阅读说明：本技术 一种无细胞自组装体系高效合成谷胱甘肽的方法 (Method for efficiently synthesizing glutathione by cell-free self-assembly system ) 是由 李志敏 张星 于 2019-03-07 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种无细胞自组装体系高效合成谷胱甘肽的方法,由重组细胞过量表达腺苷激酶、多聚磷酸激酶和谷胱甘肽双功能合成酶,通过多酶体系有序自组装形成超聚合分子,利用多聚磷酸盐,和少量腺苷,或AMP,或ADP,或ATP,循环催化生成ATP,并将甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸以及生成的ATP生成谷胱甘肽。本发明首次将无细胞自组装体系利用到体外合成谷胱甘肽中,该方法缩短了底物传递距离,提高了反应速率和催化效率,强化了蛋白的热稳定性。不仅实现了谷胱甘肽合成过程中ATP的高效循环再生,降低生产成本；而且操作简单、稳定性强；副反应少、生产速率较高,底物得率接近理论值。(The invention provides a method for efficiently synthesizing glutathione by a cell-free self-assembly system, which comprises the steps of over-expressing adenosine kinase, polyphosphate kinase and glutathione bifunctional synthetase by recombinant cells, forming a super-polymer molecule by orderly self-assembly of a multienzyme system, circularly catalyzing and generating ATP by utilizing polyphosphate and a small amount of adenosine, or AMP, or ADP, or ATP, and generating glutathione from glycine, glutamic acid, cysteine and the generated ATP. The invention utilizes the cell-free self-assembly system to synthesize glutathione in vitro for the first time, and the method shortens the transfer distance of the substrate, improves the reaction rate and the catalytic efficiency and strengthens the thermal stability of the protein. The ATP efficient cyclic regeneration in the glutathione synthesis process is realized, and the production cost is reduced; the operation is simple and the stability is strong; less side reaction, high production rate and high substrate yield.)

一种无细胞自组装体系高效合成谷胱甘肽的方法

技术领域

本发明涉及一种生产谷胱甘肽的方法，具体的讲，是利用一种无细胞自组装体系体外合成谷胱甘肽的酶催化方法。

背景技术

谷胱甘肽(Glutathione，简称GSH)是一种具有重要生理功能的含巯基的化合物，是由L-谷氨酸(L-Glu)、L-半胱氨酸(L-Cys)和甘氨酸(Gly)三个氨基酸组成的三肽。GSH广泛存在于正常的细胞中，参与机体中的一系列反应，是人体细胞内的主要代谢调节物质之一。医药领域中，谷胱甘肽可用于抗辐射、抗肿瘤、抗癌症、抗氧中毒、抗衰老等。食品领域中，谷胱甘肽可用于改善食品质量和风味，延长保质期等方面。谷胱甘肽现还应用于化妆品、运动营养、保健品等行业，具有广泛的工业应用前景。

微生物发酵生产GSH是应用最广泛的方法，已有很多研究是关于利用重组酿酒酵母或重组大肠杆菌，优化培养基及发酵调控策略，提高GSH产量。发酵法制备谷胱甘肽的瓶颈是转化效率低，后处理复杂，产品收率较低。

专利号CN200510122930.5公开了“一种促进微生物酶法合成谷胱甘肽的方法”。其提供了利用微生物细胞酶法合成谷胱甘肽的技术。该方法以培养的重组大肠杆菌E.coliWSH-KE1细胞作为酶源，通过向反应体系中直接添加低浓度的有机溶剂或表面活性剂，以降低细胞外膜的通透性屏障，在三磷酸腺苷(ATP)存在下催化L-Glu，L-Cys和Gly合成谷胱甘肽，反应2小时谷胱甘肽合成量可达4.8g/L。该反应过程中需要加入大量昂贵的ATP，成本较高，因此不利于工业化生产。

专利号CN201210201691.2提供了一种“酶法制备谷胱甘肽的方法”，该方法将合成GSH的两步反应，即生成γ-谷氨酰半胱氨酸的反应和生成GSH的反应，分别在不同的反应罐中进行，并且每步反应之后都分离出反应使用的酶即γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH-I)和谷胱甘肽合成酶(GSH-II)，使得GSH I和GSH II两种酶的酶活力得到最大程度利用，降低了两种酶促反应之间的相互抑制。一次循环GSH产量可达8g/L。该发明方法实现了GSH I和GSHII的循环利用，并且使用了适合制备GSH的反应所需的酵母ATP再生系统，降低了制备GSH的生产成本，但该方法工艺较复杂，操作成本较高。

专利号CN201310538982.5提供了“一种生产谷胱甘肽的方法”，通过重组表达谷胱甘肽合成酶和乙酸激酶，以乙酰磷酸盐为供体实现ATP循环再生，并催化L-Glu，L-Cys和Gly合成谷胱甘肽。该发明方法实现了ATP的循环再生，进一步降低了ATP直接添加的成本，和酵母ATP再生系统比较，提高了ATP再生效率，但是乙酰磷酸盐仍然较为昂贵，并且不稳定。

在谷胱甘肽的合成反应中，每生成1分子谷胱甘肽，需要提供2分子ATP，ATP供给是工艺选择的首要考虑因素之一。同时如何最大化增加底物利用率以及简化操作，降低成本等都是考虑因素。利用微生物酶系胞内合成谷胱甘肽，存在着原料成本高、底物运输和混合限制导致反应速率较慢，和底物、产物的降解等诸多问题。无细胞体外合成具有反应速率快，底物转化率高，利于后续分离等特点，因此本领域既需要研究成本低廉、易于操作的能量供给系统进行谷胱甘肽的高效合成，又需要提高反应速率和效率。

发明内容

本发明的目的在于，为了提高产物合成效率和底物转化率，降低谷胱甘肽生产成本，提供一种无细胞自组装体系高效合成谷胱甘肽的方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种无细胞自组装体系高效合成谷胱甘肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)培养含有带组装接头的多聚磷酸激酶和谷胱甘肽双功能合成酶基因的重组细胞，使含接头的多聚磷酸激酶和含接头的谷胱甘肽双功能合成酶获得过量表达；

(2)收获步骤(1)细胞获得细胞破碎液，对酶系进行胞内自组装或胞外自组装；

(3)添加多聚磷酸盐，以及AMP或ADP或ATP中的一种或多种，由自组装体系中的多聚磷酸激酶利用多聚磷酸盐，AMP和/或ADP循环催化生成ATP，经自组装体系中的谷胱甘肽双功能合成酶作用，在体外将甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸以及合成的ATP生成谷胱甘肽。

作为一个优选方案，一种无细胞自组装体系高效合成谷胱甘肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)培养含有带组装接头的多聚磷酸激酶、腺苷激酶和谷胱甘肽双功能合成酶基因的重组细胞，使含接头的多聚磷酸激酶、含接头的腺苷激酶和含接头的谷胱甘肽双功能合成酶获得过量表达；

(2)收获步骤(1)细胞获得细胞破碎液，对酶系进行胞内自组装或胞外自组装；

(3)添加多聚磷酸盐和腺苷，以及AMP或ADP或ATP中的一种或多种，由自组装体系中的多聚磷酸激酶和腺苷激酶利用多聚磷酸盐，腺苷，AMP和/或ADP循环催化生成ATP，经自组装体系中的谷胱甘肽双功能合成酶作用，在体外将甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸以及合成的ATP生成谷胱甘肽。

作为一个优选方案，所述多聚磷酸激酶可以是PPK1，也可以是PPK2，来源于如下微生物Thermus thermophilus,Thermosynechococcus elongates,Jhaorihellathermophila，Hydrogenophilaceae bacterium，Nocardioides dokdonensis，Haloferaxsulfurifontis，Pseudonocardia thermophile，Roseofilum reptotaenium中的一种。

作为一个优选方案，所述谷胱甘肽双功能酶来源于如下微生物Streptococcusthermophilus，Streptococcus sanguinis，Streptococcus uberis，Streptococcusgordonii，Actinobacillus succinogenes，Actinobacillus pleuropneumoniae，Streptococcus sp.DD12，Streptococcus equinus中的一种。

作为一个优选方案，步骤(3)生成谷胱甘肽的温度为30-60℃。

作为一个优选方案，步骤(3)所述多聚磷酸盐的浓度为1-50毫摩尔每升。

作为一个优选方案，步骤(3)所述多聚磷酸盐包括焦磷酸盐、三聚磷酸盐、四聚磷酸盐、六聚磷酸盐或更高聚合度的多聚磷酸盐。

本发明提供了一种无细胞体外高效合成谷胱甘肽的技术，包括多聚磷酸激酶和谷胱甘肽双功能合成酶的筛选组装，或者多聚磷酸激酶、腺苷激酶和谷胱甘肽双功能合成酶的筛选组装，由多聚磷酸激酶利用多聚磷酸盐和少量AMP或ADP或ATP中的一种或多种，或者多聚磷酸激酶和腺苷激酶利用多聚磷酸盐，少量腺苷，和少量AMP或ADP或ATP中的一种或多种，循环催化生成ATP，经谷胱甘肽双功能合成酶作用，利用组装系统将甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸以及所述生成ATP生产谷胱甘肽。

本发明的无细胞自组装体系中多聚磷酸激酶利用反应体系中的多聚磷酸和初始少量AMP或ADP，合成ATP，供谷胱甘肽双功能合成酶将三种前体合成谷胱甘肽，反应体系的多聚磷酸盐为多聚磷酸激酶(PPK)不断提供合成ATP所需的磷酸基，达到ATP的循环再生。

本发明的无细胞自组装体系利用生物分子间相互作用和底物驱动聚合作用，根据结构进行有序组装，拉近酶在空间上的距离，能够增加反应催化效率，利于热力学平衡走向终产物。在这种组装体中，高浓度的一种底物，可以迅速转化成产物，并转移到邻近的酶作为底物，从而避免了有毒的、不稳定的中间化合物的积累和扩散。这种体系中，相邻的酶之间的距离被缩短至纳米级或者更短，中间物和连接手臂之间的形成的相互作用，类似底物通道，保证中间底物的快速传递，从而使得多酶催化反应的效率最大化。

本发明中的重组菌构建包括：在大肠杆菌中过表达异源的多聚磷酸激酶(PPK)，腺苷激酶(AK)或谷胱甘肽双功能酶(GshF)，得到重组表达菌。

本发明中所述的谷胱甘肽双功能酶来源于琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)。

本发明中所述的腺苷激酶来源于酿酒酵母(Saccharomvces cerevisiae)。

本发明中所述的多聚磷酸激酶包括经过重组菌表达破碎得到的粗酶液；或者经过纯化得到的纯酶。

本发明中所述的谷胱甘肽双功能合成酶包括经过重组菌表达破碎得到的粗酶液；或者经过纯化得到的纯酶。

本发明中所述的腺苷激酶包括经过重组菌表达破碎得到的粗酶液；或者经过纯化得到的纯酶。

本发明中所述的多聚磷酸盐通式为poly(P)n，包括焦磷酸盐、三聚磷酸盐、四聚磷酸盐、六聚磷酸盐或更高聚合度的聚磷酸盐，普通常用的为钾盐和钠盐或直接为其磷酸化合物。

本发明的优点在于，本发明首次将无细胞自组装体系利用到体外合成谷胱甘肽中，该方法缩短了底物传递距离，提高了反应速率和催化效率，强化了蛋白的热稳定性。不仅实现了谷胱甘肽合成过程中ATP的高效循环再生，降低生产成本；而且操作简单、稳定性强；副反应少、生产速率较高，底物得率接近理论值。

附图说明

图1本发明实施例1中合成谷胱甘肽的浓度值。

图2本发明实施例2中合成谷胱甘肽的浓度值。

图3本发明实施例3中合成谷胱甘肽的浓度值。

图4本发明实施例4中合成谷胱甘肽的浓度值。

图5本发明实施例5PPKTE/SS酶比例对GSH合成的影响。

图6本发明实施例6初始ADP浓度对GSH合成的影响。

图7本发明实施例7温度对GSH合成的影响。

图8本发明实施例8polyP浓度对GSH合成的影响。

图9本发明实施例9ADP浓度对MENRs或游离体系催化效率的影响。

图10本发明实施例10组装体和游离酶的稳定性分析。

具体实施方式

以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。

一、谷胱甘肽双功能酶的制备

a.将含有GshF的pET-28a载体用氯化钙法转化至大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中，得到BL21(DE3)/pET28a-GshF。

b.将BL21(DE3)/pET28a-GshF接种至LB培养基中(蛋白胨10g/L，酵母粉5h/L，氯化钠10g/L)，37℃过夜培养后，按1％接种量接种至新鲜LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加入IPTG终浓度至0.2mM，18℃诱导18小时。

c.酶纯化方法：将诱导后菌体，离心收集，利用高压破碎得到粗酶液，离心得到上清液。将上清液通过HisSep Ni-NTA Agarose亲和层析柱纯化。利用0-500mM的咪唑浓度梯度洗脱，通过SDS-PAGE验证纯度，收集120mM咪唑下的流出液，得到纯酶液。蛋白的定量通过BCA试剂盒(天根生化科技有限公司)进行测定。

二、腺苷激酶的制备

来源于Saccharomvces cerevisiae的腺苷激酶基因由合成得到，***质粒pET28a并转化BL21(DE3)，得到BL21(DE3)/pET28a-AK。

腺苷激酶的纯酶液按照方法一的同样步骤制备。

三、多聚磷酸激酶重组菌的构建

来源于Thermus elongatus多聚磷酸激酶(TePPK)基因由合成得到，***质粒pET28a并转化BL21(DE3)，得到BL21(DE3)/pET28a-TePPK。

来源于Jhaorihella thermophila多聚磷酸激酶(JtPPK)基因由合成得到，***质粒pET28a并转化BL21(DE3)，得到BL21(DE3)-JtPPK。

四、无细胞自组装

含有组装接头的等摩尔数的PPK、AK和GshF在20mM Tris-HCl(pH8.0)的缓冲液中25℃混合30min，3000rpm离心10min，用20mM Tris-HCl(pH 8.0)离心洗涤后，2.5mM Tris-HCl(pH 8.0)缓慢重悬。

五、谷胱甘肽的体外合成

利用上述自组装体系，Tris-HCl缓冲体系和Mg²⁺存在下，由多聚磷酸和初始少量ADP或ATP循环利用ATP并再生，利用所述生成的ATP、甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸合成谷胱甘肽。

实施例1

向1mL反应液中加入500mg/L的谷胱甘肽双功能酶，反应液含0.1M的Tris-HCl，20mM甘氨酸，20mM谷氨酸，20mM半胱氨酸，20mM MgCl₂，10mM poly(P)n，2mM腺苷，20％(V/V)多聚磷酸激酶粗酶液，500mg/L的腺苷激酶，反应2h和4h，GSH的产量测定结果见图1。

实施例2

向1mL反应液中加入1g/L的谷胱甘肽双功能酶，反应液含0.1M的Tris-HCl，40mM甘氨酸，40mM谷氨酸，35mM半胱氨酸，2mM ADP，20mM MgCl₂，20mM的poly(P)n，20％(V/V)多聚磷酸激酶粗酶液，反应在每个时间节点取样，测定结果见图2。从图2中可以看出，在添加了20mM的多聚磷酸体系中，谷胱甘肽在21h产量达到了28.6mM，以半胱氨酸计，转化率达到82％。

实施例3

向1mL反应液中加入1.5g/L的谷胱甘肽双功能酶，反应液含有0.1M的Tris-HCl，30mM甘氨酸，30mM谷氨酸，20mM半胱氨酸，2mM ADP，20mM MgCl₂，18mM的poly(P)n，30％(V/V)多聚磷酸激酶粗酶液，反应在2h，4h和6h各取300uL，测定谷胱甘肽产量，结果见图3。从实施例3可以看出，反应6h，谷胱甘肽的浓度达到18.6mM，以半胱氨酸计，转化率达到了93％。本反应在没有加入ATP的情况下，极大缩短了生产成本，提高了转化率。

实施例4

向1mL反应液中加入800mg/L的谷胱甘肽双功能酶(GshF)，反应液含0.1M的Tris-HCl，30mM甘氨酸，30mM谷氨酸，30mM半胱氨酸，20mM MgCl₂，15mM poly(P)n，30％(V/V)多聚磷酸激酶粗酶液，反应在4h和6h各取300uL测定谷胱甘肽产量，测定结果见图4。

实施例5.PPKTE/SS酶比例对GSH合成的影响

向1mL反应液中加入800mg/L的谷胱甘肽双功能酶(GshF)，反应液含0.1M的Tris-HCl，50mM甘氨酸，50mM谷氨酸，50mM半胱氨酸，40mM MgCl₂，15mM poly(P)n，2mM ADP，分别加入不同比例多聚磷酸激酶纯酶，在37℃反应，按不同反应间隔时间，取样50μl，加入三氯乙酸(TCA，终浓度10％，w/v)终止反应，取上清稀释后HPLC测定GSH浓度。测定结果见图5。增加PPKTE的浓度，使得ATP的循环流量增大，因此增加了总反应速率，提高GSH产量。

实施例6.初始ADP浓度对GSH合成的影响

向1mL反应液中加入800mg/L的谷胱甘肽双功能酶(GshF)和等量多聚磷酸激酶纯酶，反应液含0.1M的Tris-HCl，50mM甘氨酸，50mM谷氨酸，50mM半胱氨酸，40mM MgCl₂，15mMpoly(P)n，不同浓度ADP，37℃反应，按不同反应间隔时间，取样50μl，加入三氯乙酸(TCA，终浓度10％，w/v)终止反应，取上清稀释后HPLC测定GSH浓度。，测定结果见图6。

实施例7.温度对GSH合成的影响

向1mL反应液中加入800mg/L的谷胱甘肽双功能酶(GshF)和等量多聚磷酸激酶纯酶，反应液含0.1M的Tris-HCl，50mM甘氨酸，50mM谷氨酸，50mM半胱氨酸，40mM MgCl₂，15mMpoly(P)n，在不同温度下反应，按反应间隔时间，取样50μl，加入三氯乙酸(TCA，终浓度10％，w/v)终止反应，取上清稀释后HPLC测定GSH浓度，结果见图7。在30℃条件下，GSH的合成速率极慢，在37-45℃范围内，GSH的生产效率随着温度升高而升高，在45℃条件下，2h反应即达到最高点，相比于其他条件，反应速率和GSH浓度都最高，分别达到了19.5mM/h和39mM，为GSH催化的最适温度。

实施例8.polyP浓度对GSH合成的影响

向1mL反应液中加入10μM的无细胞组装体系重悬液，反应液含0.1M的Tris-HCl，20mM甘氨酸，20mM谷氨酸，20mM半胱氨酸，20mM MgCl₂，10mM polyP，10μM ADP，分别取5、10、20、40mM polyP初始浓度，在最优酶比例条件下，于37℃反应4h和6h，分析体系中GSH的浓度，结果见图8。当polyP浓度从5mM增至10mM时，6h内GSH的产量从9.7mM增至15.2mM，当polyP浓度增加至20mM时，GSH产量没有增加，说明体系中10mM的polyP足够。但是，当40mMpolyP初始浓度加进去时，GSH的合成速率迅速下降，高浓度的polyP对GSH的合成表现出了抑制作用。

实施例9.ADP浓度对MENRs或游离体系催化效率的影响

向1mL反应液中加入10μM的无细胞组装体系重悬液，反应液含0.1M的Tris-HCl，20mM甘氨酸，20mM谷氨酸，20mM半胱氨酸，20mM MgCl₂，10mM polyP，10μM ADP，于37℃反应1h，0.5M HCl(终浓度)终止反应，分析GSH的合成。对照组：将10μM PPKJT和GshFSS混合孵育后，加入反应液，反应后取样分析GSH合成，结果见图9。组装体系的GSH合成速率都要高于游离体系，也说明了ATP循环效率的提高使得总体催化效率提高。

实施例10.组装体和游离酶的稳定性分析

组装体的稳定性：将组装体MENRs和等量的GshF-PPK体系在37℃下孵育不同时间，间隔取出每管，按照检测GSH的方法检测其残余活力。以初始合成GSH的活力定义为100％，结果见图10。组装体在37℃孵育24h，游离体系还剩66％的活性，而组装体系活力无变化，48h后，游离体系仅剩下49％的活性，而组装体系还剩下95％的活性，比游离体系提高了46％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。