一种采用发酵法生产谷胱甘肽的新方法
阅读说明：本技术 一种采用发酵法生产谷胱甘肽的新方法 (Novel method for producing glutathione by adopting fermentation method ) 是由 夏颖 贾伟 周雪美 王水淋 于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种采用发酵法生产谷胱甘肽的新方法,包括斜面菌种的制备、培养基的选择、发酵条件的优化和目标产物的提取精制等工艺步骤,本发明通过毕赤酵母菌(P.pastoris)发酵转化生产谷胱甘肽,具有生产成本低,生产原料来源简单易得,生产过程中不使用有机溶剂,发酵过程也不产生有毒有害的物质,具有工艺过程简单,生产操作安全等优点,且其发酵时间快,生产的的谷胱甘肽产量高、质量好。(The invention provides a novel method for producing glutathione by adopting a fermentation method, which comprises the process steps of preparation of slant strains, selection of a culture medium, optimization of fermentation conditions, extraction and refining of a target product and the like.)
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是指一种采用发酵法生产谷胱甘肽的新方法。
背景技术
谷胱甘肽(GSH)是一种具有重要生理功能的由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽。谷胱甘肽广泛分布于动物、植物、微生物中，参与蛋白质和核糖核酸的合成，氧及营养物质的运输，维持内源酶的活力，体内三羧酸循环及糖代谢，清除体内过多自由基等。临床上谷胱甘肽用于抗辐射、抗肿瘤、抗氧中毒、抗衰老和协调内分泌的治疗。此外谷胱甘肽也被用作食品添加剂，用来延长食品的保质期和强化食品中的氨基酸成分。还原型谷胱甘肽是1995年日本协和发酵株式会社和日本山之内株式会社研制成功并上市第一个获得日本JFDA批准生产的肝病药品，因其疗效确切，成为肝病疗法最基本的组合成分。谷胱甘肽作为抗肝病药物的关键中间体, 将极具经济前景。
目前，谷胱甘肽主要的生产方法有提取法、化学合成法、发酵法和酶法。其中，中国发明专利号CN102093468A公布了一种还原型谷胱甘肽的合成方法，但该合成工艺使用了大量的有机溶剂***、苯甲醇、四氢呋喃、石油醚、氯化亚砜等，对环境污染有一定的影响；中国发明专利号 CN102586369A公布了一种利用重组大肠杆菌发酵生产谷胱甘肽的方法，但发酵时间有点偏长，又是细胞内产物，含量不高，其次大肠杆菌是致病菌，对人体有害，生产安全性差；而国外谷胱甘肽的制备方法主要是通过以糖苷酶为催化剂，催化合成谷胱甘肽，所以生产的谷胱甘肽成本很高，且采用上述方法制备的谷胱甘肽产率不高，给实际推广应用带来了很大困难。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明目的在于提供一种采用发酵法生产谷胱甘肽的新方法，采用微生物发酵法生产谷胱甘肽，以葡萄糖为底物，采用微生物转化法将底物转化为谷胱甘肽，其具有工艺优势，操作方法简单，生产成本下降，环境污染少等优势，且其发酵时间快，生产的的谷胱甘肽产量高、质量好。为实现上述之目的，本发明采取如下技术方案：
(二)技术方案
一种采用发酵法生产谷胱甘肽的新方法，用毕赤酵母菌(P.pastoris)发酵生产谷胱甘肽，生产过程由下列工艺步骤组成：
(1)将毕赤酵母菌(P.pastoris)菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；
(2)将斜面菌种扩大培养作为种子液；
(3)将种子液接入发酵罐中进行发酵得到发酵液；
(4)加入反应物组分葡萄糖等；
(5)谷胱甘肽的分离纯化。
进一步，所述(1)步骤中的斜面培养基由下列重量份组分组成：酵母膏5-40份、葡萄糖5-40份、氨水0-40份、大豆蛋白胨3-30份、硫酸铵0-40 份、氯化钾0-3份、尿素0-5份、磷酸氢二铵0-10份、硫酸镁0-5份、甘油 0-10份、谷氨酸钠0-5份、甘氨酸0-5份、半胱氨酸0-5份和水适量。
进一步，所述斜面菌种的制备工艺条件为：pH值为4.0-7.5、温度 25-40℃、培养时间12-36小时。
进一步，所述(2)步骤中的种子液由下列重量份组分组成：葡萄糖 40-80份、氨水0-40份、尿素0.1-5份、硫酸铵20-40份、磷酸氢二铵1-10 份、氯化钾0.1-5份、硫酸镁0.1-5份、酵母膏1-20份、谷氨酸钠0.1-5份、甘氨酸0.1-5份、半胱氨酸0.1-5份和水1000份。
进一步，所述(3)步骤中发酵的工艺条件为：种子液接种量为6-12％，pH值为4.0-7.5，培养温度为25-40℃，通风量为10-300m3/h，搅拌转速为 350-450转/分钟，培养时间为12-36小时。
进一步，所述(4)步骤中的反应条件为：葡萄糖物质量浓度为 100-200mmol/l，反应温度为20-40℃，反应时间为24-48小时，搅拌转速为 160-200转/分钟。
进一步，所述(5)步骤中的谷胱甘肽的分离纯化包括以下六个步骤：
a、将发酵完成后的发酵液菌体细胞破壁；
b、把经过a步骤后的发酵液通过膜过滤技术去除菌渣蛋白质等杂质；
c、把经过b步骤后的浓缩液进行铜盐反应。
d、把经过c步骤后进行硫化氢反应；
e、把经过d步骤的反应液进行过滤分离纯化；
f、把经过e步骤的浓缩液结晶干燥，即可得到纯度为98％以上的谷胱甘肽。
进一步，所述a步骤发酵液菌体细胞破壁；b步骤中的过滤膜为陶瓷膜或有机膜或纳滤膜；e步骤中的过滤分离技术采用大孔吸附树脂柱或阳离子树脂或模拟移动床色谱；f步骤过滤后的溶液经过浓缩、干燥，真空干燥真空度为0.05-0.5Mpa，温度为65℃，干燥后的成品纯度达99％以上。
(三)有益效果
本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果，具体而言，通过对毕赤酵母菌(P.pastoris)选用合适的培养基在最适培养条件下培养一定时间，加入反应物酵母膏与葡萄糖，在最佳反应条件下发酵生产谷胱甘肽，发酵液通过大孔吸附树脂柱的分离、纯化后，可得到高纯度的谷胱甘肽。
本发明采用微生物发酵法生产谷胱甘肽，以葡萄糖为底物，采用微生物转化法将底物转化为谷胱甘肽，再使用膜过滤、膜浓缩等分离纯化工艺，获得高纯度的谷胱甘肽，具有工艺优势，操作方法简单，生产成本下降，环境污染少等优势，且其发酵时间快，生产的的谷胱甘肽产量高、质量好。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
(1)菌种斜面培养
将毕赤酵母菌(P.pastoris)菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；其中菌种斜面培养基由下列重量份组分组成：酵母膏5-40份、葡萄糖5-40份、氨水0-40份、大豆蛋白胨3-30份、硫酸铵0-40份、氯化钾 0-3份、尿素0-5份、磷酸氢二铵0-10份、硫酸镁0-5份、甘油0-10份、谷氨酸钠0-5份、甘氨酸0-5份、半胱氨酸0-5份和水适量。
制备斜面菌种的工艺条件为pH值为4.8、温度27℃、培养时间为18 小时。
(2)接种发酵
将斜面菌株扩大培养作为种子液；再将种子液按6-12％的接种量接入发酵罐中进行发酵得到发酵液；其中种子液由下列重量份组分组成：葡萄糖 40-80份、氨水0-40份、尿素0.1-5份、硫酸铵20-40份、磷酸氢二铵1-10 份、氯化钾0.1-5份、硫酸镁0.1-5份、酵母膏1-20份、谷氨酸钠0.1-5 份、甘氨酸0.1-5份、半胱氨酸0.1-5份和水1000份。
发酵的工艺条件为种子液接种量为10％，pH值为5.0，培养温度为27℃，通风量为18m3/h，搅拌转速为330转/分钟，培养时间为16小时。
(3)生产谷胱甘肽
加入反应物氨水物质量浓度为35mmol/l及葡萄糖物质量浓度为 150mmol/l；其中反应条件为：反应温度为27℃，反应时间为36小时，搅拌转速为180转/分钟。在此反应条件下，谷胱甘肽的发酵单位达7.7g/L。
(4)谷胱甘肽的分离纯化，包括以下六个步骤：
a、将发酵完成后的发酵液菌体细胞破壁；
b、把经过a步骤后的发酵液通过膜过滤技术去除菌渣蛋白质等杂质；
c、把经过b步骤后的浓缩液进行铜盐反应。
d、把经过c步骤后进行硫化氢反应；
e、把经过d步骤的反应液进行过滤分离纯化；
f、把经过e步骤的浓缩液结晶干燥，即可得到纯度为98％以上的谷胱甘肽。
实施例2
(1)菌种斜面培养
将毕赤酵母菌(P.pastoris)菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；其中菌种斜面培养基由下列重量份组分组成：酵母膏5-40份、葡萄糖5-40份、氨水0-40份、大豆蛋白胨3-30份、硫酸铵0-40份、氯化钾0-3份、尿素0-5份、磷酸氢二铵0-10份、硫酸镁0-5份、甘油0-10份、谷氨酸钠0-5、甘氨酸0-5、半胱氨酸0-5和水适量。
制备斜面菌种的工艺条件为pH值为4.8、温度28℃、培养时间为 16小时。
(2)接种发酵
将斜面菌株扩大培养作为种子液；将种子液按6-12％的接种量接入发酵罐中进行发酵得到发酵液；其中种子液由下列重量份组分组成：葡萄糖 40-80份、氨水0-40份、尿素0.1-5份、硫酸铵20-40份、磷酸氢二铵1-10 份、氯化钾0.1-5份、硫酸镁0.1-5份、酵母膏1-20份、谷氨酸钠0.1-5 份、甘氨酸0.1-5份、半胱氨酸0.1-5份和水1000份。
发酵的工艺条件为种子液接种量为10％，pH值为4.5，培养温度为28℃，通风量为20m3/h，搅拌转速为380转/分钟，培养时间为17小时。
(3)生产谷胱甘肽
加入反应物氨水物质量浓度为35mmol/l及葡萄糖物质量浓度为 150mmol/l；其中反应条件为：反应温度为27℃，反应时间为38小时，搅拌转速为170转/分钟。在此反应条件下，谷胱甘肽的发酵单位达7.8g/L。
(4)谷胱甘肽的分离纯化，包括以下四个步骤：
a、将发酵完成后的发酵液菌体细胞破壁；
b、把经过a步骤后的发酵液通过膜过滤技术去除菌渣蛋白质等杂质；
c、把经过b步骤后的浓缩液进行铜盐反应。
d、把经过c步骤后进行硫化氢反应；
e、把经过d步骤的反应液进行过滤分离纯化；
f、把经过e步骤的浓缩液结晶干燥，即可得到纯度为99％以上的谷胱甘肽。
实施例3
(1)菌种斜面培养
将毕赤酵母菌(P.pastoris)菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；其中菌种斜面培养基由下列重量份组分组成：酵母膏5-40份、葡萄糖5-40份、氨水0-40份、大豆蛋白胨3-30份、硫酸铵0-40份、氯化钾0-3份、尿素0-5份、磷酸氢二铵0-10份、硫酸镁0-5份、甘油0-10 份、谷氨酸钠0-5份、甘氨酸0-5份、半胱氨酸0-5份和水适量。
制备斜面菌种的工艺条件为pH值为4.7、温度29℃、培养时间为 19小时。
(2)接种发酵
将斜面菌株扩大培养作为种子液；将种子液按6-12％的接种量接入发酵罐中进行发酵得到发酵液；其中种子液由下列重量份组分组成：葡萄糖 40-80份、氨水0-40份、尿素0.1-5份、硫酸铵20-40份、磷酸氢二铵1-10 份、氯化钾0.1-5份、硫酸镁0.1-5份、酵母膏1-20份、谷氨酸钠0.1-5 份、甘氨酸0.1-5份、半胱氨酸0.1-5份和水1000份。
发酵的工艺条件为种子液接种量为10％，pH值为4.6，培养温度为 29℃，通风量为22m3/h，搅拌转速为390转/分钟，培养时间为17小时。
(3)生产谷胱甘肽
加入反应物氨水物质量浓度为35mmol/l及葡萄糖物质量浓度为 150mmol/l；其中反应条件为：反应温度为28℃，反应时间为36小时，搅拌转速为170转/分钟。在此反应条件下，谷胱甘肽的发酵单位达7.9g/L。
(4)谷胱甘肽的分离纯化，包括以下六个步骤：
a、将发酵完成后的发酵液菌体细胞破壁；
b、把经过a步骤后的发酵液通过膜过滤技术去除菌渣蛋白质等杂质；
c、把经过b步骤后的浓缩液进行铜盐反应。
d、把经过c步骤后进行硫化氢反应；
e、把经过d步骤的反应液进行过滤分离纯化；
f、把经过e步骤的浓缩液结晶干燥，即可得到纯度为99％以上的谷胱甘肽。
以上所述，仅是本发明较佳实施例而已，并非对本发明的技术范围作任何限制，故凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。