一种γ-谷氨酰转肽酶的双光子荧光探针及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种γ-谷氨酰转肽酶的双光子荧光探针及其制备方法和应用 (Two-photon fluorescent probe of gamma-glutamyl transpeptidase, and preparation method and application thereof ) 是由 霍瑞锦 刘卫敏 吴加胜 汪鹏飞 于 2020-04-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种γ-谷氨酰转肽酶的双光子荧光探针,其特征在于,具有通式(IA)或(IB)所示的结构,是将对γ-谷氨酰转肽酶GGT特异性反应的靶向基团GSH修饰到简单荧光分子上得到的。该荧光探针在识别GGT的过程中,会形成六元环状化合物,其具有的刚性结构使探针具有双光子效应,与癌细胞中过表达的GGT作用时,光学信号发生显著变化,从而达到了靶向检测区分癌细胞和正常细胞的目的。同时,该双光子荧光具有水溶性好、灵敏度高、反应快速、且具有双光子激发的优势,具有较好的应用前景。(The invention discloses a two-photon fluorescent probe of gamma-glutamyl transpeptidase, which is characterized in that the two-photon fluorescent probe has a structure shown in a general formula (IA) or (IB), and is obtained by modifying a targeting group GSH which reacts specifically with gamma-glutamyl transpeptidase GGT onto a simple fluorescent molecule. The fluorescent probe can form a six-membered cyclic compound in the process of identifying GGT, the rigid structure of the six-membered cyclic compound enables the probe to have a two-photon effect, and when the six-membered cyclic compound acts with the over-expressed GGT in cancer cells, optical signals are obviously changed, so that the aim of distinguishing the cancer cells from normal cells through targeted detection is fulfilled. Meanwhile, the two-photon fluorescence has the advantages of good water solubility, high sensitivity, quick reaction, two-photon excitation and good application prospect.)
技术领域
本发明涉及荧光标记技术领域。更具体地，涉及一种γ-谷氨酰转肽酶的双光子荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
γ-谷氨酰转肽酶(GGT)是一种细胞表面结合酶，可选择性催化谷胱甘肽(GSH) 和γ-谷氨酰化合物中的γ-谷酰胺键的裂解，在调节细胞GSH和半胱氨酸稳态中起着重要作用。GGT作为一种在肺癌、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤细胞中都过度表达的谷氨酰转肽酶，在肿瘤细胞的增殖、转移与代谢过程中都发挥着重要的生物学功能，可以作为一种重要的癌症诊断生物标志物和治疗靶点。因此，通过检测GGT 酶活性，对肿瘤的早期诊断和预测肿瘤的转移程度具有重要意义。
传统检测GGT酶的方法有比色测定法、高效液相色谱(HPLC)和电化学等。其中，比色测定法检测精准度低，HPLC测定虽然具有较高的准确性，但是相对耗时、并且检测费用高；电化学检测对GGT检测具有较高的灵敏度和速度，但其操作相对复杂，并且这些方法都无法对活细胞中的GGT进行实时成像。荧光成像方法基于其具有高灵敏度、快速响应、无损检测和实时空间成像等优点，被认为是GGT检测的理想方法。迄今为止，一些单光子荧光探针已用于GGT活性的检测，但是由于自发荧光、光漂白现象和浅穿透深度的干扰以及短波长激发光对细胞组织的损伤等问题，限制了其在深层组织成像中的实际应用。双光子荧光探针可以将荧光背景最小化，光损伤减少，有更好的三维空间定位和增加的穿透深度。双光子技术在未来光电子集成、生物分子探测、医学诊断等领域具有巨大应用潜力和广阔应用前景。
因此，开发用于检测活细胞和深层组织中GGT的双光子荧光探针具有重要的科学和实际意义。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种γ-谷氨酰转肽酶的双光子荧光探针，该类探针对细胞及血液中的GGT的检测具有高灵敏度和选择性，低细胞毒性和检测限。
本发明的第二个目的在于提供一种γ-谷氨酰转肽酶的双光子荧光探针的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供一种γ-谷氨酰转肽酶的双光子荧光探针的应用。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
第一方面，本发明提供一种γ-谷氨酰转肽酶的双光子荧光探针，具有通式(IA)或(IB)所示的结构：
式(IA)和(IB)中，取代基R1-R5各自独立的为-H、-F、-Cl、-Br、-I、氰基、硝基、磺酸基；X为羟基或甘氨酸基。
本发明提供的化合物(IA)和化合物(IB)是由将GGT反应特异性的靶向基团谷胱甘肽(GSH)修饰到简单小分子探针上得到的，在γ-谷酰胺转移酶作用下，发生分子内环化级联反应，形成六元环化合物：
本发明提供的荧光探针与GGT反应后的产物分子上同时具有强吸电子基团和强给电子基团，且环状结构增加了其分子构象的刚性，使其具有双光子特性。
第二方面，本发明提供一种双光子荧光探针的合成方法，包括如下过程：将化合物(IIA)和谷胱甘肽GSH按一定比例溶解于有机溶剂中，室温下搅拌反应0.5小时，加入三乙胺溶液，室温下继续搅拌反应，得到单取代产物(IA)和双取代产物(IB)；
其中，取代基R1-R5各自独立的为-H、-F、-Cl、-Br、-I、氰基、硝基、磺酸基；X 为羟基或甘氨酸基。
在本发明提供的制备方法中，化合物(IA)和化合物(IB)是同时生成的，通过控制原料化合物(IIA)和谷胱甘肽的摩尔比以及反应时间，可以得到不同的主产物化合物(IA)或化合物(IB)。
可选地，所述有机溶剂中化合物(IIA)和谷胱甘肽的摩尔比为1:1-4。
可选地，所述有机溶剂中化合物(IIA)的浓度为1-3mM，谷胱甘肽的浓度为 1-12mM。
可选地，三乙胺溶液的浓度为1-12mM。加入三乙胺溶液可以提供碱性条件。
可选地，加入三乙胺溶液后，室温下继续搅拌反应的时间为1-8小时。
优选地，当有机溶剂中化合物(IIA)和谷胱甘肽的摩尔比为1:1-2，加入三乙胺溶液后，室温下继续搅拌反应的时间为1-4小时，产物主要为化合物(IA)。
优选地，当有机溶剂中化合物(IIA)和谷胱甘肽的摩尔比为1:3-4，加入三乙胺溶液后，室温下继续搅拌反应的时间为5-8小时，产物主要为化合物(IB)。
可选地，所述有机溶剂选自二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、三乙胺、甲醇、乙醇、丙酮及甲苯中的一种或多种。
本发明提供的双光子荧光探针是将GGT反应特异性的靶向基团谷胱甘肽(GSH) 修饰到简单小分子探针上得到的，合成步骤少，反应反应时间短、提纯方便、工艺简单。
本发明第三个方面提供了上述双光子荧光探针的应用。
可选地，所述γ-谷氨酰转肽酶的双光子荧光探针在测定γ-谷氨酰转肽酶含量中的应用。
本发明提供的双光子荧光探针能够在溶液中选择性识别γ-谷氨酰转肽酶GGT，且反应速度快、灵敏度高，同时还具有双光子检测的优势，其浓度线性检测范围为0-60 U/L，检测限为0.115U/L。
可选地，所述γ-谷氨酰转肽酶的双光子荧光探针在制备识别癌细胞试剂中的应用。
本发明中的双光子荧光探针在溶液中以荧光强弱的变化来检测γ-谷氨酰转肽酶的活性，并且在可见光下能观察出前后溶液颜色的变化(溶液颜色从无色变为黄绿色)，在细胞层面能够分别通过单光子和双光子荧光成像区分癌细胞(GGT过表达的细胞) 和正常细胞。同时，该双光子荧光探针对GGT的选择具有专一性，其他阴阳离子、氨基酸及生物体内酶对于本发明所述化合物的发光能力几乎无影响。
本发明的有益效果如下：
本发明中γ-谷氨酰转肽酶的双光子荧光探针是将对γ-谷氨酰转肽酶GGT特异性反应的靶向基团GSH修饰到简单荧光分子上得到的。该荧光探针在识别GGT的过程中，会形成六元环状化合物，其具有的刚性结构使探针具有双光子效应，与癌细胞中过表达的GGT作用时，光学信号发生显著变化，从而达到了靶向检测区分癌细胞和正常细胞的目的。同时，该双光子荧光具有水溶性好、灵敏度高、反应快速、且具有双光子激发的优势，具有较好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出实施例1中荧光探针(IA-1)在PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中与GGT作用后的(A)紫外吸收光谱和(B)荧光发射光谱图。
图2示出实施例6中荧光探针(IB-1)在PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中与GGT作用后的(A)紫外吸收光谱和(B)荧光发射光谱图。
图3示出实施例1中荧光探针(IA-1)对GGT的选择性识别(Pho(1mM),Apr(1 mM),Glu(1mM),Try(1mM)；GGsTOP(200μM)+GGT(300U/L),GGT(300U/L), Mg2+(2mM),Na+(20mM),K+(20mM),Zn2+(2mM),Al3+(2mM),Ca2+(2mM),Cu2+(2 mM)和NH4+(2mM))。
图4示出实施例6中荧光探针(IB-1)对GGT的选择性识别(Pho(1mM),Apr(1 mM),Glu(1mM),Try(1mM)；GGsTOP(200μM)+GGT(300U/L),GGT(300U/L), Mg2+(2mM),Na+(20mM),K+(20mM),Zn2+(2mM),Al3+(2mM),Ca2+(2mM),Cu2+(2 mM)和NH4+(2mM))。
图5示出实施例1中荧光探针(IA-1)的荧光强度与GGT浓度的线性关系。
图6示出实施例6中荧光探针(IB-1)的荧光强度与GGT浓度的线性关系。
图7示出实施例1中荧光探针(IA-1)在HUVEC、OVCAR3和SKOV-3细胞中单光子细胞成像图。
图8示出实施例6中荧光探针(IB-1)在HUVEC、OVCAR3和SKOV-3细胞中单光子细胞成像图。
图9示出实施例1中荧光探针(IA-1)在OVCAR3(A)和HUVEC(B)细胞中双光子细胞成像图。
图10示出实施例6中荧光探针(IB-1)在OVCAR3(A)和HUVEC(B)细胞中双光子细胞成像图。
具体实施方式
为使本发明的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例1：双光子荧光探针(IA-1)的合成
将2×10-5mol四氟对苯二腈和3×10-5mol L-谷胱甘肽溶于20mL DMF中。室温下搅拌0.5h，然后缓慢加入4×10-5mol三乙胺溶液到反应体系中，室温下搅拌3小时，反应溶液变为黄色。在真空条件下除去溶剂，通过反向硅胶C18分离产物得到淡黄色固体即为化合物(IA-1)。1H NMR(D2O,400MHz):δ4.40(S,1H),3.92(m,3H), 3.62-3.58(m,1H),3.29-3.23(m,1H),2.60-2.57(m,2H),2.22-2.19(m,2H).ESI-MS: [M-H]-＝486.07.
实施例2：双光子荧光探针(IA-2)的合成
将2×10-5mol四氟对苯二氯和3×10-5mol L-谷胱甘肽溶于20mL DMF中。室温下搅拌0.5h，然后缓慢加入4×10-5mol三乙胺溶液到反应体系中，室温下搅拌2.5小时，反应停止后在真空条件下除去溶剂，通过反向硅胶C18分离产物得到化合物(IA-2)。 ESI-MS:[M-H]-＝504.01.
实施例3：双光子荧光探针(IA-3)的合成
将2×10-5mol四氟对苯二溴和3×10-5mol L-谷胱甘肽溶于20mL DMF中。室温下搅拌0.5h，然后缓慢加入4×10-5mol三乙胺溶液到反应体系中，室温下搅拌3.5小时，反应停止后在真空条件下除去溶剂，通过反向硅胶C18分离产物得到化合物(IA-3)。 ESI-MS:[M-H]-＝591.91.
实施例4：双光子荧光探针(IA-4)的合成
将2×10-5mol四氟对苯二硝基和3×10-5mol L-谷胱甘肽溶于20mL DMF中。室温下搅拌0.5h，然后缓慢加入4×10-5mol三乙胺溶液到反应体系中，室温下搅拌2小时，反应停止后在真空条件下除去溶剂，通过反向硅胶C18分离产物得到化合物(IA-4)。 ESI-MS:[M-H]-＝526.06.
实施例5：双光子荧光探针(IA-5)的合成
将2×10-5mol四氟对苯二氰基和3×10-5mol 5-L-谷氨酰-L-半胱氨酸溶于20mLDMF中。室温下搅拌0.5h，然后缓慢加入4×10-5mol三乙胺溶液到反应体系中，室温下搅拌3小时，反应溶液变为黄色。在真空条件下除去溶剂，通过反向硅胶C18分离产物得到化合物(IA-5)。ESI-MS:[M-H]-＝429.06.
实施例6：双光子荧光探针(IB-1)的合成
将3×10-5mol四氟对苯二腈和9×10-5mol L-谷胱甘肽溶于30mL DMF中。室温下搅拌0.5h，然后缓慢加入9×10-5mol三乙胺溶液到反应体系中，室温下搅拌6小时，反应溶液由无色变为黄色。在真空条件下除去溶剂，通过反向硅胶C18分离产物得到淡黄色固体即为化合物(IB-1)。1H NMR(D2O,400MHz):δ4.43(S,2H),3.96(m,6H), 3.75-3.64(m,2H),3.34-3.28(m,2H),2.64-2.52(m,4H),2.22-2.17(m,4H).ESI-MS: [M-H]-＝773.14.
实施例7：双光子荧光探针(IB-2)的合成
将3×10-5mol四氟对苯二氯和9×10-5mol L-谷胱甘肽溶于30mL DMF中。室温下搅拌0.5h，然后缓慢加入9×10-5mol三乙胺溶液到反应体系中，室温下搅拌7小时，反应停止后在真空条件下除去溶剂，通过反向硅胶C18分离产物得到化合物(IB-2)。 ESI-MS:[M-H]-＝791.09.
实施例8：双光子荧光探针(IB-3)的合成
将3×10-5mol四氟对苯二溴和9×10-5mol L-谷胱甘肽溶于30mL DMF中。室温下搅拌0.5h，然后缓慢加入9×10-5mol三乙胺溶液到反应体系中，室温下搅拌8小时，反应停止后在真空条件下除去溶剂，通过反向硅胶C18分离产物得到化合物(IB-3)。 ESI-MS:[M-H]-＝878.99.
实施例9：双光子荧光探针(IB-4)的合成
将3×10-5mol四氟对苯二硝基和9×10-5mol L-谷胱甘肽溶于30mL DMF中。室温下搅拌0.5h，然后缓慢加入9×10-5mol三乙胺溶液到反应体系中，室温下搅拌5小时，在真空条件下除去溶剂，通过反向硅胶C18分离产物得到化合物(IB-4)。ESI-MS:[M-H]-＝813.13.
实施例10：双光子荧光探针(IB-5)的合成
将3×10-5mol四氟对苯二氰基和9×10-5mol 5-L-谷氨酰-L-半胱氨酸溶于30mLDMF中。室温下搅拌0.5h，然后缓慢加入9×10-5mol三乙胺溶液到反应体系中，室温下搅拌6小时，反应溶液由无色变为黄色。在真空条件下除去溶剂，通过反向硅胶C18分离产物得到化合物(IB-5)。ESI-MS:[M-H]-＝659.11.
试验例1
荧光探针分子(IA-1)和(IB-1)分别与GGT作用后的吸收光谱和荧光光谱的变化。
将得到的探针溶于DMSO中配成1×10-2M的储备液，用PBS稀释至100μM。称量γ-谷氨酰转肽酶溶于PBS溶液，配成300U/L储备溶液。用比色皿取2mL以上浓度的探针与GGT，恒温条件下测试紫外吸收变化和荧光强度变化，激发波长为405nm。结果参看图1和图2。
从图1中可以看出在GGT存在的条件下，荧光探针分子(IA-1)在340nm处的吸收带逐渐下降，同时在405nm处出现了一个新的吸收峰并随着时间延长逐渐增大。在荧光光谱中，荧光探针分子(IA-1)本身的荧光强度十分微弱，而在加入GGT后，荧光强度显著增强。在图2中可以观察到相同的现象，由此可以看出荧光探针分子 (IA-1)和(IB-1)对GGT识别具有很高的灵敏度。
试验例2
将探针分子(IA-1)和(IB-1)分别加入到GGT溶液、GGsTOP溶液(GGT的抑制剂)、各种金属离子水溶液、以及含各种酶的水溶液以检验探针的稳定性和选择特异性。
由图3和图4中可以得出，与GGT共同孵育的探针的溶液荧光明显增强，但在GGsTOP存在的情况下，荧光被完全抑制，这表明探针的荧光增强确实是由GGT特异性引起的。而探针分子在各种金属离子和酶的水溶液中均没有明显的荧光增强，说明探针分子(IA-1)和(IB-1)具有很好的选择性和稳定性。
试验例3
通过测试不同GGT浓度下与荧光探针分子(IA-1)和(IB-1)反应后的荧光强度检测探针对GGT的线性检测范围与灵敏度。
从图5和图6中可以看出，探针分子(IA-1)对GGT的线性检测范围为1-60U/L，探针分子(IB-1)对GGT的线性检测范围为1-50U/L；检测限通过公式计算得到，探针分子(IA-1)对GGT的检测限为0.115U/L，探针分子(IB-1)对GGT的检测限为0.223U/L。其中，σ为空白检测的标准偏差，k为拟合直线的斜率。
试验例4
通过单光子细胞成像实现荧光探针分子(IA-1)和(IB-1)对肿瘤细胞内的GGT 的识别检测。
以GGT不表达的正常细胞HUVEC细胞为对照组，将荧光探针分子(IA-1)和(IB-1)分别与HUVEC细胞共孵育1h，在405nm激发波长下收集绿色通道的细胞成像。再以GGT过表达的人卵巢癌细胞OVCAR3和SKOV-3细胞为实验组，将荧光探针分子与两种细胞共孵育1h，在405nm激发波长下收集绿色通道的细胞成像。
从图7和图8中观察，对照组的细胞成像绿色信号十分微弱，这是因为细胞内没有GGT的存在，不能与探针分子发生反应产生荧光。实验组的细胞成像可以在绿色通道内观察到明亮的荧光，这些实验结果表明探针分子(IA-1)和探针(IB-1)具有区分正常细胞和过表达GGT的肿瘤细胞的能力。
试验例5
通过双光子细胞成像实现荧光探针分子(IA-1)和(IB-1)对肿瘤细胞内的GGT 的识别检测。
以HUVEC细胞为对照组，将荧光探针分子(IA-1)和(IB-1)分别与HUVEC细胞共孵育1h，双光子激光扫描共聚焦显微镜进行细胞成像在800nm激发波长下收集蓝色、绿色、红色通道的细胞成像。再以GGT过表达的人卵巢癌细胞OVCAR3和SKOV-3 细胞为实验组，将荧光探针分子与两种细胞共孵育1h，在800nm激发波长下收集蓝色、绿色、红色通道的细胞成像。
从图9和图10中观察，实验组卵巢癌细胞OVCAR3的细胞成像可以在三个通道内观察到荧光信号，尤其是红色通道内观察到明亮的荧光，如图A所示。相反，在 HUVEC细胞中未观察到荧光信号，如图B所示。总之，这些共聚焦成像实验表明，探针分子(IA-1)和(IB-1)可以通过单光子和双光子荧光成像有效区分正常细胞和癌细胞。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。