阅读说明：本技术 一种可变形的纳米疫苗及其制备方法和应用 (deformable nano vaccine and preparation method and application thereof ) 是由 梁兴杰 宫宁强 于 2018-05-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种可变形的纳米疫苗及其制备方法和应用,所述纳米疫苗包括高分子-多肽组装体以及肿瘤抗原多肽,具有单分散性,在生理pH条件下为球形颗粒,粒径为100-200nm,内吞体的酸性环境下由球形颗粒变成5-8μm的二维片层状结构；本发明通过将纳米科技和生物免疫相结合,通过复杂实验制备得到pH响应且自组装的纳米疫苗,该疫苗制备工艺简单,原理巧妙,效果显著,具有广阔的应用前景和市场价值。(the invention provides a deformable nano vaccine and a preparation method and application thereof, wherein the nano vaccine comprises a polymer-polypeptide assembly and tumor antigen polypeptide, has monodispersity, is spherical particles under the condition of physiological pH, has the particle diameter of 100nm and 200nm, and is a two-dimensional lamellar structure of 5-8 mu m changed from the spherical particles under the acidic environment of endocytosis; the invention combines nanotechnology and biological immunity, prepares the pH response and self-assembly nano vaccine through complex experiments, and has the advantages of simple preparation process, ingenious principle, obvious effect, wide application prospect and market value.)

一种可变形的纳米疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及纳米疫苗领域，尤其涉及一种可变形的纳米疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤免疫疗法被认为具有非常大的前景。其中，免疫检查点疗法，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T)疗法和肿瘤疫苗等引起了越来越多的关注。肿瘤疫苗采用肿瘤特异性的抗原使抗原提呈细胞对目标抗原识别并选择性杀伤，具有比较大的应用潜力。但是，实现有效的抗肿瘤免疫的前提是实现抗原的交叉提呈，因为抗原提呈细胞摄取疫苗后往往不能很好的递送到细胞质，其内吞体或者溶酶体中的酶会降解这些抗原多肽，并且通过主要组织相容性复合体Ⅱ(majorhistocompatibility complex Ⅱ，MHC Ⅱ)类分子递呈给CD4⁺T细胞，但是CD4⁺T细胞的杀伤肿瘤能力有限，所以实现高效的胞内递送，从而导致有效的抗原交叉提呈是肿瘤疫苗领域面临的一个关键性科学问题。

纳米技术的兴起为解决以上这些问题带来了希望，现有技术中，采用的策略包括使用具有“质子海绵效应”的聚合物材料，其在内吞体中吸收大量质子，造成内吞体渗透压破坏，破坏内吞体；采用蜂毒肽等具有膜穿孔效应的多肽，其在内吞体部位选择性释放，在内吞体膜上穿孔，导致载带的基因或蛋白释放到胞质；采用电荷反转的方法，其在生理条件下纳米颗粒带负电荷，如果其被内吞进入内涵体以后，其表面能够迅速带上大量正电荷，这些带正电荷的纳米颗粒与内吞体膜相互作用，导致内涵体膜破坏，从而释放载带的基因或蛋白释放到胞质部位。CN105214097A涉及一种pH响应的PMMMA膜壳层用于疫苗口服免疫的实施与检测技术。以PLGA/抗原等微纳米疫苗体系为基础，通过表面自由基聚合方法，获得在酸性条件下稳定、抗酶解的聚(甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸)(PMMMA)膜壳层加强口服疫苗，通过口服该疫苗实施免疫的方式，受试者(如罗非鱼)可于短期内获得高水平持效性较好的免疫能力。但上述现有技术存在制备工艺复杂，成本高昂，治疗效果残次不齐的缺陷。

在纳米自组装领域最近发展到了活体生物层面，在细胞或活体动物水平的纳米自组装能够具有非常独特的生物学性能，这是传统的生物学或化学的方法所不具有的能力。因此，研发一种利用可控的活体多肽自组装的方法并制备成纳米疫苗，将所载带的抗原多肽直接递送进入细胞质，实现高效的肿瘤免疫治疗效果，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种可变形的纳米疫苗及其制备方法和应用，所述纳米疫苗包括高分子-多肽组装体以及肿瘤抗原多肽，

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种可变形的纳米疫苗，所述纳米疫苗包括高分子-多肽组装体和肿瘤抗原多肽；

其中，所述纳米疫苗具有如下式Ⅰ所示结构：

其中，M独立地选自2-6中的整数，N独立地选自20-24的整数，K独立地选自28-32的整数，P独立地选自4或5。

所述M例如可以是2、3、4、5或6，N例如可以是20、21、22、23或24，K例如可以是28、29、30、31或32。

所述高分子-多肽组装体为纳米变形器，粒径大小为100-150nm，例如可以是100nm、110nm、120nm、130nm、140nm或150nm。

优选地，所述纳米疫苗具有单分散性，在生理pH条件下为球形颗粒，粒径为100-200nm，例如可以是100nm、120nm、140nm、160nm、180nm或200nm。

优选地，所述纳米疫苗在酸性环境下由球形颗粒变成5-8μm的二维片层状结构。

优选地，所述酸性环境的pH为5.6。

优选地，所述酸性环境为内吞体的酸性环境。

本发明中，发明人在深入研究疫苗领域的优缺点，将纳米科技与生物免疫技术相结合，通过长期复杂的科研探索，制备了高分子-多肽组装体，该组装体具有双亲性结构，可以自组装形成纳米结构(纳米变形器)，也可以通过乳化-溶剂蒸发法载带亲水性的抗原多肽，本发明所述的可变形的纳米疫苗可以有效的将抗原多肽递送进入细胞质，引起主要组织相容性复合体Ⅰ对抗原的提呈，从而引起肿瘤特异性的免疫杀伤。

本发明提供的纳米疫苗具有酸性环境敏感的形状变化特点，在生理pH条件下，该纳米疫苗维持球形的形貌和纳米尺度的粒径，在酸性环境下，该纳米疫苗的形状可以发生变化，由球形纳米颗粒(～100nm)变成5-8μm的片层状结构，这样的形状变化可以导致细胞内涵体被机械力破坏，导致所载带的肿瘤抗原能释放到细胞质中，从而使抗原能够高效的通过主要组织相容性复合体-Ⅰ(Major Histocompatibility Complex-Ⅰ，MHC-Ⅰ)提呈到树突状细胞(Dendritic cells,DCs)表面，DCs再通过其抗原多肽-MHC-Ⅰ复合物与T细胞的T细胞受体相互作用，将抗原信息高效传递给CD8⁺T淋巴细胞，从而诱导出较强的抗原特异性的CD8+T细胞增殖以及抗原特异性的肿瘤细胞杀伤。

第二方面，本发明提供一种制备如第一方面所述纳米疫苗的方法，包括如下步骤：

(1)通过RAFT聚合的方法，以DMAEMA和OEGMA为单体，偶氮二异丁腈为引发剂，进行反应合成聚合物p(OEGMA_M-DMAEMA_N)；

(2)以步骤(1)得到的p(OEGMA_M-DMAEMA_N)为大分子链转移剂，以MA为单体，在AIBN的引发下进行聚合反应恒温搅拌合成p(OEGMA_M-DMAEMA_N)-p(MA)_K；

(3)以步骤(2)得到的p(OEGMA_M-DMAEMA_N)-p(MA)_K为原料，通过MA上的羧基与VE反应，得到p(OEGMA_M-DMAEMA_N)-p(MAVE)_K；

(4)将PDP通过酸敏感共价键连接到p(OEGMA_M-DMAEMA_N)-p(MAVE)_K上，反应合成p(OEGMA_M-DMAEMA_N)-p((MAVE)_K1-(MAVE-PDP)_K2)；

(5)采用乳化-溶剂挥发法将抗原多肽包载在步骤(4)得到的p(OEGMA_M-DMAEMA_N)-p((MAVE)_K1-(MAVE-PDP)_K2)，组成得到第一方面所述的纳米疫苗。

其中，M独立地选自2-6中的整数，N独立地选自20-24的整数，K独立地选自28-32的整数，P独立地选自4或5，K1和K2之和为K，改变PDP与聚合物的比例可以调整K1和K2的数值，例如K1为26、22或18，K2为4、8或12。

具体地，所述可变形纳米疫苗通过四步法合成，首先采用甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(2-(Dimethylamino)ethyl methacrylate,DMAEMA)，寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(Oligo(ethylene glycol)methyl ether methacrylate,OEGMA)为单体，偶氮二异丁腈(2,2'-Azobis(2-methylpropionitrile),AIBN)为引发剂，合成p(OEGMA_M-DMAEMA_N)；

然后以p(OEGMA_M-DMAEMA_N)为大分子链转移剂，以甲基丙烯酸(Methacrylic acid,MA)为单体，在偶氮二异丁腈(2,2'-Azobis(2-methylpropionitrile),AIBN)的引发下合成p(OEGMA_M-DMAEMA_N)-p(MA)_K；

以p(OEGMA_M-DMAEMA_N)-p(MA)_K为原料，通过甲基丙烯酸(Methacrylic acid,MA)上的羧基与2-氯乙基乙烯醚(2-chloroethyl vinyl ether，VE)反应，得到p(OEGMA_M-DMAEMA_N)-p(MAVE)_K，具体为取一定量的p(OEGMA_M-DMAEMA_N)-p(MA)_K溶解于无水DMF中，在氢氧化钾(KOH)的催化下，加入过量的2-氯乙基乙烯醚(2-chloroethyl vinyl ether，VE)，反应24h,后透析得到p(OEGMA_M-DMAEMA_N)-b-p(MAVE)_K；

将连接芘的D-型多肽(Pyrene-conjugated D-peptide,PDP)通过酸敏感共价键连接到p(OEGMA_M-DMAEMA_N)-p(MAVE)_K上，合成p(OEGMA_M-DMAEMA_N)-p((MAVE)_K1-(MAVE-PDP)_K2)，具体步骤为：将一定量的p(OEGMA_M-DMAEMA_N)-b-p(MAVE)_K溶解于干燥DMF，然后再加入一定量的PDP多肽以及对甲基苯磺酸(p-toluenesulfonic acid，p-TSA)，在N₂保护条件下，在分子筛存在条件下，反应72h，得到p(OEGMA_M-DMAEMA_N)-p-(MAVE)_K1-(MAVE-PDP)_K2；

再通过乳化-溶剂挥发法方法将抗原多肽包载在该纳米变形器，组成该可变形纳米疫苗。

优选地，步骤(1)所述的AIBN、OEGMA以及DMAEMA的摩尔量比为1：(70-280):(80-290)，例如可以是例如1:70:290、1:80:280、1:90:270、1:100:260、1:110:250、1:120:240、1:130:230、1:150:210、1:180:180、1:200:1:60、1:220:140、1:240:120、1:260:100或1:280:80，优选为1:60:300。

优选地，步骤(1)所述合成聚合物链上的单体数量为6-50个，例如可以是6个、8个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、22个、24个、26个、28个、30个、34个、38个、40个、46个、48个或50个，优选为10-30个。

优选地，步骤(1)所述反应的时间为1-8h，例如可以是1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h、6h、6.5h、7h、7.5h或8h。

优选地，步骤(1)所述反应温度为55-76℃，例如可以是55℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、70℃、72℃、74℃或76℃。

优选地，步骤(2)所述加入p(OEGMA_M-DMAEMA_N)与MA的摩尔量比为1:(10-400)，例如可以是1:10、1:40、1:70、1:100、1:130、1:160、1:190、1:220、1:250、1:280、1:300、1:330或1:400，优选为1:200。

优选地，步骤(2)所述加入的AIBN的摩尔量与MA的摩尔量之比为1:(100-900)，例如可以是1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800或1:900，优选为1:500。

优选地，步骤(2)所述甲基丙烯酸溶解于N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide，DMF)或1,4-二氧六环(1,4-dioxane,DOA)。

优选地，步骤(2)所述聚合反应在油浴锅恒温条件下进行。

优选地，步骤(2)所述搅拌的转速为1000-10000rpm，例如可以是1000rpm、2000rpm、2500rpm、3000rpm、3800rpm、4000rpm、5000rpm、6000rpm、7500rpm、8000rpm或10000rpm，优选为1000-5000rpm。

优选地，步骤(2)所述聚合反应的时间为2-8h，例如可以是2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h、6h、6.5h、7h、7.5h或8h。

优选地，步骤(3)所述加入p(OEGMA_M-DMAEMA_N)-p(MA)_O与VE的摩尔量比为1:(30-300)，例如可以是1:30、1:60、1:90、1:120、1:150、1:180、1:210、1:240、1:270或1:300，优选为1:100。

优选地，步骤(3)的反应时间为12-48h，例如可以是12h、18h、24h、32h或48h，优选为24h。

优选地，步骤(4)中加入的p(OEGMA_M-DMAEMA_N)-p(MAVE)_K的摩尔量与PDP的摩尔量之比为1:(30-400)，例如可以是1:30、1:50、1:80、1:120、1:160、1:200、1:250、1:300或1:400，优选为1:100。

优选地，步骤(4)中反应温度为15-37℃，例如15℃，20℃，25℃，30℃或37℃，优选为25℃。

优选地，步骤(4)所述反应时间为20-48h，例如可以是20h、25h、28h、32h、36h、40h、44h或48h，优选为24h。

优选地，步骤(4)所述反应的溶剂包括N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)。

优选地，步骤(5)所述p(OEGMA_M-DMAEMA_N)-p((MAVE)_K1-(MAVE-PDP)_K2)与抗原多肽的比例为1:(5-100)，例如可以是1:5、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:80或1:100,优选为1:50。

优选地，步骤(1)所述p(OEGMA_M-DMAEMA_N)的纯化方法为透析法，所述透析的截留分子量为1000-2000Da，例如可以是1000Da、1500Da、1800Da或2000Da，优选为1000Da。

优选地，步骤(2)所述p(OEGMA_M-DMAEMA_N)-p(MA)_K的纯化方法为透析法，所述透析的截留分子量为10-30kDa，例如可以是10kDa、12kDa、14kDa、16kDa、18kDa、20kDa、23kDa、25kDa、28kDa或30kDa。

优选地，步骤(3)所述p(OEGMA_M-DMAEMA_N)-p(MAVE)_K的纯化方法为透析法，所述透析的截留分子量为10-30kDa，例如可以是10kDa、12kDa、14kDa、16kDa、18kDa、20kDa、23kDa、25kDa、28kDa或30kDa。

优选地，步骤(5)所述包载抗原多肽的方法包括如下步骤：

(1’)将p(OEGMA_M-DMAEMA_N)-p-(MAVE)_K1-(MAVE-PDP)_K2与抗原多肽溶解在氯仿中；

(2’)在步骤(1’)中加入PBS缓冲液，超声仪下超声5min，成乳白色液体后，再除去体系中的氯仿。

优选地，步骤(1’)所述氯仿的体积为100-1000μL，例如可以是100μL、200μL、300μL、500μL、800μL或1000μL，优选为200μL。

优选地，步骤(2’)中PBS的pH值为7.2-7.4，例如可以是7.2、7.3或7.4。

优选地，步骤(2’)中PBS的体积为0.5-10mL，例如可以是0.5mL、1mL、3mL、4mL、5mL或10mL，优选为2mL。

优选地，步骤(2’)中超声的功率为30-150W，例如30W、50W、60W、100W或150W，优选为50W。

优选地，步骤(2’)中超声的时间为1-20min，例如可以是1min、2min、3min、4min、6min、7min、8min、9min、10min、15min或20min，优选为5min。

优选地，步骤(2’)中采用旋转蒸发的方法去除氯仿。

优选地，步骤(5)所述的纳米疫苗的纯化方法为离心。

优选地，所述离心的转速为3000-5000rpm，例如可以是3000rpm、3500rpm、4000rpm、4500rpm或5000rpm。

优选地，所述纯化还包括用pH 7.2-7.4的磷酸缓冲液进行重新分散和洗涤。

在具体的实施例中，对可变性的纳米疫苗做一个列举，其M选自4，N选自22，K选自30，P选自4-5，具体的制备方法如下：

具体地，所述可变形纳米疫苗通过四步法合成，首先采用甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(2-(Dimethylamino)ethyl methacrylate,DMAEMA)，寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(Oligo(ethylene glycol)methyl ether methacrylate,OEGMA)为单体，偶氮二异丁腈(2,2'-Azobis(2-methylpropionitrile),AIBN)为引发剂，合成p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)；

然后以p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)为大分子链转移剂，以甲基丙烯酸(Methacrylicacid,MA)为单体，在偶氮二异丁腈(2,2'-Azobis(2-methylpropionitrile),AIBN)的引发下合成p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p(MA)₃₀；

以p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p(MA)₃₀为原料，通过甲基丙烯酸(Methacrylic acid,MA)上的羧基与2-氯乙基乙烯醚(2-chloroethyl vinyl ether，VE)反应，得到p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p(MAVE)₃₀，具体为取一定量的p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p(MA)₃₀溶解于无水DMF中，在氢氧化钾(KOH)的催化下，加入过量的2-氯乙基乙烯醚(2-chloroethyl vinyl ether，VE)，反应24h,后透析得到p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-b-p(MAVE)₃₀；

将连接芘的D-型多肽(Pyrene-conjugated D-peptide,PDP)通过酸敏感共价键连接到p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p(MAVE)₃₀上，合成p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p((MAVE)₁₈-(MAVE-PDP)₁₂)，具体步骤为：将一定量的p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-b-p(MAVE)₃₀溶解于干燥DMF，然后再加入一定量的PDP多肽以及对甲基苯磺酸(p-toluenesulfonic acid，p-TSA)，在N₂保护条件下，在分子筛存在条件下，反应72h，得到p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p-(MAVE)₁₈-(MAVE-PDP)₁₂；

再通过乳化-溶剂挥发法方法将抗原多肽包载在该纳米变形器，组成该可变形纳米疫苗。

第三方面，本发明一种如第一方面所述的可变形纳米疫苗用于制备***的药物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的制备纳米疫苗的方法具有工艺简单、产率高等特点；本发明提供的可变形纳米疫苗的粒径为100-200nm，粒径均一，分散性良好，所述纳米变形器在内吞体酸性环境下可以释放出多肽重新组装成5-8μm的二维片状材料，其形貌变化可以导致细胞内吞体撑破，进而使所载带的肿瘤抗原多肽直接递送进入细胞质，经过MHC Ⅰ途径将肿瘤抗原递呈给细胞毒性CD8⁺T淋巴细胞，然后CD8⁺T细胞再选择性得识别并杀伤肿瘤细胞；本研究发现该可变形的纳米疫苗具有较好的肿瘤细胞杀伤力，可以用于制备肿瘤免疫治疗的药物。

附图说明

图1为本发明制备的可变形纳米疫苗的制备方法示意图；

图2为本发明制备的纳米变形器的合成路线图；

图3为本发明制备的纳米变形器的¹H-NMR表征结果；

图4为本发明制备的可变形纳米疫苗的透射电镜图，其中图4(A)图和图4(B)是其在生理pH以及模拟的内吞体pH条件下的TEM图片；

图5为本发明制备的纳米疫苗的动态光散射表征结果图，其中图5(A)和图5(B)是其在生理pH以及模拟的内吞体pH条件下的粒径分布图；

图6为利用本发明制备得到的可变形纳米疫苗载带的OVA抗原在细胞内的分布图；

图7为本发明制备的纳米疫苗的亚甲基橙染色实验图，其反应纳米疫苗对细胞内吞体完整性的影响；

图8为本发明所制备的可变形纳米疫苗活体抑瘤实验结果图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1

在本实施例中，通过以下方法制备可变形纳米疫苗，具体包括以下步骤(制备方法示意图如图1所示)：

(1)通过RAFT聚合的方法，以DMAEMA(17.2mmol)和OEGMA(3.44mmol)为原料，以AIBN(0.058mmol)为引发剂，在60℃下反应12小时合成p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)；

(2)以步骤(1)得到的p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)作为大分子链转移剂(0.01mmol)，以MA(2mmol)为单体，以AIBN(0.005mmol)为引发剂，在60℃下2小时合成p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p(MA)₃₀；

(3)以步骤(2)得到的p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p(MA)₃₀为基础，通过其甲基丙烯酸侧链羧基与VE的反应，得到p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p-(MAVE)₃₀；

(4)以步骤(2)得到的p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p-(MAVE)₃₀为基础，在其MAVE侧链上连接不同数量的PDP，如4个，8个，12个，得到p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p-(MAVE)₂₆-(MAVE-PDP)₄，p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p-(MAVE)₂₂-(MAVE-PDP)₈，或p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p-(MAVE)₁₈-(MAVE-PDP)₁₂即纳米变形器，合成路线见图2；p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p-(MAVE)₁₈-(MAVE-PDP)₁₂的¹H-NMR表征结果见图3，通过PDP苯环上芳香氢的数量与高分子链主干上DMAEMA的甲基氢的积分之比可以算出平均的PDP接枝数量。

(5)以步骤(4)得到的p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p-(MAVE)₁₈-(MAVE-PDP)₁₂为载体(100mg)，以OVA模型多肽为抗原(2mg)通过乳化-溶剂蒸发的方法，制备载带抗原多肽的可变形纳米疫苗，透射电镜图见图4；

由图4可知，制得的纳米疫苗粒径均匀，呈单分散性。

可变形纳米疫苗的动态光散射表征结果图如图5所示，由图5可知，变形纳米疫苗在生理pH条件下具有球形的形貌，粒径在～100nm，当这种纳米疫苗被抗原提呈细胞摄取后，其内吞体的酸性环境会导致该纳米疫苗变形为5-8μm；

实施例2

在本实施例中，通过以下方法制备可变形纳米疫苗，具体包括以下步骤(制备方法示意图如图1所示)：

(1)通过RAFT聚合的方法，以DMAEMA(17.2mmol)和OEGMA(3.44mmol)为原料，以AIBN(0.088mmol)为引发剂，在60℃下反应8小时合成p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)；

(2)以步骤(1)得到的p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)作为大分子链转移剂(0.01mmol)，以MA(3mmol)为单体，以AIBN(0.004mmol)为引发剂，在65℃下1小时合成p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p(MA)₃₀；

(3)以步骤(2)得到的p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p(MA)₃₀为基础，通过其甲基丙烯酸侧链羧基与VE的反应，得到p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p-(MAVE)₃₀；

(4)以步骤(2)得到的p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p-(MAVE)₃₀为基础，在其MAVE侧链上连接不同数量的PDP，得到p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p-(MAVE)₁₈-(MAVE-PDP)₁₂；

(5)以步骤(4)得到的p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p-(MAVE)₁₈-(MAVE-PDP)₁₂为载体(100mg)，以OVA模型多肽为抗原(1mg)通过乳化-溶剂蒸发的方法，制备载带抗原多肽的可变形纳米疫苗。

实施例3

在本实施例中，通过以下方法制备可变形纳米疫苗，具体包括以下步骤(制备方法示意图如图1所示)：

(1)通过RAFT聚合的方法，以DMAEMA(17.2mmol)和OEGMA(3.44mmol)为原料，以AIBN(0.035mmol)为引发剂，在70℃下反应6小时合成p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)；

(2)以步骤(1)得到的p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)作为大分子链转移剂(0.01mmol)，以MA(4mmol)为单体，以AIBN(0.002mmol)为引发剂，在60℃下1.5小时合成p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p(MA)₃₀；

(3)以步骤(2)得到的p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p(MA)₃₀为基础，通过其甲基丙烯酸侧链羧基与VE的反应，得到p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p-(MAVE)₃₀；

(4)以步骤(2)得到的p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p-(MAVE)₃₀为基础，在其MAVE侧链上连接不同数量的PDP，得到p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p-(MAVE)₁₈-(MAVE-PDP)₁₂；

(5)以步骤(4)得到的p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p-(MAVE)₁₈-(MAVE-PDP)₁₂为载体(100mg)，以OVA模型多肽为抗原(0.8mg)通过乳化-溶剂蒸发的方法，制备载带抗原多肽的可变形纳米疫苗。

实施例4

在本实施例中，通过以下方法制备可变形纳米疫苗，具体包括以下步骤(制备方法示意图如图1所示)：

(1)通过RAFT聚合的方法，以DMAEMA(17.2mmol)和OEGMA(1.72mmol)为原料，以AIBN(0.03mmol)为引发剂，在60℃下反应24小时合成p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)；

(2)以步骤(1)得到的p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)作为大分子链转移剂(0.01mmol)，以MA(2mmol)为单体，以AIBN(0.006mmol)为引发剂，在65℃下1.5小时合成p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p(MA)₃₀；

(3)以步骤(2)得到的p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p(MA)₃₀为基础，通过其甲基丙烯酸侧链羧基与VE的反应，得到p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p-(MAVE)₃₀；

(4)以步骤(2)得到的p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p-(MAVE)₃₀为基础，在其MAVE侧链上连接不同数量的PDP，得到p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p-(MAVE)₁₈-(MAVE-PDP)₁₂；

(5以步骤(4)得到的p(OEGMA₄-DMAEMA₂₂)-p-(MAVE)₁₈-(MAVE-PDP)₁₂为载体(100mg)，以OVA模型多肽为抗原(2.5mg)通过乳化-溶剂蒸发的方法，制备载带抗原多肽的可变形纳米疫苗。

实施例5

在本实施例中考察纳米变形器对树突状细胞中抗原胞质递送的影响，方法如下：

将DC2.4细胞以50000个每孔的密度接种于激光共聚焦皿中，待细胞贴壁后，将实施例1制备得到的纳米疫苗以60μg/mL处理细胞24h，检测带有荧光标记的多肽在细胞内的分布，如图6所示；同时采用Lyso-Tracker对细胞的内吞体/溶酶体进行标记，研究该纳米疫苗是否具有帮助抗原递送到胞质的能力，同时将纳米可变形疫苗处理过的细胞采用亚甲基橙染色的方法，研究溶酶体/内吞体的完整性，结果如图7所示；

由图6和图7可以得出该纳米可变形疫苗具有破坏细胞内吞体结构，导致所载带抗原进入细胞质的能力。

实施例6

在本实施例中考察可变形纳米疫苗对肿瘤生长的抑制，方法如下：

将B16-OVA细胞复苏，扩增，在第零天给C57BL/6小鼠右后背部注射1×10⁶B16-OVA细胞，在5天后，小鼠的肿瘤达到50mm³；给该小鼠经过皮下注射的方式给药(125μg/只)，每7天给药一次；并且采用游标卡尺每隔一天量瘤一次，实时监测肿瘤生长情况。肿瘤的体积通过公式计算(体积＝1/2(长×宽²))并且隔天对小鼠的体重进行称量，记录，结果如图8所示；

由图8可知，在生理盐水对照组，肿瘤在第25天长到1500mm³，纳米变形器组，游离抗原多肽组小鼠的肿瘤体积均超过1500mm³，但是，纳米可变形疫苗给药组小鼠肿瘤的体积减小到大约55mm³，说明了所制备纳米疫苗具有很好的肿瘤抑制效果，在作为疫苗载体方面具有一定的潜力。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。