染料木苷在制备单增李斯特菌分选酶抑制剂中的应用
阅读说明：本技术 染料木苷在制备单增李斯特菌分选酶抑制剂中的应用 (Application of genistin in preparation of Listeria monocytogenes sortase inhibitor ) 是由 王建锋 刘敏达 张思琪 周永林 沈雪 王琳 冯海华 邓旭明 于 2021-09-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及染料木苷在制备单增李斯特菌分选酶抑制剂中的应用,通过体外试验分选酶活性抑制试验、生物被膜形成抑制试验和细菌内化分析试验验证染料木苷能够有效抑制分选催化活性并对单增李斯特菌毒力有较好的抑制作用；通过体内试验建立小鼠单增李斯特菌全身感染模型,证明染料木苷对单增李斯特菌感染有良好的治疗效果。(The invention relates to application of genistin in preparation of a Listeria monocytogenes sortase inhibitor, and the genistin is verified to be capable of effectively inhibiting sorting catalytic activity and having a good inhibiting effect on the toxicity of Listeria monocytogenes through an in vitro test sortase activity inhibition test, a biofilm formation inhibition test and a bacterial internalization analysis test; in vivo experiments are carried out to establish a mouse Listeria monocytogenes systemic infection model, which proves that the genistin has good treatment effect on the Listeria monocytogenes infection.)
技术领域
本发明涉及染料木苷抑制单增李斯特菌分选酶催化活性及在制备治疗李斯特菌感染药物中的应用，属于医学制药技术领域。
背景技术
单核细胞增生李斯特菌(单增李斯特菌)是一种革兰氏阳性、兼性食源性致病菌，是李斯特菌病的病原体。李斯特菌病以人和动物的胃肠炎、脑膜炎、流产等为主要特征，单增李斯特菌对极端环境(如低pH值、高浓度盐或低温)具有强抵抗力使其更容易造成食源性感染，给家畜养殖业造成重大经济损失。分选酶A(SrtA)是一种广泛存在于单增李斯特菌和其他革兰氏阳性病原菌中的半胱氨酸转肽酶，是单增李斯特菌的重要毒力因子之一。SrtA的催化活性参与了许多表面蛋白锚定于细胞壁上的过程，这些表面蛋白与细菌的黏附和生物被膜的形成等毒力密切相关。因此，SrtA在单增李斯特菌致病性中的关键作用使得其成为抗单增李斯特菌感染的抗毒力药物开发的重要潜在靶标。
传统的抗生素通过干扰细菌生长过程中的关键环节，进而起到杀菌或抑菌的目的，在这种治疗策略的压力下各种耐药菌不断地出现。为了避免细菌耐药或让耐药菌恢复对抗生素敏感性，抗毒力策略研究显得尤为重要，抗毒力药物主要通过抑制病原菌的毒力因子的表达或功能，促进宿主天然免疫系统对病原菌的清除。染料木苷，是一种重要的异黄酮化合物，存在于大豆、葛根等多种食用植物中。染料木苷作为一种食品添加剂和膳食补充剂已经变得更加重要，它具有多种生物学特性，例如抗氧化活性，可以保护细胞免受正常新陈代谢中氧化生成的自由基造成的氧化损伤，此外还具有降低骨质疏松症、抗癌、抗氧化、心脏保护、抗凋亡、神经保护、肝脏保护和抗微生物活性等作用。目前，国内外未见染料木苷通过抑制单增李斯特菌分选酶催化活性来抵抗李斯特菌感染的报道。
发明内容
本发明所述染料木苷CAS登录号为529-59-9，分子式为C21H20O10，分子量为432.38。
染料木苷的化学结构式如下：
本研究以单增李斯特菌分选酶为靶点，从天然化合物中筛选得到一种SrtA抑制剂为染料木苷，该抑制剂通过降低SrtA催化活性从而抵抗单增李斯特菌感染。本研究进一步探究其对单增李斯特菌致病力的抑制作用，通过SrtA肽酶活性抑制试验、生物被膜形成抑制实验、细菌内化分析试验，表明染料木苷可有效抑制SrtA催化活性且对单增李斯特菌致病力有一定的抑制作用；体内动物感染试验表明染料木苷对单增李斯特菌感染有良好的治疗效果。
附图说明
图1：染料木苷抑制单增李斯特菌分选酶催化活性；与对照组相比，*表示P<0.05；**表示P<0.01；
图2：染料木苷抑制单增李斯特菌生物被膜形成；与对照组相比，*表示P<0.05；**表示P<0.01；
图3：染料木苷抑制单增李斯特菌的内化；与对照组相比，*表示P<0.05；**表示P<0.01；
图4：染料木苷对单增李斯特菌感染小鼠模型的治疗作用。与感染组相比，*表示P<0.05；**表示P<0.01。
具体实施方式
通过以下实施进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
1.染料木苷对单增李斯特菌分选酶催化活性的影响
本研究通过荧光共振能量转移试验(FRET)检测染料木苷对单增李斯特菌SrtA催化活性的抑制作用。纯化的SrtA蛋白与不同浓度染料木苷(0、2、4和8μg/mL)在37℃下于黑色96孔板中共孵育30分钟，将荧光肽底物(Dabcyl-QALPNTGEE-Edans)加入反应体系中，避光孵育1h，每个样品的荧光强度分别在350nm的激发波长和520nm的发射波长下应用酶标仪测定荧光值，结果见附图1。
结论：本研究通过荧光共振能量转移法检测染料木苷对SrtA酶活性的抑制作用。结果表明染料木苷可剂量依赖性地抑制SrtA的酶活性，其中8μg/mL染料木苷的抑制率可达50％以上。
2.染料木苷对单增李斯特菌生物被膜形成的影响
本研究使用结晶紫染色法对单增李斯特菌形成的生物被膜进行染色，根据结晶紫染色程度分析不同浓度染料木苷对单增李斯特菌生物被膜形成的影响。过夜培养野生型单增李斯特菌株BUG1600及其SrtA基因敲除菌株BUG1777，将对数生长中期细菌悬液(1×108CFU/mL)用1mL新鲜无菌TSB培养基按1:100扩培，加入到含不同浓度染料木苷(0、8、16和32μg/mL)的24孔平底聚苯乙烯微孔板，在30℃、5％CO2下静置培养72h。孵育后，吸出培养基，用1mL无菌PBS轻轻洗涤平板3次。然后将孔板风干并用400μL的0.1％结晶紫染色1小时。吸出多余的染色剂，用无菌蒸馏水洗涤板3次。将24孔板干燥后，每孔加入500μL的33％冰醋酸。使用酶标仪测量OD570nm波长的吸光度，结果取三个平行重复的平均值。结果见附图2。
结论：结晶紫染色的吸光度结果表明，染料木苷浓度依赖性地抑制单增李斯特菌生物被膜的形成。
3.染料木苷对单增李斯特菌内化Caco-2细胞的影响
本研究通过单增李斯特菌内化Caco-2细胞试验，检测不同浓度染料木苷对单增李斯特菌内化的影响。将Caco-2细胞培养在不含抗生素的含10％牛血清的DMEM培养基中，以每孔2×105细胞密度接种于24孔培养板中，于37℃、5％CO2条件下过夜培养。用过夜培养的单增李斯特菌(BUG 1600和BUG 1777)感染Caco-2细胞，MOI为50，并与不同浓度的染料木苷(0，4，16和64μg/mL)共培养。培养3h后更换含50μg/mL庆大霉素的新鲜培养基孵育30min，用无菌PBS洗涤3次。加入无菌水裂解细胞，稀释后接种计数。结果见附图3。
结论：通过单增李斯特菌内化分析试验初步评价染料木苷对单增李斯特菌内化的影响，结果显示不用浓度染料木苷作用3h内，单增李斯特菌内化Caco-2细胞程度随染料木苷浓度增大呈递减趋势。
4.染料木苷对单增李斯特菌小鼠感染模型的治疗作用
将单增李斯特菌(BUG 1600)过夜培养，扩大培养在新鲜TSB(1：100)中至对数生长中期(OD600nm＝0.8)。用无菌PBS清洗两次后，将细菌重悬于无菌PBS中，调整细菌悬液浓度为4×107CFUs/mL。取20只BALB/c小鼠(雌性，约20g)，分为感染组和治疗组，每组10只，每只小鼠腹腔注射100μL菌悬液，治疗组感染2h后再皮下注射25mg/kg DMSO配制的染料木苷，间隔8小时给药一次，感染组同时皮下注射等体积不含药的DMSO。感染48h后取小鼠肝脏，称量后用2％Triton X-100在PBS中裂解，稀释后接种于TSB琼脂平板上，37℃培养后计数。结果见附图4。
结论：小鼠腹腔注射4×107CFUs/mL单增李斯特菌建立全身感染模型，结果显示染料木苷治疗组小鼠肝脏的细菌定殖量明显低于感染组小鼠肝脏的细菌定殖量，表明染料木苷对单增李斯特菌感染有良好的治疗效果。