一种dna纳米疫苗及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种dna纳米疫苗及其制备方法和应用 (A kind of DNA nano vaccine and its preparation method and application ) 是由 丁宝全 刘少利 蒋乔 于 2019-09-09 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种DNA纳米疫苗及其制备方法和应用,所述DNA纳米疫苗包括DNA纳米结构、肿瘤抗原多肽-DNA复合物和免疫佐剂；所述免疫佐剂包括双链RNA免疫佐剂和/或CpG免疫佐剂。本发明创造性地构建了一种由DNA模板、辅助折叠DNA链和捕获DNA链组装而成的纳米结构,巧妙地通过捕获DNA链实现了肿瘤抗原分子和免疫佐剂分子在DNA自组装纳米结构表面的精确定位；同时,在管状DNA纳米结构的一侧设计可控的DNA分子“开关”,能够在进入抗原递呈细胞后响应内涵体的酸环境,从而释放肿瘤抗原和免疫佐剂分子,具有显著的肿瘤抗原特异性免疫刺激效果,是一种高效安全的新型肿瘤疫苗用于多种恶性肿瘤的免疫治疗与预防。(The present invention provides a kind of DNA nano vaccine and its preparation method and application, the DNA nano vaccine includes DNA nanostructure, tumor-antigen peptide-DNA compound and immunologic adjuvant；The immunologic adjuvant includes double-stranded RNA immunologic adjuvant and/or CpG immunologic adjuvant.The present invention creatively constructs a kind of nanostructure made of being assembled as DNA profiling, folding assisted DNA chain and capture dna chain, dexterously realizes tumour antigen molecule and immunologic adjuvant molecule in the accurate positioning on DNA self-assembled nano structures surface by capture dna chain；Simultaneously, controllable DNA molecular " switch " is designed in the side of tubulose DNA nanostructure, the acid environment of endosome can be responded after entering antigen presenting cell, to release tumor antigen and immunologic adjuvant molecule, it is that a kind of novel tumor vaccine of highly effective and safe is used for the immunization therapy and prevention of Several Kinds of Malignancy with significant specific for tumour antigen immunostimulating effect.)
技术领域
本发明属于纳米医学技术领域，涉及一种DNA纳米疫苗及其制备方法和应用，尤其涉及一种装载有肿瘤抗原和免疫佐剂的管状DNA纳米疫苗及其制备方法和在肿瘤免疫治疗中的应用。
背景技术
目前，肿瘤治疗存在着预后较差、五年生存率低的问题，提高肿瘤的治疗效果是亟待解决的科学问题。近年来快速发展的肿瘤免疫治疗方法为肿瘤治疗带来了突破性成果，肿瘤疫苗，尤其是针对特定患者的个体化疫苗越来越受到研究者的重视，有望在不久的将来成为新的肿瘤治疗方案。然而，肿瘤疫苗的有效性仍然有限。例如，游离抗原在被树突状细胞(dendritic cells，DC)内化之前可能被迅速清除；在没有免疫佐剂存在的条件下，肿瘤疫苗容易诱导机体产生免疫耐受，限制了其治疗效果。如何提高免疫系统的响应能力，进一步提高肿瘤疫苗的治疗效果并减少副作用的发生，是亟待解决的问题。近期研究证实，药物递送系统可以通过调节免疫治疗药物的生物分布、定位、体内稳定性和释放动力学，来增强免疫刺激治疗的功效。因此，利用生物材料设计新型的纳米肿瘤疫苗，具有重要的研究意义和广阔的应用前景。
CN102614527A公开了一种具有pH敏感特性的抗酸纳米颗粒口服DNA抗肿瘤疫苗及制备方法，所述的DNA口服疫苗是一种由海藻酸进行表面修饰的壳聚糖结合编码肿瘤特异性抗原Legumain蛋白DNA质粒的纳米颗粒，能够高效在小肠派氏***中被树突状细胞及巨噬细胞吞噬，并表达编码的肿瘤抗原，激活宿主对肿瘤细胞的免疫杀伤，毒副作用小，且具有强烈的抗原呈递作用，但是存在循环时间短、易被清除等问题。
DNA纳米技术是一种新颖而独特的DNA自组装技术，已被广泛应用于自下而上(Bottom-up)制备纳米尺度的二维和三维DNA纳米结构。利用DNA纳米技术构建的DNA纳米结构具有结构可控且易于修饰的特点，在药物运输和逆转耐药等方面具有广阔的应用前景。因此，研制高效、低毒、靶向和可控的DNA纳米结构作为药物运输载体，具有重大的实践意义。与传统的抗肿瘤药物运输载体相比，DNA纳米结构由于其结构可控和易于修饰的特点，在药物靶向运输和可控释放等方面具有显著的优势。DNA纳米结构由DNA组装形成，具有良好的生物相容性；DNA按照碱基互补配对原则进行组装，具有高度的结构预测性；内部进行功能化修饰，能够有效装载具有活性的多种药物，包括基因药物、小分子化学药物、蛋白质或者抗体等；由DNA纳米技术构建的复杂高级结构在细胞裂解液中具有良好的结构稳定性，对于内部装载的药物起到优良的保护作用；外表面使用短链DNA杂交，可以在特定部位靶向修饰功能基团，增强了载药系统的靶向性；DNA纳米结构还可以通过修饰纳米粒子，从而在特定条件下可控开启和关闭，达到控制药物释放的目的。
CN103656662A公开了一种利用多肽介导的DNA纳米结构用作抗肿瘤药物载体的方法，将具备一定功能的多肽连接在DNA纳米结构上，所制备的产物为DNA纳米结构与多肽的复合物，DNA纳米结构表面负载生物分子后与细胞相互作用时，特定功能的多肽能介导负载生物分子的DNA纳米结构进入细胞或特异性地与细胞表面的受体结合，实现DNA结构用作抗肿瘤药物载体的目的，在抗肿瘤药物载体的开发、研究及提高抗肿瘤药物载体的载入效率等方面具有潜在的应用价值，但是所述DNA纳米结构仅能够作为药物载体，不具有肿瘤治疗的效果。
CN109675049A公开了一种pH诱导的药物缓释DNA纳米结构及其制备方法与应用，通过滚环扩增技术合成了长单链DNA，与富含G和C的DNA单链(loading链)互补杂交得到单双链交替的DNA分子聚集体，可负载大量的Dox；当体系的pH降低时，滚环扩增产物折叠形成三螺旋构型，DNA分子聚集体双链解链，释放富含G和C的DNA单链，并且释放出嵌插的Dox，从而完成药物释放，可通过调节pH实现Dox的可逆嵌插和释放；该方法利用生物相容性良好的DNA纳米结构作为药物载体，提高载药量，具有成本低廉、操作简便、对pH响应灵敏度高、反应快速等优点，但是存在对肿瘤的靶向性差的问题。
因此，构建一种新型的肿瘤疫苗，实现疫苗的靶向输送和可控释放，在提高治疗效果的同时减少副作用的发生，在肿瘤免疫治疗领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种DNA纳米疫苗及其制备方法和应用，所述DNA纳米疫苗通过精确的位点设计将肿瘤抗原多肽分子、双链RNA佐剂和CpG佐剂杂交到DNA纳米结构的内部，形成管状三维结构，并在管状DNA纳米结构的表面设置可控DNA开关，以响应抗原递呈细胞中内涵体的酸性环境，实现了肿瘤抗原多肽和免疫佐剂的靶向输送和可控释放，开发得到一种可寻址、安全高效、可控释放、具有较高医用价值的新型肿瘤疫苗。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种DNA纳米疫苗，所述DNA纳米疫苗包括DNA纳米结构、肿瘤抗原多肽-DNA复合物和免疫佐剂；
所述免疫佐剂包括双链RNA免疫佐剂和/或CpG免疫佐剂。
本发明中，DNA纳米疫苗具有抗原递呈细胞内涵体响应性，可有效引起肿瘤特异性免疫反应，有效抑制肿瘤的生长。
本发明中，肿瘤抗原多肽通过“click”反应与DNA链连接形成肿瘤抗原多肽-DNA复合物；双链RNA免疫佐剂以DNA为模板，体外转录形成单链RNA，并将两条单链RNA按照1:1的摩尔比混合后退火得到双链RNA。
本发明中，采用肿瘤抗原多肽和两种免疫佐剂发挥协同作用，通过精准控制三者的相对位置，同时激活TLR3和TLR9两个信号通路，优于仅包含一种免疫佐剂的结构。
优选地，所述DNA纳米结构由DNA模板链、辅助折叠DNA链和捕获DNA链组装形成。
优选地，所述DNA模板链包括M13mp18噬菌体基因组DNA和/或λ噬菌体基因组DNA，优选为M13mp18噬菌体基因组DNA。
本发明中，利用M13mp18噬菌体的环状DNA单链作为主链，过量的短链DNA作为辅链，通过主链与可编程的辅链在特定位置的杂交互补，折叠形成一种二维长方形片层DNA纳米结构。
本发明中，经过基因改造的M13噬菌体基因组DNA或非对称PCR扩增产物也可以作为DNA模板链，用于构建DNA纳米结构。
优选地，所述M13mp18噬菌体基因组DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
SEQ ID NO:1：
AATGCTACTACTATTAGTAGAATTGATGCCACCTTTTCAGCTCGCGCCCCAAATGAAAATATAGCTAAACAGGTTATTGACCATTTGCGAAATGTATCTAATGGTCAAACTAAATCTACTCGTTCGCAGAATTGGGAATCAACTGTTATATGGAATGAAACTTCCAGACACCGTACTTTAGTTGCATATTTAAAACATGTTGAGCTACAGCATTATATTCAGCAATTAAGCTCTAAGCCATCCGCAAAAATGACCTCTTATCAAAAGGAGCAATTAAAGGTACTCTCTAATCCTGACCTGTTGGAGTTTGCTTCCGGTCTGGTTCGCTTTGAAGCTCGAATTAAAACGCGATATTTGAAGTCTTTCGGGCTTCCTCTTAATCTTTTTGATGCAATCCGCTTTGCTTCTGACTATAATAGTCAGGGTAAAGACCTGATTTTTGATTTATGGTCATTCTCGTTTTCTGAACTGTTTAAAGCATTTGAGGGGGATTCAATGAATATTTATGACGATTCCGCAGTATTGGACGCTATCCAGTCTAAACATTTTACTATTACCCCCTCTGGCAAAACTTCTTTTGCAAAAGCCTCTCGCTATTTTGGTTTTTATCGTCGTCTGGTAAACGAGGGTTATGATAGTGTTGCTCTTACTATGCCTCGTAATTCCTTTTGGCGTTATGTATCTGCATTAGTTGAATGTGGTATTCCTAAATCTCAACTGATGAATCTTTCTACCTGTAATAATGTTGTTCCGTTAGTTCGTTTTATTAACGTAGATTTTTCTTCCCAACGTCCTGACTGGTATAATGAGCCAGTTCTTAAAATCGCATAAGGTAATTCACAATGATTAAAGTTGAAATTAAACCATCTCAAGCCCAATTTACTACTCGTTCTGGTGTTTCTCGTCAGGGCAAGCCTTATTCACTGAATGAGCAGCTTTGTTACGTTGATTTGGGTAATGAATATCCGGTTCTTGTCAAGATTACTCTTGATGAAGGTCAGCCAGCCTATGCGCCTGGTCTGTACACCGTTCATCTGTCCTCTTTCAAAGTTGGTCAGTTCGGTTCCCTTATGATTGACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCTAAGTAACATGGAGCAGGTCGCGGATTTCGACACAATTTATCAGGCGATGATACAAATCTCCGTTGTACTTTGTTTCGCGCTTGGTATAATCGCTGGGGGTCAAAGATGAGTGTTTTAGTGTATTCTTTTGCCTCTTTCGTTTTAGGTTGGTGCCTTCGTAGTGGCATTACGTATTTTACCCGTTTAATGGAAACTTCCTCATGAAAAAGTCTTTAGTCCTCAAAGCCTCTGTAGCCGTTGCTACCCTCGTTCCGATGCTGTCTTTCGCTGCTGAGGGTGACGATCCCGCAAAAGCGGCCTTTAACTCCCTGCAAGCCTCAGCGACCGAATATATCGGTTATGCGTGGGCGATGGTTGTTGTCATTGTCGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTGTTTAAGAAATTCACCTCGAAAGCAAGCTGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAATTCCTTTAGTTGTTCCTTTCTATTCTCACTCCGCTGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAATCCCATACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGATCGTTACGCTAACTATGAGGGCTGTCTGTGGAATGCTACAGGCGTTGTAGTTTGTACTGGTGACGAAACTCAGTGTTACGGTACATGGGTTCCTATTGGGCTTGCTATCCCTGAAAATGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTACTAAACCTCCTGAGTACGGTGATACACCTATTCCGGGCTATACTTATATCAACCCTCTCGACGGCACTTATCCGCCTGGTACTGAGCAAAACCCCGCTAATCCTAATCCTTCTCTTGAGGAGTCTCAGCCTCTTAATACTTTCATGTTTCAGAATAATAGGTTCCGAAATAGGCAGGGGGCATTAACTGTTTATACGGGCACTGTTACTCAAGGCACTGACCCCGTTAAAACTTATTACCAGTACACTCCTGTATCATCAAAAGCCATGTATGACGCTTACTGGAACGGTAAATTCAGAGACTGCGCTTTCCATTCTGGCTTTAATGAGGATTTATTTGTTTGTGAATATCAAGGCCAATCGTCTGACCTGCCTCAACCTCCTGTCAATGCTGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGCGGCTCTGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGCTCTGAGGGAGGCGGTTCCGGTGGTGGCTCTGGTTCCGGTGATTTTGATTATGAAAAGATGGCAAACGCTAATAAGGGGGCTATGACCGAAAATGCCGATGAAAACGCGCTACAGTCTGACGCTAAAGGCAAACTTGATTCTGTCGCTACTGATTACGGTGCTGCTATCGATGGTTTCATTGGTGACGTTTCCGGCCTTGCTAATGGTAATGGTGCTACTGGTGATTTTGCTGGCTCTAATTCCCAAATGGCTCAAGTCGGTGACGGTGATAATTCACCTTTAATGAATAATTTCCGTCAATATTTACCTTCCCTCCCTCAATCGGTTGAATGTCGCCCTTTTGTCTTTGGCGCTGGTAAACCATATGAATTTTCTATTGATTGTGACAAAATAAACTTATTCCGTGGTGTCTTTGCGTTTCTTTTATATGTTGCCACCTTTATGTATGTATTTTCTACGTTTGCTAACATACTGCGTAATAAGGAGTCTTAATCATGCCAGTTCTTTTGGGTATTCCGTTATTATTGCGTTTCCTCGGTTTCCTTCTGGTAACTTTGTTCGGCTATCTGCTTACTTTTCTTAAAAAGGGCTTCGGTAAGATAGCTATTGCTATTTCATTGTTTCTTGCTCTTATTATTGGGCTTAACTCAATTCTTGTGGGTTATCTCTCTGATATTAGCGCTCAATTACCCTCTGACTTTGTTCAGGGTGTTCAGTTAATTCTCCCGTCTAATGCGCTTCCCTGTTTTTATGTTATTCTCTCTGTAAAGGCTGCTATTTTCATTTTTGACGTTAAACAAAAAATCGTTTCTTATTTGGATTGGGATAAATAATATGGCTGTTTATTTTGTAACTGGCAAATTAGGCTCTGGAAAGACGCTCGTTAGCGTTGGTAAGATTCAGGATAAAATTGTAGCTGGGTGCAAAATAGCAACTAATCTTGATTTAAGGCTTCAAAACCTCCCGCAAGTCGGGAGGTTCGCTAAAACGCCTCGCGTTCTTAGAATACCGGATAAGCCTTCTATATCTGATTTGCTTGCTATTGGGCGCGGTAATGATTCCTACGATGAAAATAAAAACGGCTTGCTTGTTCTCGATGAGTGCGGTACTTGGTTTAATACCCGTTCTTGGAATGATAAGGAAAGACAGCCGATTATTGATTGGTTTCTACATGCTCGTAAATTAGGATGGGATATTATTTTTCTTGTTCAGGACTTATCTATTGTTGATAAACAGGCGCGTTCTGCATTAGCTGAACATGTTGTTTATTGTCGTCGTCTGGACAGAATTACTTTACCTTTTGTCGGTACTTTATATTCTCTTATTACTGGCTCGAAAATGCCTCTGCCTAAATTACATGTTGGCGTTGTTAAATATGGCGATTCTCAATTAAGCCCTACTGTTGAGCGTTGGCTTTATACTGGTAAGAATTTGTATAACGCATATGATACTAAACAGGCTTTTTCTAGTAATTATGATTCCGGTGTTTATTCTTATTTAACGCCTTATTTATCACACGGTCGGTATTTCAAACCATTAAATTTAGGTCAGAAGATGAAATTAACTAAAATATATTTGAAAAAGTTTTCTCGCGTTCTTTGTCTTGCGATTGGATTTGCATCAGCATTTACATATAGTTATATAACCCAACCTAAGCCGGAGGTTAAAAAGGTAGTCTCTCAGACCTATGATTTTGATAAATTCACTATTGACTCTTCTCAGCGTCTTAATCTAAGCTATCGCTATGTTTTCAAGGATTCTAAGGGAAAATTAATTAATAGCGACGATTTACAGAAGCAAGGTTATTCACTCACATATATTGATTTATGTACTGTTTCCATTAAAAAAGGTAATTCAAATGAAATTGTTAAATGTAATTAATTTTGTTTTCTTGATGTTTGTTTCATCATCTTCTTTTGCTCAGGTAATTGAAATGAATAATTCGCCTCTGCGCGATTTTGTAACTTGGTATTCAAAGCAATCAGGCGAATCCGTTATTGTTTCTCCCGATGTAAAAGGTACTGTTACTGTATATTCATCTGACGTTAAACCTGAAAATCTACGCAATTTCTTTATTTCTGTTTTACGTGCAAATAATTTTGATATGGTAGGTTCTAACCCTTCCATTATTCAGAAGTATAATCCAAACAATCAGGATTATATTGATGAATTGCCATCATCTGATAATCAGGAATATGATGATAATTCCGCTCCTTCTGGTGGTTTCTTTGTTCCGCAAAATGATAATGTTACTCAAACTTTTAAAATTAATAACGTTCGGGCAAAGGATTTAATACGAGTTGTCGAATTGTTTGTAAAGTCTAATACTTCTAAATCCTCAAATGTATTATCTATTGACGGCTCTAATCTATTAGTTGTTAGTGCTCCTAAAGATATTTTAGATAACCTTCCTCAATTCCTTTCAACTGTTGATTTGCCAACTGACCAGATATTGATTGAGGGTTTGATATTTGAGGTTCAGCAAGGTGATGCTTTAGATTTTTCATTTGCTGCTGGCTCTCAGCGTGGCACTGTTGCAGGCGGTGTTAATACTGACCGCCTCACCTCTGTTTTATCTTCTGCTGGTGGTTCGTTCGGTATTTTTAATGGCGATGTTTTAGGGCTATCAGTTCGCGCATTAAAGACTAATAGCCATTCAAAAATATTGTCTGTGCCACGTATTCTTACGCTTTCAGGTCAGAAGGGTTCTATCTCTGTTGGCCAGAATGTCCCTTTTATTACTGGTCGTGTGACTGGTGAATCTGCCAATGTAAATAATCCATTTCAGACGATTGAGCGTCAAAATGTAGGTATTTCCATGAGCGTTTTTCCTGTTGCAATGGCTGGCGGTAATATTGTTCTGGATATTACCAGCAAGGCCGATAGTTTGAGTTCTTCTACTCAGGCAAGTGATGTTATTACTAATCAAAGAAGTATTGCTACAACGGTTAATTTGCGTGATGGACAGACTCTTTTACTCGGTGGCCTCACTGATTATAAAAACACTTCTCAGGATTCTGGCGTACCGTTCCTGTCTAAAATCCCTTTAATCGGCCTCCTGTTTAGCTCCCGCTCTGATTCTAACGAGGAAAGCACGTTATACGTGCTCGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGAGGCCGATACTGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTGACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTTCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAATGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTAAATATTTGCTTATACAATCTTCCTGTTTTTGGGGCTTTTCTGATTATCAACCGGGGTACATATGATTGACATGCTAGTTTTACGATTACCGTTCATCGATTCTCTTGTTTGCTCCAGACTCTCAGGCAATGACCTGATAGCCTTTGTAGATCTCTCAAAAATAGCTACCCTCTCCGGCATTAATTTATCAGCTAGAACGGTTGAATATCATATTGATGGTGATTTGACTGTCTCCGGCCTTTCTCACCCTTTTGAATCTTTACCTACACATTACTCAGGCATTGCATTTAAAATATATGAGGGTTCTAAAAATTTTTATCCTTGCGTTGAAATAAAGGCTTCTCCCGCAAAAGTATTACAGGGTCATAATGTTTTTGGTACAACCGATTTAGCTTTATGCTCTGAGGCTTTATTGCTTAATTTTGCTAATTCTTTGCCTTGCCTGTATGATTTATTGGATGTT.
本发明中，辅助折叠DNA链根据文章“Folding DNA to create nanoscale shapesand patterns.Nature,2006,440,297-302”进行设计，本领域技术人员可以根据需要挑选辅助折叠DNA链，而捕获DNA链的设计可以根据需要进行增多、减少或位点的变更，在整个DNA纳米结构的平面上均可以进行设计。
示例性地，所述辅助折叠DNA链举例如下：
SEQ ID NO:2：CTTTGAAAAGAACTGGCTCATTATTTAATAAA；
SEQ ID NO:3：ACGGCTACTTACTTAGCCGGAACGCTGACCAA；
SEQ ID NO:4：GAGAATAGCTTTTGCGGGATCGTCGGGTAGCA；
SEQ ID NO:5：ACGTTAGTAAATGAATTTTCTGTAAGCGGAGT；
SEQ ID NO:6：ACCCAAATCAAGTTTTTTGGGGTCAAAGAACG；
SEQ ID NO:7：TGGACTCCCTTTTCACCAGTGAGACCTGTCGT；
SEQ ID NO:8：GCCAGCTGCCTGCAGGTCGACTCTGCAAGGCG；
SEQ ID NO:9：ATTAAGTTCGCATCGTAACCGTGCGAGTAACA；
SEQ ID NO:10：ACCCGTCGTCATATGTACCCCGGTAAAGGCTA.
优选地，所述捕获DNA链包括捕获DNA链I、捕获DNA链II和捕获DNA链Ⅲ。
优选地，所述捕获DNA链I由在辅助折叠DNA链的5’端加上与肿瘤抗原多肽-DNA复合物的DNA序列互补杂交的捕获序列I形成，所述捕获序列I的核苷酸序列如SEQ ID NO:16～24所示；
SEQ ID NO:16：
GTCATTACCGTGTCCATCGTAGGCTTGCACAGCGCTT；
SEQ ID NO:17：
CAAAAATCATTGCTCCTTTTGATAAGTTTCATGTCATTACCGTGTCCATCGTAGGCTTGCACAGCGCTT；
SEQ ID NO:18：
AAAGATTCAGGGGGTAATAGTAAACCATAAATGTCATTACCGTGTCCATCGTAGGCTTGCACAGCGCTT；
SEQ ID NO:19：
GGTAGCTAGGATAAAAATTTTTAGTTAACATCGTCATTACCGTGTCCATCGTAGGCTTGCACAGCGCTT；
SEQ ID NO:20：
TTTGCCAGATCAGTTGAGATTTAGTGGTTTAAGTCATTACCGTGTCCATCGTAGGCTTGCACAGCGCTT；
SEQ ID NO:21：
GCAAATATCGCGTCTGGCCTTCCTGGCCTCAGGTCATTACCGTGTCCATCGTAGGCTTGCACAGCGCTT；
SEQ ID NO:22：
TATATTTTAGCTGATAAATTAATGTTGTATAAGTCATTACCGTGTCCATCGTAGGCTTGCACAGCGCTT；
SEQ ID NO:23：
CATTCAACGCGAGAGGCTTTTGCATATTATAGGTCATTACCGTGTCCATCGTAGGCTTGCACAGCGCTT；
SEQ ID NO:24：
ACCGTTCTAAATGCAATGCCTGAGAGGTGGCAGTCATTACCGTGTCCATCGTAGGCTTGCACAGCGCTT.
优选地，所述捕获DNA链II由在辅助折叠DNA链的5’端加上与双链RNA免疫佐剂的粘性末端序列互补杂交的捕获序列II形成，所述捕获序列II的核苷酸序列如SEQ ID NO:25～33所示；
SEQ ID NO:25：
CACGCGTTTCTCAAAT；
SEQ ID NO:26：
GTGCGCAAAGAGTTTACAAAATTAAAGTACGGTGTCTGGAAGAGGTCA；
SEQ ID NO:27：
GTGCGCAAAGAGTTTATTTTTGCGCAGAAAACGAGAATGAATGTTTAG；
SEQ ID NO:28：
GTGCGCAAAGAGTTTACGATTTTAGAGGACAGATGAACGGCGCGACCT；
SEQ ID NO:29：
GTGCGCAAAGAGTTTAGCTCCATGAGAGGCTTTGAGGACTAGGGAGTT；
SEQ ID NO:30：
GTGCGCAAAGAGTTTATCCATATACATACAGGCAAGGCAACTTTATTT；
SEQ ID NO:31：
GTGCGCAAAGAGTTTACCAGGCGCTTAATCATTGTGAATTACAGGTAG；
SEQ ID NO:32：
GTGCGCAAAGAGTTTACAATAAATACAGTTGATTCCCAATTTAGAGAG；
SEQ ID NO:33：
GTGCGCAAAGAGTTTATACCTTTAAGGTCTTTACCCTGACAAAGAAGT.
优选地，所述捕获DNA链Ⅲ由在辅助折叠DNA链的5’端加上与CpG免疫佐剂的5’端延长序列互补杂交的捕获序列Ⅲ形成，所述捕获序列Ⅲ的核苷酸序列如SEQ ID NO:34～42所示；
SEQ ID NO:34：
CCCTAACCCTAACCCTAACCC；
SEQ ID NO:35：
CCCTAACCCTAACCCTAACCCAGTAATCTTAAATTGGGCTTGAGAGAATACCA；
SEQ ID NO:36：
CCCTAACCCTAACCCTAACCCACGAGTAGTGACAAGAACCGGATATACCAAGC；
SEQ ID NO:37：
CCCTAACCCTAACCCTAACCCCCAAATCACTTGCCCTGACGAGAACGCCAAAA；
SEQ ID NO:38：
CCCTAACCCTAACCCTAACCCAAACGAAATGACCCCCAGCGATTATTCATTAC；
SEQ ID NO:39：
CCCTAACCCTAACCCTAACCCTTCGCCATTGCCGGAAACCAGGCATTAAATCA；
SEQ ID NO:40：
CCCTAACCCTAACCCTAACCCGCTCATTTTCGCATTAAATTTTTGAGCTTAGA；
SEQ ID NO:41：
CCCTAACCCTAACCCTAACCCAGACAGTCATTCAAAAGGGTGAGAAGCTATAT；
SEQ ID NO:42：
CCCTAACCCTAACCCTAACCC-CATAACCCGAGGCATAGTAAGAGCTTTTTAAG.
根据上述设计，确保每个DNA纳米结构表面具有捕获位点，捕获位点处的捕获DNA链与肿瘤抗原多肽、双链RNA免疫佐剂和CpG免疫佐剂的延伸序列互补，通过DNA退火杂交，将三者按照一定比例组装至DNA纳米结构表面的特定位点。
优选地，所述肿瘤抗原多肽-DNA复合物、双链RNA免疫佐剂和CpG免疫佐剂通过捕获DNA链结合在DNA纳米结构上。
本发明中，利用碱基互补配对原则，通过位点设计将肿瘤抗原多肽-DNA复合物、双链RNA(dsRNA)免疫佐剂和CpG免疫佐剂连接在自组装形成的二维片层DNA纳米结构表面，精准控制肿瘤抗原多肽和免疫佐剂在片层DNA纳米结构表面的数量和相对位置。
优选地，所述肿瘤抗原多肽-DNA复合物的个数为10-30个，例如可以是10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个，优选为15～20个。
优选地，所述双链RNA免疫佐剂的个数为10-30个，例如可以是10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个，优选为15～20个。
优选地，所述CpG免疫佐剂的个数为10-30个，例如可以是10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个，优选为15～20个。
本发明中，肿瘤抗原多肽为本领域技术人员知晓的任意肿瘤抗原多肽，也可以是根据个体化肿瘤患者筛选得到的新的肿瘤抗原多肽序列。
优选地，所述肿瘤抗原多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；
SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列为：SIINFEKLRRG.
本发明中，所述肿瘤抗原多肽-DNA复合物中DNA的序列如SEQ ID NO:12所示；
SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列为：
AAGCGCTGTGCAAGCCTACGATGGACACGGTAACGAC.
示例性地，所述肿瘤抗原多肽-DNA复合物的序列为：
SIINFEKLRRG-AAGCGCTGTGCAAGCCTACGATGGACACGGTAACGAC.
本发明中，用于体外转录合成双链RNA免疫佐剂的DNA模板的核苷酸序列如SEQ IDNO:13～14所示；
SEQ ID NO:13：
5’-TAATACGACTCACTATAGGTAAACTCTTTGCGCACATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTATCCGCTGGAAGATGGAACCGCTGGAGAGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGAACAATTGCTTTTACAGATGCACATAT-3’；
SEQ ID NO:14：
5’-TTAATACGACTCACTATAGGATATGTGCATCTGTAAAAGCAATTGTTCCAGGAACCAGGGCGTATCTCTTCATAGCCTTATGCAGTTGCTCTCCAGCGGTTCCATCTTCCAGCGGATAGAATGGCGCCGGGCCTTTCTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCAT-3’.
优选地，所述CpG免疫佐剂的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；
SEQ ID NO:15：
5’-GTTAGTGTTAGTGTTAGTTTGCAAGCTGTTGGGTTACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTAGGTGGTAACC-3’.
优选地，所述DNA纳米疫苗的形状包括长方形二维结构和/或管状三维结构。
优选地，所述长方形二维结构的长为80～100nm，例如可以是80nm、81nm、82nm、83nm、84nm、85nm、86nm、87nm、88nm、89nm、90nm、91nm、92nm、93nm、94nm、95nm、96nm、97nm、98nm、99nm或100nm，优选为90～100nm。
优选地，所述长方形二维结构的宽为50～70nm，例如可以是50nm、51nm、52nm、53nm、54nm、55nm、56nm、57nm、58nm、59nm、60nm、61nm、62nm、63nm、64nm、65nm、66nm、67nm、68nm、69nm或70nm，优选为50～60nm。
优选地，所述管状三维结构的底部直径为10～25nm，例如可以是10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、21nm、22nm、23nm、24nm或25nm，优选为19～20nm。
优选地，所述管状三维结构的高为80～100nm，例如可以是80nm、81nm、82nm、83nm、84nm、85nm、86nm、87nm、88nm、89nm、90nm、91nm、92nm、93nm、94nm、95nm、96nm、97nm、98nm、99nm或100nm，优选为90～100nm。
优选地，所述管状三维结构的DNA纳米疫苗上有DNA开关。
本发明中，通过在长方形片层DNA纳米结构的两条长边上杂交具有酸性环境响应能力的DNA开关，所述DNA开关由两条单链DNA杂交形成，两条单链DNA的3’端互补形成酸性响应的双链“锁”，将二维长方形DNA纳米结构卷曲闭合形成三维管状DNA纳米疫苗，最终制备得到内部装载有肿瘤抗原多肽和免疫佐剂、同时具有可控DNA开关的管状DNA纳米疫苗，所述管状DNA纳米疫苗实现了肿瘤抗原多肽和免疫佐剂的装载、运输和在***中的可控释放，是一种新型肿瘤免疫疫苗。
本发明中，DNA开关响应抗原递呈细胞中内涵体的酸性环境，控制管状结构打开，暴露其中的肿瘤抗原多肽和两种免疫佐剂。
优选地，所述DNA开关的个数为5～10个，例如可以是5个、6个、7个、8个、9个或10个，优选为8～10个。
优选地，所述DNA开关的核苷酸序列如SEQ ID NO:43～58所示；
SEQ ID NO:43：
ACGTTAGTAAATGAATTTCTCTTCTCGTTTGCTCTTCTCTTTGGTATTGTCTAAGAGAAGAG；
SEQ ID NO:44：
ACCCAAATCAAGTTTTACCAGACAATACCAAAGAG；
SEQ ID NO:45：
CGTAACGATCTAAAGTTTCTCTTCTCGTTTGCTCTTCTCTTTGGTATTGTCTAAGAGAAGAG；
SEQ ID NO:46：
GTAAAGCACTAAATCG-ACCAGACAATACCAAAGAG；
SEQ ID NO:47：
TGTAGCATTCCACAGATTCTCTTCTCGTTTGCTCTTCTCTTTGGTATTGTCTAAGAGAAGAG；
SEQ ID NO:48：
CCCCGATTTAGAGCTTACCAGACAATACCAAAGAG；
SEQ ID NO:49：
TGAGTTTCGTCACCAGTTCTCTTCTCGTTTGCTCTTCTCTTTGGTATTGTCTAAGAGAAGAG；
SEQ ID NO:50：
GAACGTGGCGAGAAAGACCAGACAATACCAAAGAG；
SEQ ID NO:51：
CAAGCCCAATAGGAACTTCTCTTCTCGTTTGCTCTTCTCTTTGGTATTGTCTAAGAGAAGAG；
SEQ ID NO:52：
CGGCCTTGCTGGTAATACCAGACAATACCAAAGAG；
SEQ ID NO:53：
CTCAGAGCCACCACCCTTCTCTTCTCGTTTGCTCTTCTCTTTGGTATTGTCTAAGAGAAGAG；
SEQ ID NO:54：
CCGCCAGCCATTGCAAACCAGACAATACCAAAGAG；
SEQ ID NO:55：
CCCTCAGAACCGCCACTTCTCTTCTCGTTTGCTCTTCTCTTTGGTATTGTCTAAGAGAAGAG；
SEQ ID NO:56：
GGAAATACCTACATTTACCAGACAATACCAAAGAG；
SEQ ID NO:57：
TATCACCGTACTCAGGTTCTCTTCTCGTTTGCTCTTCTCTTTGGTATTGTCTAAGAGAAGAG；
SEQ ID NO:58：
GAAATGGATTATTTACACCAGACAATACCAAAGAG.
本发明用于肿瘤免疫治疗的管状DNA纳米疫苗，对于装载的肿瘤抗原多肽和免疫佐剂的释放是可控的，管状DNA纳米疫苗被抗原递呈细胞摄取后响应内涵体的酸环境，使三种有效成分在内涵体中可控释放出来。
第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的DNA纳米疫苗的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将DNA模板链、辅助折叠DNA链和捕获DNA链按比例混合于缓冲液中，退火，得到长方形DNA纳米结构；
(2)将步骤(1)得到的退火产物离心纯化，与肿瘤抗原多肽-DNA复合物、双链RNA免疫佐剂和CpG免疫佐剂按比例混合后退火；
(3)将步骤(2)得到的退火产物与DNA开关按比例混合后退火；
(4)将步骤(3)得到的退火产物离心纯化，得到管状DNA纳米疫苗。
优选地，步骤(1)所述退火的条件为：起点温度95℃～65℃，终点温度25℃～4℃，每1℃为一个梯度，每个梯度停留5～10min，保持退火时间为2～24h，优选为7～9h。
优选地，所述起点温度为95～65℃，例如可以是95℃、93℃、91℃、90℃、87℃、85℃、83℃、81℃、80℃、77℃、75℃、73℃、71℃、69℃、67℃或65℃。
优选地，所述终点温度为25～4℃，例如可以是25℃、24℃、23℃、21℃、20℃、19℃、17℃、15℃、13℃、11℃、7℃、5℃或4℃。
优选地，所述退火过程的温度为2～24h，例如可以是2h、4h、6h、7h、8h、9h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h或24h。
优选地，步骤(1)所述DNA模板链、辅助折叠DNA链和捕获DNA链的摩尔比为1:(5-20):(5-20)，例如可以是1:5:5、1:7:7、1:10:10、1:15:15或1:20:20，优选为1:(5-10):(5-10)。
优选地，步骤(1)所述的缓冲液为1×TAE/Mg2+。
优选地，步骤(2)和步骤(3)所述退火的条件为：起点温度45～37℃，终点温度25～16℃，每1℃为一个梯度，每个梯度停留3～8min，进行3～10个循环。
优选地，所述起点温度为45～37℃，例如可以是45℃、44℃、43℃、42℃、41℃、40℃、39℃、38℃或37℃。
优选地，所述终点温度为25～16℃，例如可以是25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、19℃、18℃、17℃或16℃。
优选地，所述循环的个数为3～10个，例如可以是3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个。
优选地，步骤(2)所述退火产物、肿瘤抗原多肽-DNA复合物、双链RNA免疫佐剂和CpG免疫佐剂的摩尔比为1:(2-10):(2-10):(2-10)。
优选地，步骤(3)所述退火产物与DNA开关的摩尔比为1:(1-2)。
优选地，步骤(2)和步骤(4)所述离心的步骤为：将得到的退火产物与1×TAE/Mg2+缓冲液混合并加入100kDa的离心柱，进行离心。
本发明中，发明人通过大量复杂的实验摸索，优化反应条件，探究退火温度和反应时间对纳米结构的影响，各步骤各条件协同增效，最终成功制备得到性能优良的管状DNA纳米疫苗复合结构。
作为优选技术方案，本发明提供了一种如第一方面所述的DNA纳米疫苗的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将DNA模板链、辅助折叠DNA链和捕获DNA链按摩尔比为1:(5-20):(5-20)混合于1×TAE/Mg2+缓冲液中进行退火，退火的条件为：从95℃到65℃，每1℃为一个梯度，每个梯度停留时间为5min；从65℃到25℃，每1℃为一个梯度，每个温度梯度停留时间为10min，整个退火过程为7-9h，得到长方形DNA纳米结构；
(2)将步骤(1)得到的退火产物与1×TAE/Mg2+缓冲液混合并加入100kDa的离心柱，进行离心，随后与肿瘤抗原多肽-DNA复合物、双链RNA免疫佐剂和CpG免疫佐剂按摩尔比为1:(2-10):(2-10):(2-10)混合并退火，退火的条件为：从45℃到25℃，每1℃为一个梯度，每个梯度停留时间为3～5min，进行6个循环；
(3)将步骤(2)得到的退火产物与DNA开关按摩尔比为1:(1-2)混合并退火，退火的条件为：从45℃到25℃，每1℃为一个梯度，每个梯度停留时间为3～5min，进行6个循环；
(4)将步骤(3)得到的退火产物与1×TAE/Mg2+缓冲液混合并加入100kDa的离心柱，进行离心，得到管状DNA纳米疫苗。
第三方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面所述的DNA纳米疫苗。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的DNA纳米疫苗和/或如第三方面所述的药物组合物在制备肿瘤免疫治疗疫苗中的应用。
本发明中，所述肿瘤不限于单一类型的恶性肿瘤，DNA纳米疫苗和/或药物组合物的抗肿瘤免疫治疗效果具有广谱性，可以用于多种恶性肿瘤的治疗与预防，例如黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌等恶性肿瘤。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明利用DNA纳米技术，以M13mp18噬菌体的环状DNA单链作为主链，以过量的短链DNA作为辅链，通过主链与可编程的辅链在特定位置的杂交互补，折叠形成结构可预测和可控制的二维长方形片层DNA纳米结构；
(2)本发明根据碱基互补配对原则，利用捕获DNA链将肿瘤抗原多肽-DNA复合物、双链RNA免疫佐剂和CpG免疫佐剂连接在自组装形成的二维片层DNA纳米结构表面；
(3)本发明在长方形片层DNA纳米结构的两条长边上杂交具有酸性环境响应能力的DNA开关，将片层DNA纳米结构卷曲闭合形成三维管状DNA纳米疫苗，制备得到内部装载有肿瘤抗原多肽和免疫佐剂、同时具有可控DNA开关的管状DNA纳米疫苗；
(4)本发明的管状DNA纳米疫苗能够在靶细胞内响应酸性环境，实现了可控的构象变化，释放肿瘤抗原分子和免疫佐剂，增强了免疫刺激效果；
(5)本发明精准控制肿瘤抗原多肽和两种免疫佐剂在片层DNA纳米结构表面的数量和相对位置，通过调整三者的比例，实现了同时激活TLR3和TLR9信号通路的效果，发挥协同增效作用；
(6)本发明的DNA纳米疫苗作为一种纳米尺度的分子机器用于肿瘤抗原和免疫佐剂的装载，并有效运输到***中实现可控释放，有望为肿瘤免疫治疗提供一种纳米疫苗新剂型。
附图说明
图1为长方形片层DNA纳米结构的原子力显微镜形貌观察图；
图2为管状DNA纳米疫苗的原子力显微镜形貌观察图；
图3为管状DNA纳米疫苗经皮下注射后对腹股沟***的靶向效果；
图4为管状DNA纳米疫苗对黑色素瘤细胞肺转移的抑制效果图；
图5为管状DNA纳米疫苗对小鼠黑色素瘤生长的抑制效果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1长方形片层DNA纳米结构的制备
将M13mp18模板链、辅助折叠DNA链(“订书钉”链)和捕获DNA链混合，模板链和辅助折叠DNA链的终浓度分别为20nM和100nM；利用梯度PCR仪对混合物进行缓慢退火，退火的条件为：从95℃到65℃，每1℃为一个梯度，每个梯度停留时间为5min；从65℃到25℃，每1℃为一个梯度，每个温度梯度停留时间为10min；整个退火过程为8h，得到长方形片层DNA纳米结构；
退火程序完毕后，将长方形DNA纳米结构样品取出，用100kDa离心柱(MWCO)离心分离，去除过量的订书钉链和捕获DNA链；离心条件为：向100μL样品中加入350μL1×TAE-Mg缓冲液，于4800rpm/min的条件下离心3min，离心柱内剩余溶液的体积大约为100μL，重复离心4遍；最终收集的样品分别采用1％琼脂糖凝胶电泳分析和在原子力显微镜下观察片层结构的形貌。
结果如图1所示，构建的DNA纳米结构呈长方形片层结构，原子力显微镜扫描结果显示该长方形DNA纳米结构长约90-100nm，宽约60-80nm，呈现规则的长方形结构。
实施例2装载肿瘤抗原和免疫佐剂的管状DNA纳米疫苗的制备
将纯化后的长方形片层DNA纳米结构溶液和肿瘤抗原多肽-DNA复合物、双链RNA免疫佐剂、CpG免疫佐剂按照1:5:5:5的摩尔比混合均匀，放入梯度PCR仪中，缓慢从45℃降至25℃，每1℃为一个梯度，每个梯度停留时间为5min；进行6个循环；
退火程序结束后，将连接了肿瘤抗原多肽和两种免疫佐剂的样品与DNA分子“开关”按照1:1的摩尔比混合并退火，退火的条件为：从45℃到25℃，每1℃为一个梯度，每个梯度停留时间为5min，进行6个循环；然后用100kDa离心柱离心分离PCR产物，琼脂糖凝胶电泳纯化回收，得到提纯的包载有抗原和佐剂的管状DNA纳米疫苗复合结构。
结果如图2所示，利用原子力显微镜(AFM)对构建的管状DNA纳米结构进行形貌表征，该结构长约90-100nm，宽约20nm，呈现规则的管状结构。
实施例3管状DNA纳米疫苗的***靶向效果评价
将一定剂量的Cy5荧光标记的管状DNA纳米疫苗接种于C57BL/6小鼠尾基部，24h后将小鼠麻醉处死，取小鼠腹股沟***进行荧光成像，评价管状DNA纳米疫苗的***靶向效果。
结果如图3所示，与对照组(荧光标记DNA链和荧光标记长方形DNA纳米结构)相比，管状DNA纳米结构在小鼠的腹股沟***富集效果明显，说明该管状DNA纳米结构作为疫苗的载体具有明显的优势。
实施例4管状DNA纳米疫苗的抗肿瘤转移效果评价
将2.0×105个小鼠B16-OVA黑色素瘤细胞尾静脉注射到C57BL/6小鼠体内，此时计为第0天；将一定剂量的管状DNA纳米疫苗在第1天和第7天给接种于黑色素瘤模型小鼠的尾基部，在第16天将小鼠处死，手术取下小鼠肺组织，观察小鼠肺组织中转移灶的形成情况。
结果如图4所示，与对照组(生理盐水组)相比，实验组(管状DNA纳米疫苗组)的肺组织中转移灶的数量明显较少，说明管状DNA纳米疫苗对肿瘤转移具有明显的抑制作用。
实施例5管状DNA纳米疫苗的抗肿瘤效果评价
将2.0×105个小鼠B16-OVA黑色素瘤细胞接种于C57BL/6小鼠的背部，此时计为第0天；在接种后的第4天，黑色素瘤基本形成；在第4天和第11天分别在小鼠的尾基部接种一定剂量的管状DNA纳米疫苗，每隔2天测量肿瘤体积大小，统计分析肿瘤体积变化情况。肿瘤体积按照以下公式计算，其中d为肿瘤的最小直径，D为肿瘤的最大直径，对照组小鼠注射生理盐水。
体积＝(d2×D)/2
结果如图5(A)和图5(B)所示，相比于生理盐水组，实验组(管状DNA纳米疫苗组)能够有效抑制荷瘤小鼠黑色素瘤的增殖，其中有4只小鼠的肿瘤完全消退，展示出显著的肿瘤治疗效果。
综上所述，本发明利用M13mp18噬菌体的环状DNA单链作为主链，过量的短链DNA作为辅链，通过主链与可编程的辅链在特定位置的杂交互补，折叠形成一种二维长方形片层DNA纳米结构，根据碱基互补配对原则，利用捕获DNA链将肿瘤特异性抗原多肽、双链RNA免疫佐剂和CpG免疫佐剂连接在自组装形成的二维片层DNA纳米结构表面；随后，在长方形片层DNA纳米结构的两条长边上杂交具有酸响应能力的DNA“开关”，从而将长方形结构卷曲闭合形成管状结构，得到一种内部装载有肿瘤抗原和免疫佐剂、同时具有可控“开关”以响应抗原递呈细胞内涵体内酸性环境的管状DNA纳米颗粒疫苗；所述纳米颗粒疫苗的底部直径为19nm，高为90nm，可以作为一种纳米尺度的分子机器用于肿瘤抗原和免疫佐剂的装载，有效运输到***中实现可控释放，有望为肿瘤免疫治疗法提供一种纳米疫苗新剂型。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 国家纳米科学中心
<120> 一种DNA纳米疫苗及其制备方法和应用
<130> 20190906
<160> 58
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 7249
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
aatgctacta ctattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgcccc aaatgaaaat 60
atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaac taaatctact 120
cgttcgcaga attgggaatc aactgttata tggaatgaaa cttccagaca ccgtacttta 180
gttgcatatt taaaacatgt tgagctacag cattatattc agcaattaag ctctaagcca 240
tccgcaaaaa tgacctctta tcaaaaggag caattaaagg tactctctaa tcctgacctg 300
ttggagtttg cttccggtct ggttcgcttt gaagctcgaa ttaaaacgcg atatttgaag 360
tctttcgggc ttcctcttaa tctttttgat gcaatccgct ttgcttctga ctataatagt 420
cagggtaaag acctgatttt tgatttatgg tcattctcgt tttctgaact gtttaaagca 480
tttgaggggg attcaatgaa tatttatgac gattccgcag tattggacgc tatccagtct 540
aaacatttta ctattacccc ctctggcaaa acttcttttg caaaagcctc tcgctatttt 600
ggtttttatc gtcgtctggt aaacgagggt tatgatagtg ttgctcttac tatgcctcgt 660
aattcctttt ggcgttatgt atctgcatta gttgaatgtg gtattcctaa atctcaactg 720
atgaatcttt ctacctgtaa taatgttgtt ccgttagttc gttttattaa cgtagatttt 780
tcttcccaac gtcctgactg gtataatgag ccagttctta aaatcgcata aggtaattca 840
caatgattaa agttgaaatt aaaccatctc aagcccaatt tactactcgt tctggtgttt 900
ctcgtcaggg caagccttat tcactgaatg agcagctttg ttacgttgat ttgggtaatg 960
aatatccggt tcttgtcaag attactcttg atgaaggtca gccagcctat gcgcctggtc 1020
tgtacaccgt tcatctgtcc tctttcaaag ttggtcagtt cggttccctt atgattgacc 1080
gtctgcgcct cgttccggct aagtaacatg gagcaggtcg cggatttcga cacaatttat 1140
caggcgatga tacaaatctc cgttgtactt tgtttcgcgc ttggtataat cgctgggggt 1200
caaagatgag tgttttagtg tattcttttg cctctttcgt tttaggttgg tgccttcgta 1260
gtggcattac gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ctttagtcct 1320
caaagcctct gtagccgttg ctaccctcgt tccgatgctg tctttcgctg ctgagggtga 1380
cgatcccgca aaagcggcct ttaactccct gcaagcctca gcgaccgaat atatcggtta 1440
tgcgtgggcg atggttgttg tcattgtcgg cgcaactatc ggtatcaagc tgtttaagaa 1500
attcacctcg aaagcaagct gataaaccga tacaattaaa ggctcctttt ggagcctttt 1560
ttttggagat tttcaacgtg aaaaaattat tattcgcaat tcctttagtt gttcctttct 1620
attctcactc cgctgaaact gttgaaagtt gtttagcaaa atcccataca gaaaattcat 1680
ttactaacgt ctggaaagac gacaaaactt tagatcgtta cgctaactat gagggctgtc 1740
tgtggaatgc tacaggcgtt gtagtttgta ctggtgacga aactcagtgt tacggtacat 1800
gggttcctat tgggcttgct atccctgaaa atgagggtgg tggctctgag ggtggcggtt 1860
ctgagggtgg cggttctgag ggtggcggta ctaaacctcc tgagtacggt gatacaccta 1920
ttccgggcta tacttatatc aaccctctcg acggcactta tccgcctggt actgagcaaa 1980
accccgctaa tcctaatcct tctcttgagg agtctcagcc tcttaatact ttcatgtttc 2040
agaataatag gttccgaaat aggcaggggg cattaactgt ttatacgggc actgttactc 2100
aaggcactga ccccgttaaa acttattacc agtacactcc tgtatcatca aaagccatgt 2160
atgacgctta ctggaacggt aaattcagag actgcgcttt ccattctggc tttaatgagg 2220
atttatttgt ttgtgaatat caaggccaat cgtctgacct gcctcaacct cctgtcaatg 2280
ctggcggcgg ctctggtggt ggttctggtg gcggctctga gggtggtggc tctgagggtg 2340
gcggttctga gggtggcggc tctgagggag gcggttccgg tggtggctct ggttccggtg 2400
attttgatta tgaaaagatg gcaaacgcta ataagggggc tatgaccgaa aatgccgatg 2460
aaaacgcgct acagtctgac gctaaaggca aacttgattc tgtcgctact gattacggtg 2520
ctgctatcga tggtttcatt ggtgacgttt ccggccttgc taatggtaat ggtgctactg 2580
gtgattttgc tggctctaat tcccaaatgg ctcaagtcgg tgacggtgat aattcacctt 2640
taatgaataa tttccgtcaa tatttacctt ccctccctca atcggttgaa tgtcgccctt 2700
ttgtctttgg cgctggtaaa ccatatgaat tttctattga ttgtgacaaa ataaacttat 2760
tccgtggtgt ctttgcgttt cttttatatg ttgccacctt tatgtatgta ttttctacgt 2820
ttgctaacat actgcgtaat aaggagtctt aatcatgcca gttcttttgg gtattccgtt 2880
attattgcgt ttcctcggtt tccttctggt aactttgttc ggctatctgc ttacttttct 2940
taaaaagggc ttcggtaaga tagctattgc tatttcattg tttcttgctc ttattattgg 3000
gcttaactca attcttgtgg gttatctctc tgatattagc gctcaattac cctctgactt 3060
tgttcagggt gttcagttaa ttctcccgtc taatgcgctt ccctgttttt atgttattct 3120
ctctgtaaag gctgctattt tcatttttga cgttaaacaa aaaatcgttt cttatttgga 3180
ttgggataaa taatatggct gtttattttg taactggcaa attaggctct ggaaagacgc 3240
tcgttagcgt tggtaagatt caggataaaa ttgtagctgg gtgcaaaata gcaactaatc 3300
ttgatttaag gcttcaaaac ctcccgcaag tcgggaggtt cgctaaaacg cctcgcgttc 3360
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cctacgatga aaataaaaac ggcttgcttg ttctcgatga gtgcggtact tggtttaata 3480
cccgttcttg gaatgataag gaaagacagc cgattattga ttggtttcta catgctcgta 3540
aattaggatg ggatattatt tttcttgttc aggacttatc tattgttgat aaacaggcgc 3600
gttctgcatt agctgaacat gttgtttatt gtcgtcgtct ggacagaatt actttacctt 3660
ttgtcggtac tttatattct cttattactg gctcgaaaat gcctctgcct aaattacatg 3720
ttggcgttgt taaatatggc gattctcaat taagccctac tgttgagcgt tggctttata 3780
ctggtaagaa tttgtataac gcatatgata ctaaacaggc tttttctagt aattatgatt 3840
ccggtgttta ttcttattta acgccttatt tatcacacgg tcggtatttc aaaccattaa 3900
atttaggtca gaagatgaaa ttaactaaaa tatatttgaa aaagttttct cgcgttcttt 3960
gtcttgcgat tggatttgca tcagcattta catatagtta tataacccaa cctaagccgg 4020
aggttaaaaa ggtagtctct cagacctatg attttgataa attcactatt gactcttctc 4080
agcgtcttaa tctaagctat cgctatgttt tcaaggattc taagggaaaa ttaattaata 4140
gcgacgattt acagaagcaa ggttattcac tcacatatat tgatttatgt actgtttcca 4200
ttaaaaaagg taattcaaat gaaattgtta aatgtaatta attttgtttt cttgatgttt 4260
gtttcatcat cttcttttgc tcaggtaatt gaaatgaata attcgcctct gcgcgatttt 4320
gtaacttggt attcaaagca atcaggcgaa tccgttattg tttctcccga tgtaaaaggt 4380
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gttttacgtg caaataattt tgatatggta ggttctaacc cttccattat tcagaagtat 4500
aatccaaaca atcaggatta tattgatgaa ttgccatcat ctgataatca ggaatatgat 4560
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agtgctccta aagatatttt agataacctt cctcaattcc tttcaactgt tgatttgcca 4800
actgaccaga tattgattga gggtttgata tttgaggttc agcaaggtga tgctttagat 4860
ttttcatttg ctgctggctc tcagcgtggc actgttgcag gcggtgttaa tactgaccgc 4920
ctcacctctg ttttatcttc tgctggtggt tcgttcggta tttttaatgg cgatgtttta 4980
gggctatcag ttcgcgcatt aaagactaat agccattcaa aaatattgtc tgtgccacgt 5040
attcttacgc tttcaggtca gaagggttct atctctgttg gccagaatgt cccttttatt 5100
actggtcgtg tgactggtga atctgccaat gtaaataatc catttcagac gattgagcgt 5160
caaaatgtag gtatttccat gagcgttttt cctgttgcaa tggctggcgg taatattgtt 5220
ctggatatta ccagcaaggc cgatagtttg agttcttcta ctcaggcaag tgatgttatt 5280
actaatcaaa gaagtattgc tacaacggtt aatttgcgtg atggacagac tcttttactc 5340
ggtggcctca ctgattataa aaacacttct caggattctg gcgtaccgtt cctgtctaaa 5400
atccctttaa tcggcctcct gtttagctcc cgctctgatt ctaacgagga aagcacgtta 5460
tacgtgctcg tcaaagcaac catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg 5520
tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt 5580
cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg 5640
ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga 5700
tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac 5760
gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 5820
tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggaac caccatcaaa 5880
caggattttc gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc 5940
caggcggtga agggcaatca gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg 6000
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 6060
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 6120
cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 6180
tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg aattcgagct 6240
cggtacccgg ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aagcttggca ctggccgtcg 6300
ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac 6360
atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac 6420
agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgct ttgcctggtt tccggcacca gaagcggtgc 6480
cggaaagctg gctggagtgc gatcttcctg aggccgatac tgtcgtcgtc ccctcaaact 6540
ggcagatgca cggttacgat gcgcccatct acaccaacgt gacctatccc attacggtca 6600
atccgccgtt tgttcccacg gagaatccga cgggttgtta ctcgctcaca tttaatgttg 6660
atgaaagctg gctacaggaa ggccagacgc gaattatttt tgatggcgtt cctattggtt 6720
aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa tgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac 6780
aatttaaata tttgcttata caatcttcct gtttttgggg cttttctgat tatcaaccgg 6840
ggtacatatg attgacatgc tagttttacg attaccgttc atcgattctc ttgtttgctc 6900
cagactctca ggcaatgacc tgatagcctt tgtagatctc tcaaaaatag ctaccctctc 6960
cggcattaat ttatcagcta gaacggttga atatcatatt gatggtgatt tgactgtctc 7020
cggcctttct cacccttttg aatctttacc tacacattac tcaggcattg catttaaaat 7080
atatgagggt tctaaaaatt tttatccttg cgttgaaata aaggcttctc ccgcaaaagt 7140
attacagggt cataatgttt ttggtacaac cgatttagct ttatgctctg aggctttatt 7200
gcttaatttt gctaattctt tgccttgcct gtatgattta ttggatgtt 7249
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ctttgaaaag aactggctca ttatttaata aa 32
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
acggctactt acttagccgg aacgctgacc aa 32
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gagaatagct tttgcgggat cgtcgggtag ca 32
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
acgttagtaa atgaattttc tgtaagcgga gt 32
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
acccaaatca agttttttgg ggtcaaagaa cg 32
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
tggactccct tttcaccagt gagacctgtc gt 32
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
gccagctgcc tgcaggtcga ctctgcaagg cg 32
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
attaagttcg catcgtaacc gtgcgagtaa ca 32
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
acccgtcgtc atatgtaccc cggtaaaggc ta 32
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 11
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Arg Arg Gly
1 5 10
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
aagcgctgtg caagcctacg atggacacgg taacgac 37
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
taatacgact cactataggt aaactctttg cgcacatgga agacgccaaa aacataaaga 60
aaggcccggc gccattctat ccgctggaag atggaaccgc tggagagcaa ctgcataagg 120
ctatgaagag atacgccctg gttcctggaa caattgcttt tacagatgca catat 175
<210> 14
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
ttaatacgac tcactatagg atatgtgcat ctgtaaaagc aattgttcca ggaaccaggg 60
cgtatctctt catagcctta tgcagttgct ctccagcggt tccatcttcc agcggataga 120
atggcgccgg gcctttcttt atgtttttgg cgtcttccat 160
<210> 15
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
gttagtgtta gtgttagttt gcaagctgtt gggttaccac cttcattgga aaacgttctt 60
cggggcgttc ttaggtggta acc 83
<210> 16
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
gtcattaccg tgtccatcgt aggcttgcac agcgctt 37
<210> 17
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
caaaaatcat tgctcctttt gataagtttc atgtcattac cgtgtccatc gtaggcttgc 60
acagcgctt 69
<210> 18
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
aaagattcag ggggtaatag taaaccataa atgtcattac cgtgtccatc gtaggcttgc 60
acagcgctt 69
<210> 19
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 19
ggtagctagg ataaaaattt ttagttaaca tcgtcattac cgtgtccatc gtaggcttgc 60
acagcgctt 69
<210> 20
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 20
tttgccagat cagttgagat ttagtggttt aagtcattac cgtgtccatc gtaggcttgc 60
acagcgctt 69
<210> 21
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 21
gcaaatatcg cgtctggcct tcctggcctc aggtcattac cgtgtccatc gtaggcttgc 60
acagcgctt 69
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<211> 69
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 22
tatattttag ctgataaatt aatgttgtat aagtcattac cgtgtccatc gtaggcttgc 60
acagcgctt 69
<210> 23
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 23
cattcaacgc gagaggcttt tgcatattat aggtcattac cgtgtccatc gtaggcttgc 60
acagcgctt 69
<210> 24
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 24
accgttctaa atgcaatgcc tgagaggtgg cagtcattac cgtgtccatc gtaggcttgc 60
acagcgctt 69
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 25
cacgcgtttc tcaaat 16
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 26
gtgcgcaaag agtttacaaa attaaagtac ggtgtctgga agaggtca 48
<210> 27
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 27
gtgcgcaaag agtttatttt tgcgcagaaa acgagaatga atgtttag 48
<210> 28
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 28
gtgcgcaaag agtttacgat tttagaggac agatgaacgg cgcgacct 48
<210> 29
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 29
gtgcgcaaag agtttagctc catgagaggc tttgaggact agggagtt 48
<210> 30
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 30
gtgcgcaaag agtttatcca tatacataca ggcaaggcaa ctttattt 48
<210> 31
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 31
gtgcgcaaag agtttaccag gcgcttaatc attgtgaatt acaggtag 48
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 32
tgcgcaaaga gtttacaata aatacagttg attcccaatt tagagag 47
<210> 33
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 33
gtgcgcaaag agtttatacc tttaaggtct ttaccctgac aaagaagt 48
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 34
ccctaaccct aaccctaacc c 21
<210> 35
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 35
ccctaaccct aaccctaacc cagtaatctt aaattgggct tgagagaata cca 53
<210> 36
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 36
ccctaaccct aaccctaacc cacgagtagt gacaagaacc ggatatacca agc 53
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<211> 53
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 37
ccctaaccct aaccctaacc cccaaatcac ttgccctgac gagaacgcca aaa 53
<210> 38
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 38
ccctaaccct aaccctaacc caaacgaaat gacccccagc gattattcat tac 53
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<211> 53
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 39
ccctaaccct aaccctaacc cttcgccatt gccggaaacc aggcattaaa tca 53
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<211> 53
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 40
ccctaaccct aaccctaacc cgctcatttt cgcattaaat ttttgagctt aga 53
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<211> 53
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 41
ccctaaccct aaccctaacc cagacagtca ttcaaaaggg tgagaagcta tat 53
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<211> 53
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 42
ccctaaccct aaccctaacc ccataacccg aggcatagta agagcttttt aag 53
<210> 43
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 43
acgttagtaa atgaatttct cttctcgttt gctcttctct ttggtattgt ctaagagaag 60
ag 62
<210> 44
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 44
acccaaatca agttttacca gacaatacca aagag 35
<210> 45
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 45
cgtaacgatc taaagtttct cttctcgttt gctcttctct ttggtattgt ctaagagaag 60
ag 62
<210> 46
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 46
gtaaagcact aaatcgacca gacaatacca aagag 35
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<211> 62
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 47
tgtagcattc cacagattct cttctcgttt gctcttctct ttggtattgt ctaagagaag 60
ag 62
<210> 48
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 48
ccccgattta gagcttacca gacaatacca aagag 35
<210> 49
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 49
tgagtttcgt caccagttct cttctcgttt gctcttctct ttggtattgt ctaagagaag 60
ag 62
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 50
gaacgtggcg agaaagacca gacaatacca aagag 35
<210> 51
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 51
caagcccaat aggaacttct cttctcgttt gctcttctct ttggtattgt ctaagagaag 60
ag 62
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 52
cggccttgct ggtaatacca gacaatacca aagag 35
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 53
ctcagagcca ccacccttct cttctcgttt gctcttctct ttggtattgt ctaagagaag 60
ag 62
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 54
ccgccagcca ttgcaaacca gacaatacca aagag 35
<210> 55
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 55
ccctcagaac cgccacttct cttctcgttt gctcttctct ttggtattgt ctaagagaag 60
ag 62
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<211> 35
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ggaaatacct acatttacca gacaatacca aagag 35
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ag 62
<210> 58
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 58
gaaatggatt atttacacca gacaatacca aagag 35
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