由于表面积大、表面反应能力强，在DNA条码检测中得到了广泛的应用。更重要的是，商品化的链霉亲和素修饰的聚苯乙烯微球可以通过亲和素-生物素反应很容易地功能化，具有良好的重复性。链霉亲和素与生物素的结合作用力比Au-S键强得多。因此，链霉亲和素包覆聚苯乙烯微球可作为构建三维DNA步行者的潜在底物。与此同时，在DNA机器的构建中利用等温扩增技术实现生物分子的敏感检测已引起了人们越来越多的兴趣。催化发夹自组装(CHA)是一种经济有效的无酶级联扩增策略。因此基于熵驱动的三维DNA步行者和CHA的优点引起了我们对核酸检测领域的兴趣。

在目前的工作中，我们提出一种新的基于熵驱动的三维DNA步行者与CHA催化发夹自组装反应相耦合的生物传感器，实现了对皮摩尔水平miRNA的敏感检测。我们使用miRNA21作为模型目标，它与包括血液癌症在内的许多疾病密切相关。在该系统中，miRNA 21作为催化剂和随机DNA步行者，在聚苯乙烯微球的表面不断移动，导致固定在微球上的三核酸复合物分解，并释放大量辅助核酸(AS)，实现了miRNA 21的循环。同时，AS可以催化CHA反应产生高信号输出。由于熵驱动反应的引入，它在区别于其他同源miRNAs时具有显著的选择性，除了miRNA-200b外其它几种miRNA的信号占miR-121的信号不到5％。该复合生物传感器工作可在50pM到20nM浓度范围内工作，检测限低至41pM。此外，在重复性试验(从1.05％到4.22％)和回收率试验(从99.5％到104.8％)中均取得了满意的结果。

发明内容

本发明的目的是开发出一种简单、特异、灵敏检测RNA的生物传感器。

具体技术方案如下：

一种简便的、熵驱动的3-D DNA行走机器耦合催化发夹自组装反应用于microRNA检测的生物传感器，其制备方法包括以下步骤：

(1)3-D DNA行走机器的制备

将纯化后的三条核酸链LS、AS、S和TEMg缓冲液经退火后重新折叠以制备LS/AS/S三核酸复合物(C3)。LS∶AS∶S的比值为1∶1.5∶1.5。退火过程是将溶液在PCR仪里加热到95℃，5min，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度慢慢降低到25℃。接着将链霉亲和素修饰的聚苯乙烯微球(PS)50μL以12000转离心5分钟，用binding buffer洗涤2次后离心弃去上清液。再用50μL binding buffer重悬浮后加入5μLμM C3。在37℃恒温箱孵育15分钟后，用TEMg 缓冲液洗涤3次，12000转离心5分钟弃去上清。最后再用50μL的TEMg缓冲液重悬浮，最后DNA功能化的3-D DNA行走机器(C3/PS)制备完成。

(2)信号探针的制备

将发夹探针(H1)和发夹探针(H2)退火后重新折叠。将溶液在PCR仪里加热到95℃，5min，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度慢慢降低到25℃。将标记了FAM的信号探针RepF，标记了BHQ1的信号探针RepQ以1∶2的比例在1×TNaK缓冲液中杂交。

(3)MicroRNA的检测

将5μL C3/PS复合物，2μL，10μM燃料核酸(FS)，33μL cutsmart缓冲液，和10μL不同浓度的目标物在37℃恒温箱孵育60分钟。然后离心分离取40μL的上层清液添加到含有5μL1μM H1，2μL 10μM H2，10μL 50nM RepF：RepQ复合物和23μL 1×TNaK缓冲液中，在室温下避光反应60分钟。最后用荧光分光光度计测量荧光信号。

所述步骤(1)中LS∶AS∶S的比值为1∶1.5∶1.5。

所述步骤(2)中RepF和RepQ的比例是1∶2。

所述步骤(3)中熵驱动是在37℃恒温箱孵育60分钟

所述步骤(3)中催化发夹自组装反应在室温下避光反应60分钟

本发明建立了一种以聚苯乙烯微球为轨道的3D DNA行走机器并耦合催化发夹自组装反应用来灵敏的检测miRNA的生物传感器。其检测原理为，连接核酸(LS)、辅助核酸(AS)、基质核酸(S)可以通过碱基互补配对原则形成三核酸复合物(C3)，在连接核酸(LS)的5’端修饰生物素，三核酸复合物可以通过链霉亲和素反应固定在修饰了链霉亲和素的聚苯乙烯微球上。在目标miRNA 21(T)存在的条件下，通过toheld介导的链置换反应置换下AS并暴露一个新的toheld，在燃料核酸(F)存在的条件下通过这个新的toheld又可以置换下来目标 miRNA 21构成其循环并生成一条废弃的双链F/S。此外被置换下来的AS作为一条催化剂链可以催化后续的一个催化发夹自组装反应，打开发夹结构H1进而再打开发夹结构H2，形成H1/H2 复合物并构成AS的循环以打开新的H1和H2。一条标记了FAM荧光基团的核酸链和一条标记了BHQ1淬灭基团的核酸链通过碱基互补配对形成双链，构成信号探针。通过H1和H2复合物的toheld可以置换下来标记了FAM荧光基团的核酸链，从而使淬灭的荧光得以恢复，用荧光分光光度计检测其荧光信号即可。

聚苯乙烯微球的形状均一性对此3D DNA行走机器的重复性起着至关重要的作用，本发明采用扫描电镜对其进行了形态学表征。如附图1所示，a和b分别显示了聚苯乙烯微球在低倍和高倍下的扫描图像。可以看出，聚苯乙烯微球具有高度的均一性和良好的分散性。其平均尺寸约为800纳米。高质量的聚苯乙烯微球保证了我们3D DNA行走机器的良好性能。同时，本专利就传感策略的可行性进行了证明。首先我们分开证明了熵驱动的链置换反应和催化发夹自组装反应的可行性。分别在在LS的5’端标记FAM，S的3’端标记BHQ1。当三核酸复合物形成时，FAM荧光被BHQ1猝灭。图2中曲线b表示当T和F存在时，三核酸复合物被解离，被淬灭的荧光得以恢复。曲线a表示没有T的背景荧光信号。如图3所示，3.5％琼脂糖凝胶分别验证了EDR和CHA反应的可行性。C3在Lane 2中的缓慢的迁移清楚地表明了三核酸复合物的形成。与仅存在C3和F的lane 3相比，lane 5出现了一个新的条带F/S，并且C3的条带明显消失，表明三核酸复合物被T消耗了。同时，在lane 9出现了AS和H1/H2 复合物的条带，这可能是由于AS催化了CHA反应。此外，还使用其他条带作为标记或参照。 3.5％琼脂糖凝胶电泳的结果初步验证了EDR和CHA反应的可行性。

随后，我们证明了熵驱动的3D DNA行走机器耦合催化发夹自组装反应的可行性。如图4所示，在没有熵驱动过程的情况下，CHA(曲线a)的背景荧光信号可以忽略不计。此外，在没有T的情况下，熵驱动与催化发夹自组装结合时(曲线b)背景荧光信号略有增加。与此背景信号相比，在10nm T存在时，520nm处荧光信号显著增加(曲线c)，由此说明将熵驱动与催化发夹自组装的结合策略是可行的。值得注意的是，单独熵驱动过程的信噪比(图2)确实低于熵驱动与催化发夹自组装反应的组合生物传感器(图4)，其信号放大效率更优、效率更高。反应体系的荧光动力学如图5所示。

检测条件是影响生物传感器分析性能的重要因素。在该体系中，toehold 1的碱基个数影响链位移反应的发生。我们分别优化了7nt-10nt的toehold个数，这些结果(图6)表明，随着toehold 1碱基长度的增加，步行传感器的荧光强度也随之增强。但当碱基个数超过9nt 时，信号急剧下降。因此，我们选择9nt来作为最佳的toehold的个数用于接下来的实验。 F的浓度在一定程度上影响了熵驱动的可行性，我们记录了50nM、100nM、150nM、200nM、300nMF 的荧光强度。如图7所示，200nM是最合适的浓度，因为过量的F可能会导致更高的背景信号。然后分别在25℃和37℃条件下对传感器进行优化。如图8所示，在25℃时的信噪比高于37℃，最终优化了催化发夹自组装(图9)和熵驱动(图10)的反应时间。在0～60min的时间范围内，信噪比随时间不断增加，然后再随着时间的增加信噪比逐渐减小。造成这种现象的原因可能是当时间超过60分钟时，背景信号的增长速度大于目标信号的增长速度。因此，60分钟被认为是最佳时间。

为了探索这个整合的荧光生物传感器的灵敏度，在最佳条件下我们用一系列不同浓度的miRNA 对本策略进行了研究。如图11所示，随着miRNA浓度的增加，可见在520nm处荧光信号逐渐增强。此外，荧光信号在50pM到20nM范围内随miRNA浓度的对数呈线性变化(图12)，有着比较好的线性关系。线性回归方程为F＝126.651+66.460log[C](nM)(C为miRNA浓度，F为荧光强度)，相关系数(R2)为0.997。通过计算，最低检测限(LOD)为41pM。与其他方法的比较如图13所示，说明该策略优于已有的一些方法。

众所周知，特异性是评价生物传感策略成功与否的必要条件之一。因此，我们探讨了在相同条件下四种同源miRNA(包括let-7d、miR-141、miR-15a、miR-200b)存在下，本策略的特异性。如图14所示，在10nm miR-21的存在下ΔF520nm有着较强的信号。我们将ΔF520nm定义为ΔF520nm＝(F-F0)/F0，F是目标存在下测量数据在520nm的荧光强度，F0是在没有目标存在下测量在520nm的荧光强度。值得注意的是，与靶miRNA触发的高荧光信号相比，其它同源的miRNA荧光信号较低。let-7d、miR-141、miR-15a、miR-200b信号分别占miR-121 信号的1.09％、3.69％、6.48％和9.01％。因此，该方法对miRNA检测具有很好的选择性和特异性。事实上，本生物传感器在区分同源miRNA有这么好的能力得益于熵驱动反应。在此系统中，反应的热力学和动力学耦合在一起，因此这种DNA电路的结合自由能(ΔG)达到动态平衡。即使一个碱基的变化也会极大地影响ΔG减少杂交效率。

本发明对该传感策略的重复性进行了试验。方法如下：取三个浓度水平的miRNA待检样品 (0.1nM、1nM和10nM)，每个浓度分别测三次，并计算相对标准偏差。测试结果如图15所示，以上三个浓度水平的miRNA待检样品相对标准偏差分别为4.22％、3.81％和1.05％。结果表明该传感策略获得了比较满意的重复性。

综上所述，我们设计了一种新型的、简单的、熵驱动的3D DNA步行机器并耦合CHA反应。该生物传感器成功地应用于皮摩尔水平的miR-21检测，显示出了一些具有吸引力的优点。首先，它是一个无酶体系，不需要严格的反应条件和高检测成本，摒弃了繁琐的热循环程序。此外，我们使用链霉亲和素包覆的聚苯乙烯微球作为3D DNA步行机器的轨道，具有良好的重复性，并将目标作为随机的DNA walker，使3D DNA步行机器的结构简单。最后，该复合生物传感器对同源miRNA具有显著的特异性，除miRNA-200b外，其它占miR-121的信号不超过5％。同时，我们在重复性试验(1.05％～4.22％)和回收率试验(99.5％～104.8％)中均得了令人满意的结果。因此，我们有理由相信这种整合的无酶3D DNA步行机器偶联CHA反应在即时检验诊断中具有重要的应用前景。

附图说明

图1是链霉亲和素包裹聚苯乙烯微粒的扫描电镜图像

图2是单独熵驱动可行性分析的荧光分光光度计图谱(扫描)

图3是熵驱动链置换反应和CHA反应的琼脂糖凝胶电泳图

图4是3D DNA步行机器耦合CHA反应可行性分析的荧光分光光度计图谱(扫描)

图5是3D DNA步行机器耦合CHA反应可行性分析的荧光分光光度计图谱(动力学)

图6是S的toehold个数的优化

图7 F浓度的优化

图8是CHA反应温度的优化

图9是CHA反应时间的优化

图10是EDR反应时间的优化

图11是不同浓度下miRNA21水平下的荧光信号

图12是不同浓度的miRNA21与荧光信号的线性关系

图13是本发明与其它方法学比较

图14是是传感策略的特异性试验

图15是是传感策略的重复性试验

具体实施方式

制备基于熵驱动的3-D DNA行走机器耦合催化发夹自组装的生物传感器，按以下步骤操作：

(1)3-D DNA行走机器的制备

将纯化后的三条核酸链LS、AS、S和TEMg缓冲液经退火后重新折叠以制备LS/AS/S三核酸复合物(C3)。LS∶AS∶S的比值为1∶1.5∶1.5。退火过程是将溶液在PCR仪里加热到95℃，5min，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度慢慢降低到25℃。接着将链霉亲和素修饰的聚苯乙烯微球(PS)50μL以12000转离心5分钟，用binding buffer洗涤2次后离心弃去上清液。再用50μL binding buffer重悬浮后加入5μLμM C3。在37℃恒温箱孵育15分钟后，用TEMg 缓冲液洗涤3次，12000转离心5分钟弃去上清。最后再用50μL的TEMg缓冲液重悬浮，最后DNA功能化的3-D DNA行走机器(C3/PS)制备完成

(2)信号探针的制备

将发夹探针(H1)和发夹探针(H2)退火后重新折叠。将溶液在PCR仪里加热到95℃，5min，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度慢慢降低到25℃。将标记了FAM的信号探针RepF，标记了BHQ1的信号探针RepQ以1∶2的比例在1×TNaK缓冲液中杂交。

(3)microRNA的检测

将5μL C3/PS复合物，2μL，10μM燃料核酸(FS)，33μL cutsmart缓冲液，和10μL不同浓度的目标物在37℃恒温箱孵育60分钟。然后离心分离取40μL的上层清液添加到含有5μL1μM H1，2μL 10μM H2，10μL 50nM RepF：RepQ复合物和23μL 1×TNaK缓冲液中，在室温下避光反应60分钟。最后用荧光分光光度计测量荧光信号。