阅读说明：本技术 一种利用水酶法大豆水解液制备功能性蛋白复合物的方法 (Method for preparing functional protein compound by using aqueous enzymatic soybean hydrolysate ) 是由 隋晓楠 徐泽健 丁俭 赵家乐 吴芊颖 江连洲 于 2019-06-06 设计创作，主要内容包括：一种利用水酶法大豆水解液制备功能性蛋白复合物的方法属于水酶法大豆副产物利用技术,该方法包括以下步骤：(1)水酶法大豆水解液的制备；(2)水解液透析；(3)EGCG吸附沉淀水解液蛋白质；(4)冷冻干燥。该方法应用了儿茶素EGCG吸附沉淀水解液蛋白质的特性,将蛋白质回收率由等电点沉淀法的14.24％提高到60.07％,获得的水解液蛋白复合物蛋白纯度达到69.51％(干基)。实验证实,蛋白复合物具有较强的抗癌活性和较好的消化吸收特性,因此该方法制备的功能性蛋白复合物可广泛应用于保健及其他功能性食品。该方法操作过程简单,实现了对水酶法大豆主要副产物的绿色回收和高价利用,在油料、食品等加工行业富蛋白废水利用方面具有很高的应用价值。(A method for preparing functional protein compound by using aqueous enzymatic soybean hydrolysate belongs to the technology of aqueous enzymatic soybean byproduct utilization, and comprises the following steps: (1) preparing soybean hydrolysate by an aqueous enzymatic method; (2) dialyzing hydrolysate; (3) EGCG adsorbs and precipitates hydrolysate protein; (4) and (5) freeze drying. The method applies the characteristic of catechin EGCG for adsorbing and precipitating hydrolysate protein, improves the protein recovery rate from 14.24% of an isoelectric precipitation method to 60.07%, and obtains a hydrolysate protein compound with the protein purity of 69.51% (dry basis). Experiments prove that the protein compound has stronger anticancer activity and better digestion and absorption characteristics, so that the functional protein compound prepared by the method can be widely applied to health care and other functional foods. The method has simple operation process, realizes green recovery and high-price utilization of main byproducts of the soybeans by the aqueous enzymatic method, and has high application value in the aspect of utilization of protein-rich wastewater in processing industries such as oil plants, food and the like.)

一种利用水酶法大豆水解液制备功能性蛋白复合物的方法

技术领域

本发明属于水酶法大豆副产物利用技术，主要涉及一种利用水酶法大豆水解液制备功能性蛋白复合物的方法。

背景技术

在植物油脂工业，相对于溶剂萃取和压榨法制油工艺，水酶法制油工艺已被公认为是安全环保的优势工艺。美国农业部最新的关于大豆在全球的供应和分布报告显示，2018/19年度中国已进口大豆1.03亿公吨。大豆在我国植物油料加工行业占据举足轻重的地位。在大豆提油工艺中，水酶法是在水剂法的基础上添加生物酶类提取油脂，相对于传统的压榨法和化学浸出法，水酶法提油过程条件温和，可同步提取，无溶剂残留，绿色安全，以此法制取大豆油脂得率达到96％以上，同步提取大豆蛋白可以有效降低胰蛋白酶抑制剂的活性，并且具有较好的抗氧化活性。在水酶法大豆提油日益工业规模化的背景下，如何综合利用水酶法大豆副产物是大豆加工行业关注的焦点。

水酶法大豆主要产物有游离油、乳状液、水解液及残渣。水解液中多糖和蛋白含量分别占大豆原料的55％和92％，还含有磷脂以及少量油滴等。因此，水解液是水酶法同步提取蛋白的主要来源。水解液也是天然抗氧化剂的重要来源，诸多学者针对水解液中生物活性多肽的提取及功能表征已开展了广泛的研究，其中生物活性多肽的自由基清除能力以及金属离子螯合作用最为显著。本团队已证实水酶法大豆水解液中的多肽具有显著的生物学功能，渗透过上皮细胞的多肽表现出较强的抗氧化活性。

由于水解液成分复杂，其综合利用包括蛋白回收一直以来是重要难题。近年来，围绕水酶法大豆水解液的综合利用难题，相关学者开展了较多研究工作，并取得一些具有创新性的成果。美国爱荷华州立大学Sekhon团队以水酶法大豆水解液作为微生物发酵的含氮物质来源，发酵干磨玉米生产乙醇，经过工艺优化后，乙醇得率提高20％，并且极大程度地缩短了发酵时间，达到了充分利用水解液蛋白质的目的。在回收水解液蛋白质方面，大量研究采用了等电点沉淀、纳米过滤、超滤和树脂吸附等方法，但普遍存在回收率低或者成本高昂等问题。

儿茶素，水溶性无色化合物，是茶叶中的主要多酚，占茶多酚含量的40％-60％。茶叶中包含四种主要的儿茶素，即表儿茶素(EC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，其中EGCG由于高含量和突出的生物活性被认为是最重要的组分，具有多才多艺的生物学功能。EGCG无毒，已被多项流行病学和动物研究证实具有预防癌症的作用，在功能性食品、营养药品和制药工业中发挥着重要的保健作用，EGCG发挥肿瘤防治功效的一个重要机制是EGCG通过结合作用与肿瘤细胞生长过程中起关键作用的靶蛋白/肽或酶相互作用，致使其失活或者影响其生理功能。在食品工业中，多酚通过疏水或亲水性相互作用与蛋白质/多肽结合，形成多酚蛋白复合物，改变蛋白质的结构和功能特性。

本发明首次提出并采用了EGCG吸附沉淀水酶法大豆水解液蛋白质的方法，制备功能性蛋白复合物，可以实现绿色、安全、高值化利用水酶法大豆副产物的目的，EGCG本身特有的生物活性赋予了回收蛋白独特的功能特性，细胞毒性实验以及体外模拟消化吸收实验证实了蛋白复合物具有较强的生物学功能和较好的消化吸收特性，因此，该方法制备的功能性蛋白复合物可广泛应用于保健及其他功能性食品，而且本发明在油料、食品等加工行业富蛋白废水利用方面具有很高的应用价值和较强的实用性。

发明内容

本发明提供利用一种利用水酶法大豆水解液制备功能性蛋白复合物的方法，该方法操作过程简单，蛋白产品性价比高，实现了对水酶法大豆主要副产物的绿色回收。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种利用水酶法大豆水解液制备功能性蛋白复合物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)水酶法大豆水解液的制备：将市售大豆膨化粉过60目筛，调节料液比、pH、温度、Alcalase 2.4L碱性蛋白酶添加量，酶解后灭酶，离心，收集水解液，过四层纱布两次，4℃储存；(2)水解液透析：4-25℃条件下，透析时间6-18h；(3)EGCG吸附沉淀水解液蛋白质：调节水解液pH为2-11，向水解液中添加EGCG，EGCG浓度为1-5％(w/v)，混合均匀，10-30℃静置30-60min，离心转速为2000-4000r/min，离心时间为5-15min得到水解液蛋白质沉淀；(4)冷冻干燥：真空度10-100Pa，冻干时间6-18h。

所述的水酶法大豆水解液的制备工艺为：将市售大豆膨化粉过60目筛，按照以下条件进行酶解：料液比1:6.5，pH8.5，温度57℃，Alcalase 2.4L碱性蛋白酶添加量2％(v/w)，酶解时间3.75h。酶解后灭酶，离心(8000r/min，20min)，收集水解液，过四层纱布两次，4℃储存。

所述的水解液透析条件为：透析袋截留分子量100-500Da，透析温度4℃，透析时间12h。

所述的儿茶素为表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，纯度≥98％。

所述的EGCG吸附沉淀水解液蛋白质工艺为：调节水解液pH为4.5，向水解液中添加EGCG，EGCG添加量为3％(w/v)，混合均匀，20℃静置40min，离心(3000r/min，10min)得到水解液蛋白质沉淀。

所述的真空冷冻干燥条件为：真空度20Pa，冻干时间12h。

本发明方法应用了EGCG吸附沉淀水解液蛋白质的特性，将蛋白质回收率由等电点沉淀法的14.24±0.46％提高到60.07±1.69％，获得的水解液蛋白复合物蛋白纯度达到69.51±0.24％(干基)，EGCG含量达到15.11±0.64％。细胞毒性实验证实，蛋白复合物具有较强的抗癌活性和较好的生物相容性。体外模拟消化吸收实验证实，蛋白复合物可以对EGCG起到很好的保护作用，同时该复合物可以作为EGCG的载体，具有缓释EGCG的效果。因此该方法制备的功能性蛋白复合物可广泛应用于保健及其他功能性食品。该方法操作过程简单，蛋白产品性价比高，实现了对水酶法大豆主要副产物的绿色回收和高价利用，在油料、食品等加工行业富蛋白废水利用方面具有很高的应用价值。

附图说明

图1为本发明总工艺路线图。

图2为实施例1EGCG添加量与pH条件对蛋白质回收率的影响。

图3为实施例2透析时间对蛋白质回收率的影响。

图4为实施例3MTT实验检测儿茶素以及蛋白复合物的细胞毒性。

图5为实施例3流式细胞仪检测细胞凋亡实验检测儿茶素以及蛋白复合物的细胞毒性。

图6为实施例4HPLC检测儿茶素以及蛋白复合物在肠道中的模拟吸收情况。

具体实施方式

下面结合附图对本发明具体实施例进行详细描述。

一种利用水酶法大豆水解液制备功能性蛋白复合物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)水酶法大豆水解液的制备：将市售大豆膨化粉过60目筛，调节料液比、pH、温度、Alcalase 2.4L碱性蛋白酶添加量，酶解后灭酶，离心，收集水解液，过四层纱布两次，4℃储存；(2)水解液透析：4-25℃条件下，透析时间6-18h；(3)EGCG吸附沉淀水解液蛋白质：调节水解液pH为2-11，向水解液中添加EGCG，EGCG浓度为1-5％(w/v)，混合均匀，10-30℃静置30-60min，离心转速为2000-4000r/min，离心时间为5-15min得到水解液蛋白质沉淀；(4)冷冻干燥：真空度10-100Pa，冻干时间6-18h。

所述的水酶法大豆水解液的制备工艺为：将市售大豆膨化粉过60目筛，按照以下条件进行酶解：料液比1:6.5，pH8.5，温度57℃，Alcalase 2.4L碱性蛋白酶添加量2％(v/w)，酶解时间3.75h。酶解后灭酶，离心(8000r/min，20min)，收集水解液，过四层纱布两次，4℃储存。

所述的水解液透析条件为：透析袋截留分子量100-500Da，透析温度4℃，透析时间12h。

所述的儿茶素为表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，纯度≥98％。

所述的EGCG吸附沉淀水解液蛋白质工艺为：调节水解液pH为4.5，向水解液中添加EGCG，EGCG添加量为3％(w/v)，混合均匀，20℃静置40min，离心(3000r/min，10min)得到水解液蛋白质沉淀。

所述的真空冷冻干燥条件为：真空度20Pa，冻干时间12h。

实施例1：

将市售大豆膨化粉过60目筛，按照以下条件进行酶解：料液比1:6.5，pH8.5，温度57℃，Alcalase 2.4L碱性蛋白酶添加量2％(v/w)，酶解时间3.75h。酶解后灭酶，离心(8000r/min，20min)，收集水解液，过四层纱布两次，4℃储存。水解液未透析条件下，调节水解液pH为2、4、4.5、7、9，向水解液中添加浓度为1、2、3、4％(w/v)的EGCG，混合均匀，常温静置30min，离心(3000r/min，10min)得到水解液蛋白质沉淀，最后将水解液蛋白质沉淀冷冻干燥得到蛋白复合物(SRP-EGCG)，真空冷冻干燥条件为：真空度20Pa，冻干时间24h。EGCG添加量与pH条件对蛋白质回收率的影响结果见图2。

实施例2：

将市售大豆膨化粉过60目筛，按照以下条件进行酶解：料液比1:6.5，pH8.5，温度57℃，Alcalase 2.4L碱性蛋白酶添加量2％(v/w)，酶解时间4h。酶解后灭酶，离心(8000r/min，20min)，收集水解液，过四层纱布两次，4℃储存。将水解液透析0、6、12、18、24h，透析袋截留分子量为100-500Da，透析温度为4℃，调节透析后的水解液pH为4.5，向水解液中添加EGCG，浓度为3％(w/v)，混合均匀，20℃静置40min，离心(3000r/min，10min)得到水解液蛋白质沉淀，最后将水解液蛋白质沉淀冷冻干燥得到蛋白复合物，真空冷冻干燥条件为：真空度20Pa，冻干时间12h。透析时间对蛋白质回收率的影响结果见图3。

实施例3：

将市售大豆膨化粉过60目筛，按照以下条件进行酶解：料液比1:6.5，pH8.5，温度57℃，Alcalase 2.4L碱性蛋白酶添加量2％(v/w)，酶解时间3.75h。酶解后灭酶，离心(8000r/min，20min)，收集水解液，过四层纱布两次，4℃储存。将水解液透析，透析袋截留分子量为100-500Da，透析温度为4℃，透析时间为12h，水解液冷冻干燥得到水解液蛋白粉(SRP)。向透析后的水解液中添加EGCG，调节水解液pH为4.5，EGCG浓度为3％(w/v)，混合均匀，20℃静置10min，离心(3000r/min，10min)得到水解液蛋白质沉淀。最后将水解液蛋白质沉淀冷冻干燥得到蛋白复合物(SRP-EGCG)，真空冷冻干燥条件为：真空度10Pa，冻干时间12h。通过MTT实验和流式细胞仪检测细胞凋亡实验检测儿茶素以及蛋白复合物对结肠癌细胞Caco-2细胞以及肠内皮正常细胞FHs 74Int的细胞毒性，结果表明，蛋白复合物具有较强的抗癌活性和较好的生物相容性。结果见图4和图5。

实施例4：

将市售大豆膨化粉过60目筛，按照以下条件进行酶解：料液比1:6.5，pH8.5，温度57℃，Alcalase 2.4L碱性蛋白酶添加量2％(v/w)，酶解时间3.75h。酶解后灭酶，离心(8000r/min，20min)，收集水解液，过四层纱布两次，4℃储存。将水解液透析，透析袋截留分子量为100-500Da，透析温度为4℃，透析时间为12h，水解液冷冻干燥得到水解液蛋白粉(SRP)。向透析后的水解液中添加EGCG，调节水解液pH为4.5，EGCG浓度为3％(w/v)，混合均匀，20℃静置10min，离心(3000r/min，10min)得到水解液蛋白质沉淀。最后将水解液蛋白质沉淀冷冻干燥得到蛋白复合物(SRP-EGCG)，真空冷冻干燥条件为：真空度10Pa，冻干时间12h。体外模拟消化实验结果表明，蛋白复合物中EGCG的含量变为消化前的80％，而单一成分EGCG经过消化，其含量变为消化前的56％，可以发现蛋白复合物对儿茶素在消化液中的降解起到保护作用。HPLC检测儿茶素以及蛋白复合物在肠道中的模拟吸收情况，结果表明，蛋白复合物可以对EGCG起到很好的保护作用，同时该复合物可以作为EGCG的载体，具有缓释EGCG的效果。结果见图6。