异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物在制备治疗脓毒症疾病药物中的应用
阅读说明：本技术 异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物在制备治疗脓毒症疾病药物中的应用 (Application of isovaleryl spiramycin compound or composition thereof in preparation of medicines for treating sepsis diseases ) 是由 姜恩鸿 夏明钰 王恒 赵小峰 于 2021-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物在制备治疗脓毒症疾病药物中的应用,异戊酰螺旋霉素类化合物选自异戊酰螺旋霉素Ⅰ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅱ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅲ或其衍生物；异戊酰螺旋霉素类组合物选自异戊酰螺旋霉素Ⅰ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅱ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅲ或其衍生物中至少两种的组合,或者可利霉素。异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物在治疗脓毒症方面具有良好的治疗效果,具有重要的社会效益和经济效益。(The invention discloses an application of isovaleryl spiramycin compounds or compositions thereof in preparing medicaments for treating sepsis diseases, wherein the isovaleryl spiramycin compounds are selected from isovaleryl spiramycin I or derivatives thereof, isovaleryl spiramycin II or derivatives thereof, and isovaleryl spiramycin III or derivatives thereof; the isovaleryl spiramycin composition is selected from at least two of isovaleryl spiramycin I or derivatives thereof, isovaleryl spiramycin II or derivatives thereof, isovaleryl spiramycin III or derivatives thereof, or colimycin. The isovaleryl spiramycin compound or the composition thereof has good treatment effect on the aspect of treating sepsis and has important social and economic benefits.)
技术领域
本发明属于医药化学领域，具体地说，具体地说，涉及异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物在制备治疗脓毒症疾病药物中的应用。
背景技术
脓毒症及其引发的多器官功能障碍综合征是目前临床危重患者最常见的死亡原因之一，脓毒症患者病死率在20％以上，而病情进展至脓毒症休克期后，患者病死率可升至40％～70％，因此，脓毒症的治疗一直是重症监护病房面临的严峻挑战。脓毒症作为临床急危重症患者的严重并发症之一-,可诱发脓毒性休克及MODS，常由感染、严重创伤、烧伤、大手术等因素所诱发。脓毒症是炎症激活和免疫抑制共同存在的病理过程，其发展阶段为全身炎症反应综合征一脓毒症-脓毒症休克一多器官功能衰竭，患者住院时间长、预后差、死亡率高。
脓毒症患者常有凝血功能的异常，且凝血功能的异常程度与疾病的严重程度相关，凝血功能的紊乱直接影响器官缺血性改变，也是导致患者发生MODS的重要原因。在脓毒症患者中炎症反应与凝血反应相互促进，血浆纤维蛋白原(Fg)被激活转化成纤维蛋白，Fg多表现为降低，普通的感染性疾病Fg的变化常小幅升高或不变[1]。研究表明血小板计数(PLT)、凝血酶原时间(PT)、凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(Fg) 经过血液净化技术治疗后，凝血功能及肾功能等全部指标均较各组治疗前显著降低。
重症脓毒症是各种感染引起全身炎症反应的急危重症，常易并发急性凝血功能障碍和急性肾衰竭，导致治疗难度大大增加，患者面临生命威胁，因此重症脓毒症具有极高的死亡率。脓毒症的病理生理学原因是病原体入血，导致血管内炎性细胞大量繁殖激活，分泌炎症介质，大量免疫活性因子的产生，还能破坏血管内皮细胞，启动内源性凝血途径，导致弥漫性血管内凝血、凝血-抗凝系统平衡紊乱，但凝血相关因子又可以进-步促进炎性细胞进一步分泌炎性因子，导致如此循环往复，病情迅速恶化。
可利霉素(Carrimycin)，又称必特螺旋霉素(Bitespiramycin)、生技霉素(Shengjimycin)是由中国医科院生物技术研究所与本申请人合作，通过转基因技术将碳霉素产生菌的4″异戊酰基转移酶基因 (4〞-O-isovaleryltransferase gene)克隆至螺旋霉素产生菌(Streptomyces spiramyceticus)中，定向酰化螺旋霉素4″-OH，在4″位加入异戊酰基侧链所形成的以4″位异戊酰基螺旋霉素为主要组分的新型抗生素。
可利霉素主成分的结构示意如式(1)所示，不代表构象：
其中，当R＝H，R′＝COCH2CH(CH3)2时为异戊酰螺旋霉素Ⅰ；当R＝COCH3，R′＝COCH2CH(CH3)2时为异戊酰螺旋霉素Ⅱ；当R＝COCH2CH3，R′＝COCH2CH(CH3)2时为异戊酰螺旋霉素Ⅲ。
可利霉素中主要活性成分异戊酰螺旋霉素(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)总含量不低于60％，酰化螺旋霉素的总含量不低于80％，于药学上是一种可接受的药物组合物。中心结构为16元内酯环，与一分子福洛胺糖、一分子碳霉胺糖和一分子碳霉糖连接而成，其主要成分异戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ与螺旋霉素结构不同之处在于碳霉糖4″位上连接的基团为异戊酰基而不是羟基。化学结构，如式(1)所示，共包含十余种组分。目前可利霉素成品组成标准为药物中异戊酰螺旋霉素Ⅲ≥30％，异戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的比例总和≥60％，总酰化螺旋霉素的比例≥80％，其它未知组分的总和≤5％。
初步体内外药效学试验表明，该药不仅对多数G+菌有较好抗菌活性，对部分G-菌也有一定作用，各项技术指标明显优于阿奇霉素、红霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素，尤其对肺炎支原体的抗菌活性最强，对红霉素耐药菌、淋球菌、肺炎球菌、金葡菌、绿脓假单胞菌、流感杆菌、流感嗜血杆菌、脆弱拟杆菌、军团菌、多行杆菌和产气荚膜梭菌也有一定抗菌活性，对临床耐红霉素的金葡球菌仅有极少交叉耐药性。可利霉素将主要用于治疗革兰氏阳性菌感染性疾病，尤其是上呼吸道感染，并可能用于泌尿系统感染等。迄今为止，未见有可利霉素治疗脓毒症疾病的记载和报道。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物在制备治疗脓毒症疾病药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
本发明的第一目的是提供异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物在制备治疗脓毒症疾病药物中的应用。
进一步的方案，脓毒症疾病包括全身炎症反应、脓毒症、严重脓毒症、脓毒性休克、由感染应急性损害引起的脏器功能障碍或器官衰竭。
进一步的方案，所述的脓毒症疾病由冠状病毒病诱导产生。
进一步的方案，所述的脓毒症疾病由SARS-COV-2病毒诱导产生，也就是说包括病毒性脓毒症，尤其是COVID-19相关的脓毒症。
进一步的方案，所述异戊酰螺旋霉素类化合物选自异戊酰螺旋霉素Ⅰ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅱ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅲ或其衍生物。
进一步的方案，所述异戊酰螺旋霉素类组合物选自异戊酰螺旋霉素Ⅰ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅱ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅲ或其衍生物中至少两种的组合，或者可利霉素；
进一步的方案，所述异戊酰螺旋霉素类组合物还包括医学上可接受的载体。
进一步的方案，所述药物的用药剂量为10-1500mg/kg，优选50-1000mg/kg，更优选100-500mg/kg。
目前关于脓毒症公认的主要的发病机制包括:
1)炎症反应平衡失调
其中，包括早期促炎细胞因子与炎症的发生、发展紧密相关。其中包括肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-a、白细胞介素(IL)-1、IL-6、干扰素(interferon,IFN)-γ等。其中TNF-a是炎症早期最主要的促炎细胞因子，在免疫防御反应中发挥重要作用，也是内毒素损伤效应的关键介质。IL-1在脓毒症中的作用与TNF-c.有许多相似之处，其通过IL-1β表达并与TNF-a共同启动炎症反应。IL-6是在IL-1作用下产生的炎症介质，可以与TNF-a共同促进T淋巴细胞增殖。血浆中IL-6水平可作为脓毒症严重程度的预测指标。大量研究证实，脓毒症中促炎细胞因子的合成与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路密切相关，通过激活下游多种转录因子及蛋白分子而发挥作用。
晚期细胞因子高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1protein,HMGB1)作为重要的晚期炎症介质之一，能够与转录因子、核小体及组蛋白互相作用，参与转录调控、DNA复制、细胞分化等细胞生命活动。HMGB1可以与TLR4结合，激活核因子(NF)-KB和MAPK等多条信号转导通路，进一步促进细胞产生TNF-a、IL-1、IL-6等介质，加剧组织炎症损伤。
2)免疫功能紊乱
机体在脓毒症初期分泌大量炎性介质，随后在病程发展过程中经历了一个免疫抑制阶段，主要表现为 T淋巴细胞克隆无反应性、免疫抑制性细胞(如Treg)的负向调节作用等。
3)凝血功能障碍
凝血功能障碍与炎症之间相互影响，成为脓毒症发生发展及预后的关键环节。其过程包括凝血系统的激活、生理抗凝机制受抑和纤溶途径的抑制。
异戊酰螺旋霉素Ⅰ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅱ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅲ或其衍生物，或者可利霉素可通过抑制PI3K/AKT/m-TOR信号通路，使m-TORC1水平降低，从而抑制其细胞核内炎症因子 NF-KB的蛋白质合成，同时IL-4、IL-6、TNF-a等炎症炎症因子也明显下降，达到抗炎的作用。随着病程延长，脓毒症患者会出现免疫抑制反应，包括巨噬细胞失活，抗原呈递减少，淋巴细胞增殖活性受到抑制，导致释放大量抗炎细胞因子。可利霉素对免疫细胞影响检测显示，可利霉素在小鼠体内能够显著促进总T细胞(CD3阳性细胞)增加，其中CD4和CD8阳性细胞都增加。这表明异戊酰螺旋霉素类化合物和组合物，尤其是可利霉素抗感染、抗炎、调节免疫的作用已经进一步得到临床验证，可为脓毒血症患者带来益处。
本发明的第二目的是一种治疗脓毒症疾病的组合产品，包括异戊酰螺旋霉素Ⅰ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅱ或其衍生物、异戊酰螺旋霉素Ⅲ或其衍生物中的至少一种，或者可利霉素作为第一药物活性成分，还包括第二药物活性成分，所述的第二药物活性成分选自用于治疗脓毒症的相关药物；
优选的，第一药物活性成分和第二药物活性成分为单独制剂，或者是复配为一种制剂。
其中，第二药物活性成分包括但不限于抗生素、他汀类药物、类脂A拮抗剂、重组人杀菌蛋白、重组人乳铁蛋白、超抗原拮抗药、皮质类固醇、重组人活化蛋白C等。
采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
异戊酰螺旋霉素类化合物或其组合物在治疗脓毒症方面具有良好的治疗效果，具有重要的社会效益和经济效益。
下面结合附图对本发明的
具体实施方式
作进一步详细的描述。
附图说明
附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：
图1是ISP I及LPS对BV2细胞活力的影响结果；其中A为ISP I对BV2细胞活力的作用结果，B为 LPS对BV2细胞活力的作用结果；
图2是ISP I及LPS对BV2细胞中NO产生量的影响。
图3是ISP I及LPS对BV2细胞中IL-6的影响结果。
图4是可利霉素对巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的评估结果，A为对照组，B为可利霉素组，C为伊曲康唑组；
图5为第一批C57BL/6鼠连续灌胃三天，50mg/kg，构建腹腔炎症模型，腹腔中性粒细胞(Gr-1和CD11b 双阳细胞)检测结果；
图6为第一批C57BL/6鼠连续灌胃七天，50mg/kg，构建腹腔炎症模型，腹腔中性粒细胞(Gr-1和CD11b 双阳细胞)检测结果；
图7为第二批C57BL/6鼠连续灌胃三天，50mg/kg，构建腹腔炎症模型，腹腔中性粒细胞(Gr-1和CD11b 双阳细胞)检测结果；
图8为第二批C57BL/6鼠连续灌胃三天，50mg/kg，构建腹腔炎症模型，外周血中CD4+和CD8+细胞比例的检测结果；
图9是图8中外周血中CD4+/CD3+和CD8+/CD3+细胞比例的柱状图；
图10为第二批C57BL/6鼠连续灌胃三天，50mg/kg，构建腹腔炎症模型，外周血中CD3+细胞比例的检测结果；
图11是图10中外周血中CD3+细胞比例的柱状图；
图12中，A为RAW细胞先加药物作用1h，再诱导其往M1型分化，检测TNF-α的水平；B是RAW 细胞先加药物作用1h，再诱导其往M1型分化，检测iNOS的水平；C是RAW细胞先加药物作用1h，再诱导其往M2型分化，检测Arg-1的水平；
图13中，A为先加细胞因子诱导RAW细胞分化为M1型巨噬细胞，再加相应地药物，检测TNF-α的表达；B为先加细胞因子诱导RAW细胞分化为M1型巨噬细胞，再加相应地药物，检测iNOS的表达； C为先加细胞因子诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞，再加相应地药物，检测Arg-1的表达；
图14中，A为先加细胞因子诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞，再加相应地药物，检测TNF-α的表达；B为先加细胞因子诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞，再加相应地药物，检测iNOS的表达； C为先加细胞因子诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞，再加相应地药物，检测Arg-1的表达；
图15为炎症细胞因子IL-β历时性变化曲线(FAS)(均数折线图±SE芒刺)；
图16为炎症细胞因子IL-4历时性变化曲线(FAS)(均数折线图±SE芒刺)；
图17为炎症细胞因子IL-β历时性变化曲线(PPS)(均数折线图±SE芒刺)；
图18为炎症细胞因子IL-4历时性变化曲线(PPS)(均数折线图±SE芒刺)。
需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1、异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III或可利霉素片
规格：200mg/350mg
片芯处方：
包衣液处方：
制备工艺：
片芯的制备：主药和辅料分别过100目筛，将处方量异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III、微晶纤维素与1/2处方量的羧甲淀粉钠混合均匀，然后加入5％聚维酮K30水溶液制软材，以18目筛制粒，湿颗粒在60℃通风条件下干燥2h；干燥后以18目筛整粒，再加入1/2处方量的处方量羧甲淀粉钠与硬脂酸镁混合均匀后，用直径11mm的浅凹冲模压片，制得片重350mg、硬度6.5kg的含药片芯。
包衣液的配制：称好所需的欧巴代II(白色)在配液容器中加入所需量的水，分次加入，待全部加入后，降低搅拌速度，使蜗旋消失，继续搅拌30min，即得。
薄膜包衣片的制备：将片芯置包衣锅内，确定包衣条件，主机速度为20r/min，进风温度40℃，出风温度30℃，喷雾压力0.02Mpa，喷浆流量为1ml/min进行包衣，恒定后持续喷包1.5h，至片粒表面光滑、色泽均匀，符合薄膜衣检验标准为合格。包衣增重5％左右。
实施例2、异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III素片(按10000片计算)
处方：
异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III原粉1000g
低取代羟丙基纤维素(5％)92.5g
羧甲基淀粉钠(3％)55.5g
硬脂酸镁(1％)18.5g
淀粉总重-其它原辅料重量
总重1850g
制备工艺：称取适量淀粉，稀释至15％浓度，加热至糊状，制成粘合剂；主料异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III、辅料淀粉、低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁分别过100目筛，按处方量，称取所需主料和辅料；异戊酰螺旋霉素I、淀粉、低取代羟丙基纤维素充分混合均匀后，用15％淀粉浓度的淀粉糊制成软材，14目筛制粒，50-60℃干燥，水份控制在3-5％，14目筛整粒，加羧甲基淀粉钠，硬脂酸镁混合，测定颗粒含量；根据颗粒含量，计算片重，压片(Φ9mm浅凹冲头)，检测片重差异；经检验合格后进行包装。
实施例3、异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III胶囊剂(按10000粒计算)
处方：
异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III原粉1000g
淀粉1080-异戊酰螺旋霉素I原粉重量
药用3号胶囊1000粒
液体石蜡50ml
制备工艺：将主料异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III、辅料药用淀粉按工艺配方量分别称取后，装入混合器充分混合后1.5-2小时；取样检测含量所得数据应和理论数据基本一致(每粒胶囊所装重量约为0.105g)，将经检验合格的药用3号胶囊及混合好的待装原料按全自动胶囊机操作要求，分别填入装料器进行填充，将填充好的胶囊进行差异检验(±10％以内，＜0.3g)，溶出度符合要求，将检验后符合要求的胶囊，放入打光机内加入液体石蜡进行15-20分钟的打光，然后取出进行成品包装盒检验。
实施例4、异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III干糖浆(按10000袋计算)
处方：
异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III原粉1250g
柠檬酸(0.5％)15g
蔗糖总重-其它原辅料
总重约5000g
色素(姜黄素)约1g
制备工艺：异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III原粉，柠檬酸、蔗糖分别用高速气流粉碎机粉碎成颗粒85％通过300目，15％通过180目，然后将粉碎后的细粉按处方量称取后充分混合1-1.5小时，测其含量，计算装量(理论装量为每袋500mg)，然后将混合物装入袋装机中，装好铝箔纸，按分装机操作要求分装，装量差异在±5％以内，装好后进行检验合格后外包装。
实施例5、异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III颗粒剂(按10000袋计算)
处方：
异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III原粉1250g
糖粉20000g
糊精9000g
5％PVP-K30适量
制备工艺：异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III原粉、糖粉、糊精过120目筛，按处方量称取异戊酰螺旋霉素I、糖粉、糊精混合均匀，将混合均匀的上述物料用5％PVP-K30胶浆制成软材，摇摆式颗粒剂制粒70℃干燥、整粒，送检合格后分装。
实施例6、异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III冻干粉针剂
称取异戊酰螺旋霉素I或异戊酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III原粉500mg与等摩尔的己二酸混合均匀后溶解于5ml水中，得到淡黄色澄明溶液，pH在4.6-5.6之间。再加入甘露醇40mg作为冻干支撑剂，低温快速冷冻9h后，冷冻干燥，获得淡黄色疏松块状物，使用前用10ml无菌水溶解。
实施例7、可利霉素冻干粉针剂
称取可利霉素500mg，与等摩尔的己二酸混合均匀后溶解于5ml水中，得到淡黄色澄明溶液，pH在 4.6-5.6之间。再加入甘露醇40mg作为冻干支撑剂，低温快速冷冻9h后，冷冻干燥，获得淡黄色疏松块状物，使用前用10ml无菌水溶解。
试验例一
一、可利霉素抗炎作用
1、ELISA检测可利霉素对小鼠多种组织器官中炎症因子的作用
实验用昆明小鼠购于江苏大学实验动物中心，小鼠IL-1βELISA试剂盒(赛默飞(88-7013-88))，小鼠IL-4ELISA试剂盒(赛默飞(88-7044-88))，其他实验仪器及试剂均为现有的常规仪器和试剂。
小鼠分组以及给药
可利霉素：溶解方法，可利霉素若干加入0.48ml聚乙二醇400，再加入2.4μl的吐温80，振荡混匀，然后加入蒸馏水1.92ml(每次加入200μl振荡混匀即可)，分别配制为1.44mg/ml、2.88mg/ml、5.76mg/ml 浓度。
阿奇霉素：先用少量无水乙醇溶解，然后加水使无水乙醇含量为10％，配制为1.82mg/ml浓度。
昆明小鼠，雄性，18-20g大小，144只，在实验室适应性喂养后，小鼠体重约24g，随机分为6个组：正常组，模型组，可低组(30mg/kg)，可中组(60mg/kg),可高组(120mg/kg)，阿奇霉素(37.9mg/kg) 组。每个组分为8个时间点：0h，0.5h，2.5h，4.5h，12h，24h，48h和72h。每个时间点3只小鼠。正常组小鼠不给药也不注射细菌，模型组注射细菌不给药，可利霉素以及阿奇霉素均灌胃给药(500μl)，首日剂量翻倍，后续每天正常给药，模型组给相同体积的溶剂。给药后在不同的时间点分批处死小鼠。
模型建立：金葡菌的浓度测定见体外实验报告，测好浓度后，用生理盐水重悬，使得浓度为3× 108CFU/ml，尾静脉注射，按照24g/100μl注射。注射一个小时后开始给药。
样品的制备
小鼠眼球取血后处死，取各个组织器官，用电子天平称量，每种组织称取50mg后加入1.5ml的EP管中，随后加入1ml的预冷PBS，加入磁珠后匀浆机匀浆(300Hz，30s)。冰上静置30分钟后，然后用离心机在4℃离心(10000g，10min)，取上清液作为检测样品。
实验方法实验方法严格按照ELISA试剂盒说明书来进行，简叙如下：
试剂准备：PH7.35的PBS，吐温20，配制含0.05％吐温20的PBS溶液作为洗涤液。(如果在缓冲液浓缩物中形成晶体，则将其轻轻加热直至完全溶解)。1.涂层缓冲液(1X)：将PBS(10倍)在去离子水中稀释1:10。2.捕获抗体：在包衣缓冲液(1x)中稀释捕获抗体(250x)1:250。3.5xELISA/ELISPOT稀释液：在去离子水中稀释浓缩稀释液(5x)1:5。4.标准品：重组小鼠il-1β标准品，用蒸馏水溶解，加入蒸馏水的体积在标准品小瓶的标签上注明。标准溶液提前10-30分钟配制，充分混合以确保完全均匀溶解(重组标准品的浓度＝1000pg/ml)。标准品在新鲜配制，立即使用，不储存。5.检测抗体：在ELISA/ELISPOT 稀释液(1x)中稀释检测抗体(250x)1:250。6.酶：在ELISA/ELISPOT稀释液(1x)中稀释HRP浓缩液 (100x)1:100。
实验步骤：1.在包被缓冲液中按每孔100μL的捕获抗体l量包被CorningTMCostarTM9018ELISA板(按试剂制备第1点所述进行稀释)。密封ELISA板，并在4℃下孵育过夜。2.去掉孔里面的溶液，并用大于 250微升缓冲液冲洗3次，在每个冲洗步骤中留出浸泡时间(1分钟)，以提高冲洗效果，用吸水纸擦干，去掉残留液。3.每孔加200微升ELISA/ELISPOT稀释液(1X)，室温孵育1小时。4.提前30分钟准备标准品。5.用洗涤液至少抽吸和洗涤一次。6.加入100ul标准品，样品，空白孔加入ELISA/ELISPOT稀释液 (1X)。7.封板室温孵育2小时。8.准备检测抗体。9.按照步骤2吸气和清洗，重复洗3-5次。10.向所有孔中加入100微升/孔稀释的检测抗体。11.封板，室温孵育1小时。12.准备HRP。13.按照步骤2吸气和清洗，重复洗3-5次。14.每孔加入100ul稀释好的HRP。15.封板室温孵育30分钟。16.按照步骤2进行抽吸和清洗，确保在抽吸前留出浸泡1到2分钟的时间，重复5-7次清洗。17.每孔加入100ul的TMB溶液。 18.室温下孵育15分钟。19.每孔加50μL终止液。20.在450nm处读板。21.数据收集以及处理。
试验结果：可利霉素对小鼠多种组织器官中IL-4因子、IL-1β的作用结果分别如表1和表2所示。
表1
表2
注：*，P＜0.05；**，P＜0.01；***,P＜0.001；****,P＜0.0001.
实验结论：可利霉素具有抗炎作用，可利霉素在肺、肾脏、肝脏和脾脏中均有显著降低IL4因子的作用，在肝脏和脾脏中作用更为显著；可利霉素在小肠、肺、脾脏、肝脏和肾脏均有显著降低IL-1β因子的作用，在小肠和肺中作用尤为显著。
2、考察可利霉素主要活性成分异戊酰螺旋霉素I(ISP I)对IL-6产生的影响。
试验材料与试剂：
细胞株：小鼠小胶质细胞BV2细胞购自国家实验细胞资源共享平台(北京)
异戊酰螺旋霉素I(沈阳同联集团有限公司)，脂多糖(LPS055：B5L6529)、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、二甲基亚砜(DMSO)、甲基噻唑蓝(MTT)均购自SigmaChemical(St.Louis，MO，USA)， DMEM培养基购自GibcoChemical(GrandIsland，NY，USA)，特级胎牛血清购自南美Lonsera，NO检测试剂盒(碧云天生物技术公司)，ELISA检测试剂盒(上海爱必信生物科技公司)。
本试验例所用仪器均可以采用现有技术中的常规仪器。
试验方法
细胞培养
BV2细胞使用含10％FBS的DMEM培养基，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养。当细胞培养至密度为90％左右，可进行传代及后续实验。
细胞生长抑制率测定
采用MTT法检测ISP I对BV2细胞活性的影响。MTT(四甲基偶氮唑盐)是一种能接受氢离子的黄色染料。MTT法检测细胞活性的原理的为：活细胞线粒体中存在琥珀酸脱氢酶和细胞色素c，在这两种酶的催化下MTT的四氮唑环裂开，生成蓝紫色的formazan结晶，DMSO或三联液可以溶解该结晶，在492nm/630nm 波长处检测吸光值，可以以此检测细胞的活性。
将BV2细胞接种于96孔板中，密度为1.6×105cell/ml，100μl/孔，每组设置六个复孔，正常培养24 小时后加药。除阴性对照组外，加入不同浓度的ISP I，继续培养至规定时间。吸弃培养液，加入无菌的 PBS洗涤一次，吸弃PBS，每孔加入100μl配制好的MTT，继续培养4h。向其中加入100μl三联液继续培养12h，使用微量振荡器振荡3-5min，使用酶标仪与630nm处测定星光值(A)，按如下公式计算ISP I 对BV2细胞的抑制率。
Inhibitoryratio(％)＝(A630，control-A630，control)/(A630，control-A630，blank)×100
Griess法检测NO含量
BV2细胞以1×105/孔接种于24孔板，采用含10％FBS的DMEM培养液培养，继续培养24h，细胞换成无血清的培养液继续培养6h。先向相应孔中加入250μl终浓度为20μM、10μM、5μM的ISP I进行预处理，1小时后，向相应孔加入终浓度为10μg/ml的LPS进行诱导处理。放置5％CO2，37℃培养箱分别培养24h后，取上清-20℃保存用于NO的检测。
NO的测定按照说明书进行，在540nm处测定吸光值，利用标准曲线来计算相对应的NO的含量。
ELISA试剂盒检测细胞炎症因子
1)准备好所有需要的试剂和标准品；2)从恢复至室温的密封袋中取出微孔板，未用的板条放回铝箔袋内，重新封口；3)分别将不同浓度标准品，实验样本或者质控品加入相应孔中，每孔100μL。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2h。4)将板内液体吸去，使用洗瓶洗板。每孔加洗涤液400μL，然后将板内洗涤液吸去。重复操作3次。每次洗板尽量吸去残留液体会有助于得到好的实验结果。最后一次洗板结束，请将板内所有液体吸干或将板倒置，在吸水纸拍干所有残留液体；5)在每个微孔内加入100μL检测抗体。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时；6)重复第4步洗板操作；7)在每个微孔内加入100μL稀释好的链霉亲和素-HRP，室温孵育20分钟。注意避光；8)重复第4步洗板操作；9)在每个微孔内加入100μL显色底物，室温孵育20分钟。注意避光；10)在每个微孔内加入50μL终止液，孔内溶液颜色会从蓝色变为黄色。如果溶液颜色变为绿色或者颜色变化不一致，请轻拍微孔板，使溶液混合均匀；11)加入终止液后 30分钟内，使用酶标仪测量450nm的吸光度值，设定540nm作为校正波长。12)计算结果：将每个标准品和样品的校正吸光度值(OD450-OD540)、复孔读数取平均值，然后减去平均零标准品OD值。可以通过绘制标准品浓度做对数与相应OD值对数生成曲线，并通过回归分析确定最佳拟合线。
统计学处理
应用统计软件SPSS26.0进行数据分析，Excel2016进行数据汇总和GraphPad绘制图表，计量资料以均数±标准差(mean±SD)形式表示，组间数据比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
试验结果
ISP I及LPS对BV2细胞活力的影响
不同浓度ISP I处理BV2细胞24h后，MTT检测结果显示：与未处理组比较，2.5μM、5μM和10 μM组细胞活力均无明显差异；不同浓度LPS处理BV2细胞24h后，MTT检测结果显示：与未处理组比较，0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml组细胞活力均无明显差异。如图1所示(A为ISP I对 BV2细胞活性的影响，B为LPS对BV2细胞活性的影响，)
ISP I抑制LPS诱导的NO的产生
检测不同浓度LPS作用于细胞时细胞上清液中NO的水平，结果表明0.01～10μg/ml的LPS均可诱导NO生成。检测ISP I对细胞上清液中NO产生量的影响，结果表明ISP I能够浓度依赖性抑制LPS诱导的NO的产生。如图2所示，A中，当LPS浓度为0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml时，与对照组相比，NO释放量随浓度增加而增加。*p＜0.05，***p＜0.001vs0组。B中，当ISP I的浓度为2.5μM 时，5μM和10μM，在ISP I中生成的NO浓度降低浓度依赖性的方式，表明ISP I可以减少由LPS诱导的NO的量。#p＜0.05，##p＜0.01vsLPS组，***p＜0.001vs空白组。
ISP I抑制LPS诱导的IL-6的产生
检测不同浓度LPS作用于细胞时细胞上清液中IL-6的水平，结果表明0.01～10μg/ml的LPS均可诱导IL-6生成。ELISA法检测ISP I对细胞上清液中IL-6产生量的影响，结果表明5μM及10μMISP I可明显抑制LPS诱导的IL-6的产生。如图3所示，A中，LPS的浓度分别为0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml 和10μg/ml，细胞产生的IL-6的数量增加。*p＜0.05，**p＜0.01vs.0μg/ml组。B中，当ISP I的浓度为 2.5μM，5μM和10μM时，IL-6的浓度以ISP I浓度依赖性的方式降低，表明ISP I可以减少LPS诱导的IL-6。*LPS组*p＜0.05，***p＜0.001。
结论：可利霉素主要活性成分异戊酰螺旋霉素I(ISP I)可抑制LSP诱导的炎性细胞因子IL-6及NO 的产生。
二、可利霉素免疫调节作用
可利霉素在一定程度上增强巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力。可利霉素对免疫细胞影响检测显示：可利霉素在小鼠体内能够显著促进总T细胞(CD3阳性细胞)增加，其中CD4和CD8阳性细胞都增加。可利霉素对分化巨噬细胞的转分化研究显示：可利霉素可以显著提高TNF-a和iNos在M2型巨噬细胞中的表达水平，并且显著强于LPS+INF-诱导的TNF-a和iNos表达水平，更优于伊曲康唑，并能显著抑制Arg-1在 M2型巨噬细胞中的表达水平。
1、可利霉素对巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的评估
目的：检测可利霉素是否有增强正常小鼠巨噬细胞功能，主要检测指标是巨噬细胞吞噬的作用。鉴于可利霉素在免疫学研究方面没有对标试剂，根据报道，伊曲康唑具有促进巨噬细胞极化以及增强巨噬细胞吞噬的作用，因此实验中选用伊曲康唑作为阳性对照。
试剂：生理盐水，6％鸡红细胞，甲醇，丙酮，Giemsa染液等；耗材：1ml注射器，普通载玻片，纱布，培养皿等。
实验小鼠：品系:Balb/c，周龄:8-12，来源：成都达硕实验动物有限公司，数量：每组各2只小鼠。
实验步骤：(1)分组给药：a)生理盐水组：与实验组相同体积，p.o.；b)可利霉素组：50mg/kg，p.o.；c) 伊曲康唑组：50mg/kg，p.o.；连续给药五天；(2)每只小鼠注射1ml鸡红细胞，等待30min后处死小鼠。(3) 腹腔注射1ml生理盐水，按摩使其分布均匀，使小鼠俯卧5min。(4)剪开小鼠腹腔，用1ml的注射器去掉针头，吸出腹腔清洗液，滴于载玻片上，每个载玻片上滴两滴，尽量保证等体积。(5)放入垫有湿纱布的培养皿中，移至37°孵箱温育30min。(6)孵毕，于生理盐水中漂洗，去除未贴壁的细胞(生理盐水提前预热)，晾干。(7)以1:1丙酮甲醛溶液固定(提前放-20°预冷)。(8)吉姆萨染色，先A液染色作用45s，再加B 液4min，轻轻吹动染色成涟漪状，让二者混匀，再用蒸馏水冲洗晾干。(9)显微镜随机取视野，拍照计数，计算吞噬百分率(10)吞噬百分率计算公式正在吞噬的巨噬细胞数/巨噬细胞总数×100％
结果与分析：
小鼠腹水细胞经伊曲康唑或可利霉素刺激后，有吞噬能力的巨噬细胞吞噬鸡红细胞(有巨核细胞)或周边聚集较多的鸡红细胞。如图4所示，A为对照组，B为可利霉素组，C为伊曲康唑组。
与安慰剂组(NC)比较，可利霉素组(Keli)和伊曲康唑组(Yiqu)在对巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力上都有一定程度的增强；但是可利霉素组和伊曲康唑组间未见有统计学意义的差异。
整体而言，各组件差异不明显。该实验因有实验操作人员不可避免的主观介入，对微小差异不宜用出定量判断；因此改用巨噬细胞对荧光微球吞噬试验，采用流式的方法来进行检测，以减少人为主观因素参与。
2、可利霉素对中性粒细胞功能影响检测
实验目的：检测可利霉素是否可增强小鼠中性粒细胞的炎性趋化迁移能力，主要是通过构建小鼠腹腔炎症模型，流式检测腹腔中性粒细胞比例，检测指标为CD11b和Gr-1。本实验以伊曲康唑作为阳性对照。
试剂：无菌PBS，fMLP,无菌HBSS，Gr-1-APC流式抗体，CD11b-FITC流式抗体等；耗材：吸管，皮筋，剪刀，镊子，1ml注射器，15ml离心管，流式管等。
实验小鼠：品系：C57BL/6小鼠，周龄：8-12，来源：成都达硕实验动物有限公司，数量：第一批给药三天每组各3只鼠，给药7天每组各4只鼠。第二批重复实验给药三天每组各7只鼠。
实验步骤：
(1)分组给药：d)生理盐水组：与实验组相同体积，p.o.；e)可利霉素组：50mg/kg，p.o.；f)伊曲康唑组：50mg/kg，p.o.；连续给药三天、七天；(2)配制fMLP:配制100nMfMLP，PBS稀释，现配现用，配制后置于冰上。(3)腹腔注射：每只小鼠腹腔注射100uL100nM预冷的fMLP。(4)收腹水细胞：注射4 小时后，将小鼠处死，四肢固定，剪开腹部皮肤，剖开腹膜一个小口，用橡皮筋与回形针固定腹膜，用吸管吸取预冷的HBSS反复冲洗腹腔，动作轻柔，收集腹水大约8～10ml，将其置于冰上。(5)1000rpm离心5min,小心弃上清。(6)若有红细胞，用1ml红细胞裂解液重悬，冰上裂解3-5min。(7)1000rpm离心5min，弃上清，再加3mlPBS洗一次。(8)加500uLPBS重悬。(9)取10^6个细胞，室温避光孵育流式抗体：CD11b-FITC和Gr-1-APC。(10)PBS洗细胞一次，重悬，置于冰上，避光，上机检测。
实验结果：可利霉素对小鼠腹腔炎症模型中性粒细胞迁移能力评估结果如图5-7所示。图5-7为不同给药时间、不同批次小鼠腹腔炎症模型，流式检测中性粒细胞(Gr-1和CD11b双阳细胞)比例。图5为第一批C57BL/6鼠连续灌胃三天，50mg/kg，构建腹腔炎症模型，腹腔中性粒细胞(Gr-1和CD11b双阳细胞)检测结果；图6为第一批C57BL/6鼠连续灌胃七天，50mg/kg，构建腹腔炎症模型，腹腔中性粒细胞 (Gr-1和CD11b双阳细胞)检测结果；图7为第二批C57BL/6鼠连续灌胃三天，50mg/kg，构建腹腔炎症模型，腹腔中性粒细胞(Gr-1和CD11b双阳细胞)检测结果。
图8-11为给药三天后构建小鼠腹腔炎症模型后外周血中T淋巴细胞检测，采用流式细胞术检测CD3+、 CD4+和CD8+细胞比例。
可利霉素和伊曲康唑在小鼠体内能够显著促进中性粒细胞向炎症部位迁移，在个别小鼠体内的结果尤其明显；三天同七天的结果比较，没有发现连续用药七日能够使效果进一步加强。可利霉素和伊曲康唑在小鼠体内能够显著促进总T细胞(CD3阳性细胞)增加，其中CD4和CD8阳性细胞都增加，但是伊曲康唑表现更好。
3、可利霉素对巨噬细胞分化的影响
实验背景及目的：巨噬细胞可分为两大类：经典活化的巨噬细胞(Classicallyactivatedmacrophage，M1)，其特点是主要组织相容性复合体MHCⅡ类表达增加，一氧化氮(Nitricoxide,NO)增多，活性氧和促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor,TNF)、白细胞介素-1(IL-1)和白细胞介素-6(IL-6)等升高。另一类是替代性活化的巨噬细胞(Alternativelyactivatedmacrophage，M2)，也称选择性活化的巨噬细胞，是一类具有免疫抑制活性的巨噬细胞，在多种刺激下，白细胞介素-4(IL-4)水平升高，白细胞介素-10(IL-10)和精氨酸酶(Arginase，Arg)的表达增加，导致细胞增殖和胶原生成增强。在遇到感染和癌症时，M1细胞的极化对人类健康有保护效应。因此，本实验的目的是检测可利霉素是否影响巨噬细胞分化，进而探讨可利霉素的潜在免疫调节作用。
实验试剂耗材：试剂：RAW246.7细胞系，1640培养基，FBS，RNA提取试剂盒，反转录试剂盒，SYBR 荧光定量试剂盒。细胞因子：IL-4，INF-γ，LPS；耗材：细胞培养相关耗材。
实验步骤：
方案一：探讨药物是否会促进或抑制RAW246.7细胞的极化过程。
(1)可利霉素和伊曲康唑用DMSO配成10mM浓度母液储存。(2)体外培养RAW246.7细胞系，收集对数期生长的细胞按每孔1×10^6个细胞的密度铺6孔板，细胞分别做不加药，加可利霉素20uM，伊曲康唑20uM三种处理。(3)作用1h后，每种处理再分为2组，一组加入LPS(200ng/ml)和IFN-γ(20ng/ml)，另外一组加入IL-4(20ng/ml)，培养12h后收细胞。(4)提取细胞总RNA，反转录成为cDNA，检测相应指标的RNA水平。
方案二：探讨药物对已经极化的细胞是否有作用。
(1)可利霉素和伊曲康唑用DMSO配成10mM浓度母液储存。(2)体外培养RAW246.7细胞系，采用同样的方法铺板，将细胞分别加入对应的细胞因子(LPS+IFN-γ或者IL-4)作用12h。(3)12h后，向已经极化为M1型或M2型的细胞加入可利霉素(20uM)或者伊曲康唑(20uM)，再次作用12h。(4)收细胞，提取细胞总RNA，反转录成为cDNA，检测相应指标的RNA水平。
实验结果：
方案一：探讨可利霉素是否会促进或抑制RAW246.7细胞的分化
图12A是RAW细胞先加药物作用1h，再诱导其往M1型分化，检测TNF-α的水平。图注：NC(RAW 细胞，不做任何处理)；PC1(RAW细胞加LPS+INF-γ，诱导RAW细胞分化为M1型巨噬细胞)；Keli (RAW细胞先加可利霉素，再加LPS+INF-γ)；Yiqu(RAW细胞先加伊曲康唑，再加LPS+INF-γ)；并进行统计学检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图12B是RAW细胞先加药物作用1h，再诱导其往M1型分化，检测iNOS的水平；
图12C是RAW细胞先加药物作用1h，再诱导其往M2型分化，检测Arg-1的水平；图注：NC(RAW 细胞，不做任何处理)；PC2(RAW细胞加IL-4，诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞)；Keli(RAW 细胞先加可利霉素，再加IL-4)；Yiqu(RAW细胞先加伊曲康唑，再加IL-4)；并进行统计学检验，*P<0.05， **P<0.01，***P<0.001。
方案一结果分析：
可利霉素可以升高TNF-α和iNos的表达，抑制Arg-1的表达。提示可利霉素可能促进M1型巨噬细胞的分化和功能。
方案二：A、探讨可利霉素是否对分化巨噬细胞是否有转分化作用
图13A先加细胞因子诱导RAW细胞分化为M1型巨噬细胞，再加相应地药物，检测TNF-α的表达
图13B先加细胞因子诱导RAW细胞分化为M1型巨噬细胞，再加相应地药物，检测iNOS的表达图13A先加细胞因子诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞，再加相应地药物，检测Arg-1的表达
图13A-13C中，NC(RAW细胞，不做任何处理)；PC1(RAW细胞加LPS+INF-γ，诱导RAW细胞分化为M1型巨噬细胞)；PC2(RAW细胞加IL-4，诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞)；Keli((RAW 细胞先加LPS+INF-γ，诱导RAW细胞分化为M1型巨噬细胞，再加可利霉素)；Yiqu(RAW细胞先加 LPS+INF-γ，诱导RAW细胞分化为M1型巨噬细胞，再加伊曲康唑)；并进行统计学检验，*P<0.05， **P<0.01，***P<0.001。
实验结果：与在RAW246.7细胞系上获得的结果一致，可利霉素不进一步增强LPS+INF-γ诱导的TNF- α和iNOS的表达，但是能够抑制M1型巨噬细胞中Arg-1的表达水平，提示可利霉素有潜在增强M1型巨噬细胞功能的作用。
方案二：B探讨可利霉素是否对分化巨噬细胞是否有转分化作用
图14A先加细胞因子诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞，再加相应地药物，检测TNF-α的表达
图14B先加细胞因子诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞，再加相应地药物，检测iNOS的表达
图14C先加细胞因子诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞，再加相应地药物，检测Arg-1的表达
图14A-14C中：NC(RAW细胞，不做任何处理)；PC1(RAW细胞加IL-4，诱导RAW细胞分化为 M2型巨噬细胞)；PC2(RAW细胞加IL-4，诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞)；Keli((RAW细胞先加IL-4，诱导RAW细胞分化为M2型巨噬细胞，再加可利霉素)；Yiqu(RAW细胞先加IL-4，诱导 RAW细胞分化为M2型巨噬细胞，再加伊曲康唑)；并进行统计学检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
实验结果：可利霉素可以显著提高TNF-α和iNos在M2型巨噬细胞中的表达水平，并且显著强于 LPS+INF-γ诱导的TNF-α和iNos表达水平，更优于伊曲康唑，并能显著抑制Arg-1在M2型巨噬细胞中的表达水平。
三、可利霉素抗感染作用
1、可利霉素对耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的作用
菌株：耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌各1株；
培养基：葡萄球菌:MH培养基加2％Nacl，35-37℃孵育24h。
其它菌种:常规MH培养基，35-37℃孵育16-18观察结果。
配方:蛋白胨1％，牛肉粉0.3％，Nacl 0.5％，琼脂粉1.2％。
上述培养基配制完成后均置于三角烧瓶中121℃高压灭菌15min，冷却后置4℃冰箱待用。
实验动物：
昆明小鼠，雌雄各半，体重18-22g,购自成都达硕实验动物有限公司(SPF级)。饲养条件:25℃，湿度60％。饲养条件为SPF级，研究过程遵从实验动物饲养管理和使用指南。
药物配制：
1)耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌组:称取0.24g药物，加2.4ml吐温80和2.4ml无水乙醇溶解药物，加蒸馏水至总体积为20ml，此时浓度为12mg/ml。从中取14mL药液,再加蒸馏水至总体积为20ml,此时浓度为8. 4mg/ml,是原浓度的70％。以此类推，取14mL高浓度药液，加蒸馏水至总体积为20ml，剂量间距1:0.7, 共5组。
2)耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌组:称取0.45g药物，加4.5ml吐温80和4.5ml无水乙醇溶解药物，加蒸馏水至总体积为30ml，此时浓度为15mg/ml。从中取24mL药液，再加蒸馏水至总体积为30ml，此时浓度为 12mg/ml，是原浓度的80％。以此类推，取24mL高浓度药液，加蒸馏水至总体积为30ml，剂量间距1:0.8, 共6组。
预实验(药物剂量范围测定)
①细菌接种:在离心管内加入3ml LB培养基，从4℃取出平皿，用接种环挑取2-3个菌落接种至LB 培养基中，37℃培养。
②MLD测定:取健康昆明小鼠，体重18-22g，随机分组，分为若干组，每组5只，雌雄兼用。菌液用 5％高活性干酵母稀释至不同浓度，腹腔注射，每只0.5mL，感染后观察7d，记录小鼠死亡数，以引起小鼠100％死亡的最低菌量作为MLD，用该菌量作为体内保护试验的感染菌量。
③药物剂量范围测定:取健康昆明小鼠，体重18-22g，随机分组，分为若干组，每组5只，雌雄兼用。
用5％高活性干酵母配制1MLD菌量，腹腔注射，每只0.5mL，感染小鼠1h后，用不同浓度药物进行灌胃，给药体积为0.2mL/10g，观察24h,记录小鼠死亡数，并以此结果为依据来设计体内治疗保护实验的给药剂量。
正式实验方法：
1)耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌组：取健康昆明小鼠，体重18-22g，随机分组，分为6组，每组10只，雌雄兼用。6组中5组为给药组，1组为溶剂对照组。
2)耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌组：取健康昆明小鼠，体重18-22g，随机分组，分为7组，每组10只，雌雄兼用。7组中6组为给药组，1组为溶剂对照组。
用5％高活性干酵母配制1MLD菌量，全部小鼠均腹腔注射0.5mL，感染小鼠1h后，用不同浓度药物或溶剂进行灌胃，给药体积为0.2mL/10g，连续观察14d，记录小鼠的死亡数。
实验结果：
(1)MLD结果(最大致死菌量确定)：
表3
细菌名称
MLD值
耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌
1×10<sup>8</sup>CFU/mL
耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌
1×10<sup>6</sup>CFU/mL
(2)药物剂量范围确定：
表4
细菌名称
药物剂量范围
耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌
58-240mg/kg
耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌
98-300mg/kg
(3)可利霉素保护感染耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌或耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌小鼠的7天死亡率如表5 所示：
表5
(4)耐药菌的ED50结果(根据Bills法计算)
表6
细菌名称
ED50
耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌
153.2mg/kg
耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌
112.2mg/kg
结论：可利霉素对耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌在体内有良好的抑菌效果，能够显著提升感染动物的生存率。
四、可利霉素抗新冠临床试验中细胞因子相关数据
新冠患者用药(可利霉素)后免疫相关指标变化情况
通过对FAS集试验组和对照组用药后第1、3、5、7-10天免疫相关指标(淋巴细胞计数、淋巴细胞百分比、CD4、CD8计数及百分比、炎症细胞因子)较基线变化值历时性变化比较，其中淋巴细胞计数较基线变化值历时性变化第7-10天具有统计学意义(P＝0.003)。
表7-1
与表7-1相对应的，炎症细胞因子IL-β历时性变化曲线(FAS)(均数折线图±SE芒刺)如图15所示；炎症细胞因子IL-4历时性变化曲线(FAS)(均数折线图±SE芒刺)如图16所示。
表7-2
表8-1
与表8-1相对应的，炎症细胞因子IL-β历时性变化曲线(PPS)(均数折线图±SE芒刺)如图17所示；炎症细胞因子IL-4历时性变化曲线(PPS)(均数折线图±SE芒刺)如图18所示。
表8-2
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。