跨膜丝氨酸蛋白酶2抑制剂在制备治疗和/或预防冠状病毒感染药物中的用途

文档序号:1823127 发布日期:2021-11-12 浏览:5次 >En<

阅读说明:本技术 跨膜丝氨酸蛋白酶2抑制剂在制备治疗和/或预防冠状病毒感染药物中的用途 (Use of transmembrane serine protease 2 inhibitors for the treatment and/or prophylaxis of coronavirus infections ) 是由 余伯阳 刘秀峰 梅杰 于 2021-10-14 设计创作,主要内容包括:本发明公开了跨膜丝氨酸蛋白酶2抑制剂在制备治疗和/或预防冠状病毒感染药物中的用途。本发明通过亲和垂钓及活性导向分离获得3种化合物,证实该类化合物可以直接地与跨膜丝氨酸蛋白酶2结合,K-(D)&lt;13μM,且能够显著抑制跨膜丝氨酸蛋白酶2的催化活性。在细胞水平上可以有效的抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2假病毒入侵,表明该类化合物对于制备治疗和/或预防病毒感染药物具有非常积极的作用。化合物1 化合物2 化合物3。(The invention discloses application of a transmembrane serine protease 2 inhibitor in preparing a medicament for treating and/or preventing coronavirus infection. The invention obtains 3 compounds through affinity fishing and activity guiding separation, proves that the compounds can be directly combined with transmembrane serine proteinase 2, K D &lt;13 mu M, and can obviously inhibit the catalytic activity of transmembrane serine protease 2. The compound can effectively inhibit the invasion of a novel coronavirus SARS-CoV-2 pseudovirus at a cellular level, and shows that the compound has very positive effect on preparing medicaments for treating and/or preventing virus infection. Compound 1 Compound 2 Compound3。)

跨膜丝氨酸蛋白酶2抑制剂在制备治疗和/或预防冠状病毒感 染药物中的用途

技术领域

本发明涉及药物用途,特别涉及跨膜丝氨酸蛋白酶2抑制剂在制备治疗和/或预防冠状病毒感染药物中的用途。

背景技术

耐药病毒和新病毒的出现凸显了对新型抗病毒方法和药物的需求。然而由于病毒容易突变,使得针对病毒自身靶点的药物开发成为难点。因此,靶向宿主因子成为一种相对较新的抗病毒药物开发策略,可以减少或避免逃逸突变体的出现。

跨膜丝氨酸蛋白酶2(transmembrane serine proteinase 2,TMPRSS2)是Ⅱ型丝氨酸蛋白酶(TTSPs)家族的成员之一。近些年来,众多研究表明TMPRSS2参与的病毒包膜蛋白水解,成为多种类型病毒进入细胞的共同关键步骤之一。冠状病毒入侵细胞时,TMPRSS2切割冠状病毒棘突蛋白(Spike,S)使其活化,从而促进病毒与细胞膜的融合。TMPRSS2是介导影响严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)等冠状病毒侵入细胞的重要环节。现有研究表明TMPRSS2也可结合SARS-CoV或SARS-CoV-2的S蛋白与血管紧张素转化酶2(ACE2)构成的蛋白复合体,进而切割并活化病毒的S蛋白,协助病毒进入细胞。因此,针对病毒入侵共同靶点TMPRSS2开发相关抑制剂,抑制其活性,目前被认为是一种关键的病毒感染治疗策略。

中药具有中医药理论和大量的临床实践作为支撑,其来源广泛,资源丰富,是新药研发的重要来源之一。针对病毒入侵细胞这一共同靶点TMPRSS2,在临床有效中药方剂中筛选高效抑制剂具有重要价值,并为开发或制备成药性强、安全性好的药物提供一定基础。

发明内容

发明目的:本发明目的是提供能够抑制跨膜丝氨酸蛋白酶2的化合物在制备治疗和/或预防冠状病毒感染药物中用途。

技术方案:本发明提供了跨膜丝氨酸蛋白酶2抑制剂在制备治疗和/或预防冠状病毒感染药物中的用途,化合物的结构如下:

化合物1 或

化合物2 或

化合物3。

进一步地,化合物1、化合物2、化合物3对TMPRSS2的半数抑制浓度分别为2.13 mM、1.65 mM和0.39 mM。

进一步地,化合物能特异性地与TMPRSS2结合。所述的化合物可以抑制跨膜丝氨酸蛋白酶2催化水解活性。所述化合物能够抑制病毒入侵靶细胞。

所述的抑制剂在制备治疗和/或预防病毒感染药物中的用途。

进一步地,所述药物剂型为口服给药剂型或非口服给药剂型。

进一步地,所述的口服给药剂型为片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、乳剂或糖浆剂。

进一步地,所述的非口服给药剂型是注射剂。

所述的能够抑制跨膜丝氨酸蛋白酶2的化合物的优选的制备方法,包括如下步骤:

(1)取黄芩饮片适量,粉碎,过筛,用乙醇超声提取。超声结束后抽滤,收集滤液,挥干,再溶解于PBS缓冲溶液中制成混悬液。将混悬液离心除去杂质,收集上清液备用;

(2)将黄芩样品液与表面展示TMPRSS2的毕赤酵母溶液混合,室温孵育后离心,弃去上清,再用PBS缓冲液洗涤沉淀,后加入甲醇溶液超声处理,离心收集上清液为待测样品;

(3)将黄芩样品液与等量野生型毕赤酵母溶液混合,室温孵育后离心,弃去上清,再用PBS缓冲液洗涤沉淀,后加入甲醇溶液超声处理,离心收集上清液为空白样品;

(4)将步骤(2)、(3)获得的待测样品液、空白样品液分别利用高效液相色谱-质谱联用技术检测,分析样品液中浓度显著高于空白滤液中浓度的化合物即为黄芩中的TMPRSS2亲和成分。

由于TMPRSS2参与的病毒包膜蛋白水解,是多种类型病毒进入细胞的共同关键步骤之一。因此,靶向TMPRSS2是一种关键的病毒感染治疗策略。发明人从黄芩中发现3种化合物在分子水平上可以抑制TMPRSS2的催化水解活性。在细胞水平上可以有效地抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2假病毒入侵,所述化合物能直接地与TMPRSS2结合, KD<13 μM。表明该类化合物对于制备治疗和/或预防病毒感染药物具有非常积极的作用。

本发明包括药物组合物,该组合物含有结构式所示化合物或其药学上可接受的盐,或其对应异构体、非对应异构体或外消旋体作为活性成分,以及药学上可接受的赋型剂。所述药学上可接受的赋形剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂或载体。本发明化合物可以与其他活性成分组合使用,只要它们不产生其他的不利作用。

有益效果:本发明的化合物能够结合TMPRSS2,高效抑制其催化水解活性,阻止病毒进入细胞,可用于制备治疗和/或预防病毒感染的药物。

附图说明

图1为黄芩药材提取液的HPLC图谱;

图2为黄芩药材中与TMPRSS2亲和吸附成分(实线)及非特异性吸附成分(虚线)的HPLC图谱;

图3为化合物1剂量依赖性抑制TMPRSS2催化水解活性及半抑制浓度测定结果;

图4为化合物2剂量依赖性抑制TMPRSS2催化水解活性及半抑制浓度测定结果;

图5为化合物3剂量依赖性抑制TMPRSS2催化水解活性及半抑制浓度测定结果;

图6为化合物1与TMPRSS2结合的亲和力测定结果;

图7为化合物2与TMPRSS2结合的亲和力测定结果;

图8为化合物3与TMPRSS2结合的亲和力测定结果;

图9为化合物1对过表达ACE2受体的293T(293T-ACE2)细胞的毒性测定结果;

图10为化合物2对293T-ACE2 细胞的毒性测定结果;

图11为化合物3对293T-ACE2 细胞的毒性测定结果;

图12为化合物1剂量依赖性抑制SARS-CoV-2新型冠状病毒假病毒入侵293T-ACE2细胞测定结果;

图13为化合物2剂量依赖性抑制SARS-CoV-2新型冠状病毒假病毒入侵293T-ACE2细胞测定结果;

图14为化合物3剂量依赖性抑制SARS-CoV-2新型冠状病毒假病毒入侵293T-ACE2细胞测定结果。

具体实施方式

实施例1

本实施例筛选黄芩中TMPRSS2抑制剂的方法

实验方法:酵母表面展示技术(yeast surface display system,YSD)是一种将外源蛋白质进行固定化表达的真核展示系统,将靶蛋白基因与特定载体蛋白基因融合后,再导入酵母宿主细胞,靶蛋白在载体蛋白的引导下表达并定位于酵母细胞表面,此技术既保持了蛋白相对独立的空间构象,又保留了宿主细胞原有的生物学活性。发明人成功构建并培养了表面展示TMPRSS2的毕赤酵母,为后续垂钓实验与酶活力测定实验打下基础。

(1)取黄芩饮片适量,粉碎,过四号筛,称取粉末2 g,加入200 mL 70%乙醇超声提取30 min。超声结束后抽滤,收集滤液,挥干,溶解于200 mL PBS缓冲溶液中,制成10 mg/ml的混悬液。将混悬液以11000 ×g离心10 min,除去杂质,收集上清液备用。经过高效液相色谱分析,黄芩药材提取液的HPLC图谱如图1所示。

(2)将100 μL黄芩样溶液与100 μL表面展示TMPRSS2的毕赤酵母溶液混合,室温孵育后3000 ×g离心5 min。沉淀用PBS缓冲液洗涤3次,后加入200 μL甲醇超声处理30 min,11000 ×g离心10 min,收集上清液为待测样品。

(3)将100 μL黄芩样溶液与100 μL野生型毕赤酵母溶液混合,室温孵育后3000 ×g离心5 min。沉淀用PBS缓冲液洗涤3次,后加入200 μL甲醇超声处理30 min,11000 ×g离心10 min,收集上清液为待测样品。

(4)将步骤(2)、(3)获得的待测样品液、空白样品液分别利用高效液相色谱-质谱联用技术检测,分析样品液中浓度显著高于空白滤液中浓度的化合物即为黄芩中TMPRSS2亲和成分。

其中上述步骤(1)(4)所述高效液相分离条件包括:色谱柱规格为Agilent C18 ,2.7 μm,3.7 mm×250 mm;流动相为0 .1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B);检测波长为254 nm。

表1 HPLC洗脱梯度

时间(min) 流动相A(%) 流动相B(%)
0-20 90-70 10-30
20-45 70-30 30-70
45-52 30-5 70-95
52-61 5-90 95-10
61-70 90 10

实验结果:黄芩药材中与TMPRSS亲和吸附成分(实线)及非特异性吸附成分(虚线)的HPLC图谱如图2所示。峰1、峰2、峰3为样品液中浓度显著高于空白滤液中浓度的物质,即为与跨膜丝氨酸蛋白酶有特异性相互作用的物质。通过HPLC-Q-TOF-MS/MS检测,对比对照品并结合质谱谱图的碎片解析,共鉴定出3个化学成分。结果见表2。

表2 质谱鉴定结构

峰号 化学式 MS MS/MS 鉴别
1 C<sub>21</sub>H<sub>18</sub>O<sub>11</sub> 445.0747 269.0444, 175.0266 黄芩苷
2 C<sub>22</sub>H<sub>20</sub>O<sub>11</sub> 459.0932 283.0616, 268.0348, 175.0208 汉黄芩苷
3 C<sub>15</sub>H<sub>10</sub>O<sub>5</sub> 269.0444 225.0527, 195.0430, 183.0119,151.0527, 117.0359 黄芩素

实施例2

本发明所述化合物抑制TMPRSS2催化水解活性。

实验方法:取表面展示TMPRSS2的毕赤酵母溶液200 μL,分别加入2 μL 不同浓度的化合物1-3。将混合物放置于旋转培养器室温孵育1小时。避光条件下加入Boc-Leu-Gly-Arg-AMC (1mM)底物2 μL,再放置于旋转培养器室温避光旋转孵育1小时。以10000 ×g离心5 min,避光条件下吸取上清液100 μL于新的离心管中,加入100 μL乙腈终止反应。以10000×g离心10 min,取上清液作为待测样品。以表1所述高效液相分离条件,分析酶促反应后产物AMC的含量。使用GraphPad Prism 6 .0软件分析原始数据,并计算相对抑制率。测定值是用三次独立实验的平均值±平均值的标准误差表示。

实验结果:如图3-图5所示,化合物1-3均剂量依赖性抑制TMPRSS2催化水解活性,半抑制浓度分别2.13 mM、1.65 mM和0.39 mM。本发明所述化合物能够高效抑制TMPRSS2催化水解活性。

实施例3

本发明所述化合物与TMPRSS2直接结合。

实验方法:表面等离子共振(SPR)实验。SPR传感技术利用表面等离子体共振的原理,当光耦合到传感芯片时,由于发生表面等离子体共振,一部分光能量被吸收,使得从传感芯片反射的光形成SPR共振信号。SPR共振信号对于传感芯片表面样品物质折射率的变化非常敏感,因此就可以通过分析SPR共振图而获得样品的物质信息。在检测蛋白-蛋白相互作用等生物传感领域有极其重要的应用。

该实验使用BIAcore T200仪器在25℃下进行测试,流动相为磷酸盐缓冲液(pH7.4)。用10 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH值分别为5.5、5.0、4.5及4.0)稀释TMPRSS2重组蛋白至终浓度为20 μg/ml,采用手动进样法进行pH值筛选,选取偶联值最大的pH值进行后续实验。采用氨基偶联法将TMPRSS2重组蛋白偶联到CM5芯片上,以磷酸盐缓冲液为工作缓冲液,用上述筛选所得最佳pH值的10 mmol/L醋酸钠缓冲液稀释TMPRSS2重组蛋白至终浓度为20 μg/ml。芯片表面用0.2 mol/L EDC和50 mmol/L NHS以1:1比例配制的混合液活化,以10μl/min的流速进样,连续进样7 min后注射TMPRSS2重组蛋白溶液,然后以1 mol/L乙醇胺盐酸(pH 8.5)封闭液进样7 min ,封闭活化的芯片表面,并将封闭的空白通道用作测定的阴性对照。实验选取最高浓度为25 μM的本发明所述化合物作为配体,将配体以两倍连续稀释液注入固定了TMPRSS2重组蛋白生物传感器芯片上。1:1结合模型用于评估结合动力学。用动力学模型,通过BIAcore T200分析软件计算KD值。

实验结果:如图6、7、8所示,化合物1与TMPRSS2重组蛋白的亲和力1.70 μM,化合物2与TMPRSS2重组蛋白的亲和力13.00 μM,化合物3与TMPRSS2重组蛋白的亲和力0.61 μM。动力学分析数据显示,与化合物1或2相比,虽然化合物3与TMPRSS2重组蛋白的亲和力略强,但都在一个数量级上,这一结果提示我们本发明所述化合物骨架是其发挥功能的关键结构,取代基的变化对化合物活性没有明显影响。式Ⅰ/Ⅱ所示的化合物可能均具有该活性。本发明所述化合物与TMPRSS2相互作用。

实施例4

本发明所述化合物抑制SARS-CoV-2新型冠状病毒S蛋白假病毒入侵过表达ACE2受体的293T细胞(293T-ACE2)。

实验方法: SARS-CoV-2新型冠状病毒S蛋白假病毒含有荧光素酶报告基因,当病毒入侵细胞后可通过荧光素酶检测试剂评价荧光素酶的活力。其活力可反应病毒入侵细胞的数量。新型冠状病毒S蛋白与ACE2受体的结合是病毒入侵细胞的关键步骤,因此选择过表达ACE2受体的293T细胞(293T-ACE2)模拟病毒入侵,抑制TMPRSS2水解S蛋白的功能可显著减少病毒入侵靶细胞的数量。

首先采用MTT法,检测各个化合物对细胞的活力的影响,是否具有细胞毒性。将293T-ACE2细胞均匀铺至孔板中,细胞培养使用含10%胎牛血清的DMEM培养基,在37℃、5%CO2条件下培养24小时后,将各种化合物添加到每个孔中,再孵育24小时。然后将293T-ACE2细胞置于100μl含500 μg/ ml MTT的10%FBS-DMEM中。在37℃下孵育4小时后,向每个孔中加入150 μl二甲基亚砜以溶解结晶。使用酶标仪在570 nm处测量吸光度值。随后进行病毒入侵实验,将293T-ACE2细胞均匀铺至孔板中,细胞培养使用含10%胎牛血清的DMEM培养基,在37℃、5%CO2条件下培养,待细胞生长到30%开始进行实验。将相同浓度的SARS-CoV-2新型冠状病毒S蛋白假病毒与不同浓度待测化合物混合后,在37℃孵育6h,随后加入到每个孔中。孵育6h后更换为新鲜培养基。正常培养48h之后,每孔添加与培养基等体积的荧光素酶检测试剂,振摇10 min使细胞完全裂解。后用酶标仪检测化学发光信号,定量检测荧光素酶的表达量,分析病毒入侵293T-ACE2细胞的数量。使用GraphPad Prism 6 .0软件分析原始数据。组间分析采用单因素方差分析,p<0.05被认为具有统计学意义。测定值是用三次独立实验的平均值±平均值的标准误差表示。

实验结果:化合物1-3均可以阻止新型冠状病毒S蛋白假病毒进入293T-ACE2细胞。其中,如图9、10、11所示,化合物1-3均在一定浓度范围内对293T-ACE2细胞活力没有影响,表明该类化合物安全性良好。图12、13、14显示化合物1-3均可以剂量依赖性抑制阻止新型冠状病毒S蛋白假病毒进入293T-ACE2细胞。这些结果均说明本发明所述化合物可抑制TMPRSS2并抑制SARS-CoV-2新型冠状病毒S蛋白假病毒入侵过表达ACE2受体的293T细胞。

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