全细胞肿瘤纳米疫苗、其制备方法和用途
阅读说明：本技术 全细胞肿瘤纳米疫苗、其制备方法和用途 (Whole-cell tumor nano vaccine, preparation method and application thereof ) 是由 于海军 李天亮 祝奇文 宋润迪 于 2020-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种全细胞肿瘤纳米疫苗、其制备方法和用途。本发明的全细胞肿瘤纳米疫苗是酸敏感聚合物负载免疫佐剂的纳米颗粒表面包被工程化肿瘤细胞膜的纳米疫苗,或酸敏感聚合物-免疫佐剂偶联物的纳米颗粒表面包被工程化肿瘤细胞膜的纳米疫苗,或两者的组合。本发明的全细胞肿瘤纳米疫苗可增强树突状细胞抗原呈递效率,激活多种特异性细胞毒性T淋巴细胞,实现高效的抗肿瘤复发和转移效应,同时有利于实现恶性肿瘤的个性化治疗。(The invention relates to a whole-cell tumor nano vaccine, a preparation method and application thereof. The whole-cell tumor nano vaccine is a nano vaccine with engineered tumor cell membranes coated on the surfaces of acid-sensitive polymer immune adjuvant-loaded nanoparticles, or a nano vaccine with engineered tumor cell membranes coated on the surfaces of acid-sensitive polymer immune adjuvant conjugates, or a combination of the two. The whole-cell tumor nano vaccine can enhance the antigen presentation efficiency of dendritic cells, activate various specific cytotoxic T lymphocytes, realize high-efficiency anti-tumor recurrence and metastasis effects, and is beneficial to realizing the personalized treatment of malignant tumors.)
技术领域
本发明涉及生物医药及肿瘤治疗领域，具体涉及基于工程化肿瘤细胞膜所设计的个性化肿瘤纳米疫苗，其制备方法以及在肿瘤治疗和预防肿瘤复发，转移方面的应用。
背景技术
恶性肿瘤的治疗仍是全球性难题，超过80％的肿瘤患者死于术后的复发和转移，对抗恶性肿瘤复发和转移仍然是临床治疗过程中所面临的重大挑战。近年来，肿瘤免疫疗法在对抗恶性肿瘤复发及转移方面表现出了良好的潜力，其中，肿瘤疫苗发挥了重要作用。常规肿瘤疫苗通过将单一肿瘤相关抗原或抗原肽导入患者体内，激活患者自身免疫系统，产生特异性的抗肿瘤免疫应答，诱导或扩增体内预存的针对靶抗原的细胞免疫和体液免疫反应，并能形成长期的免疫记忆反应，从而达到控制或清除肿瘤的目的。但广泛存在的肿瘤异质性是目前最大的困难之一，不仅仅在肿瘤组织内部，即使是同一种肿瘤类型，在不同患者间也存在着极大的差异，肿瘤疫苗的临床治疗效果存在显著差异性，并且新抗原的获取过程漫长，容易贻误患者术后的最佳治疗时机，这也向快速实施肿瘤个性化治疗提出了挑战。
肿瘤细胞表面通常存在多种抗原，通过将工程化技术所提取肿瘤细胞细胞膜靶向淋巴结，有利于淋巴结中树突状细胞(dendritic cells，DCs)对肿瘤细胞表面抗原的识别，从而促进机体免疫细胞对肿瘤细胞的全面清除，防止肿瘤细胞逃逸的发生；而肿瘤免疫过程中记忆细胞的产生有利于抑制肿瘤的复发与转移过程。考虑到肿瘤细胞表面抗原丰度的差异性，如何有效提高肿瘤抗原提呈效率，激活肿瘤特异性T淋巴的产生，是增强肿瘤疫苗治疗效果的重要保障。干扰素基因刺激物(stimulator of interferon genes，STING)激动剂及Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)激动剂等免疫佐剂，通过作用于树突状细胞，可促进树突状细胞对抗原的交叉呈递过程以激活肿瘤特异性T淋巴细胞；通过促进树突状细胞对炎性细胞因子的分泌，可改善细胞毒性T淋巴细胞活性，增强机体对肿瘤细胞的清除能力。
发明内容
为建立个性化肿瘤治疗体系，预防术后肿瘤复发及转移，本发明的目的在于提供一种可用于肿瘤个性化治疗的全细胞纳米疫苗，及其制备方法和在抗肿瘤免疫治疗方面的应用。
为实现上述目的，一方面，本发明提供一种包含全系列肿瘤相关抗原的全细胞肿瘤纳米疫苗，其是酸敏感聚合物负载免疫佐剂的纳米颗粒表面包被工程化肿瘤细胞膜的纳米疫苗，或酸敏感聚合物-免疫佐剂偶联物的纳米颗粒表面包被工程化肿瘤细胞膜的纳米疫苗，或两者的组合，
其中，所述酸敏感聚合物具有如下式1所示的结构：
所述酸敏感聚合物-免疫佐剂偶联物具有如下式2所示的结构：
在上述式1中，
R1选自羟基、m为10-145的整数，优选地，m为100-140的整数，更优选地，m为113；
R2选自苯基或n为3-12的整数；
R3选自N,N-二乙基氨基、N,N-二丁基氨基、N,N-二异丙基氨基、五亚甲基氨基、六亚甲基氨基中的任一种；
x为20-60的整数，优选40-50的整数，
在上述式2中，
R1、R2和R3以及x的定义分别与式1中定义的相同，
R4选自衍生自免疫佐剂的基团；
Linker为R4与羰基之间的连接基团，该连接基团与羰基之间形成p,π-共轭连接；
y为1-20的整数，优选1-10的整数。
在实施方式中，R3选自N,N-二异丙基氨基、六亚甲基氨基；R2为n为12；x为40、42、50；y为0、3、4或5。
在实施方式中，所述Linker可选自以下结构中的任意一种：
在实施方式中，所述免疫佐剂包含：选自STING激动剂和TLR激动剂中的任意一种，例如可选自以下中的任一种，
在实施方式中，所述R4可选自以下基团中的任意一种：
在实施方式中，所述肿瘤细胞包括但不限于4T-1乳腺癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞、CT-26结肠癌细胞、HCT116结肠癌细胞、B16-F10黑色素瘤细胞或Panc02胰腺癌细胞。
在实施方式中，所述化疗药物包括但不限于奥沙利铂、多柔比星、表柔比星、伊达比星、紫杉醇、多西紫杉、环磷酰胺；所述光动力治疗中所用光敏剂包括但不限于二氢卟吩e6、焦脱镁叶绿酸a、吲哚菁绿；光动力治疗所需激光波长为光敏剂实现光动力治疗所需的最佳波长范围，例如焦脱镁叶绿酸a的光动力治疗所需的激光器波长为671nm。
在实施方式中，所述免疫佐剂在纳米颗粒中的负载量为130wt％。
另一方面，本发明提供一种上述全细胞肿瘤纳米疫苗的制备方法，该方法包括以下步骤：
1)将酸敏感聚合物与免疫佐剂溶于有机溶剂中，并与乳化剂水溶液混合，混合溶液经超声处理，旋蒸除去有机溶剂后，获得物理包载免疫佐剂的聚合物纳米颗粒；
2)将制备所得的聚合物纳米颗粒与工程化肿瘤细胞膜经由纳米挤出器共挤出融合得到酸敏感聚合物负载免疫佐剂的纳米颗粒表面包被工程化肿瘤细胞膜的纳米疫苗，或者
1)将酸敏感聚合物-免疫佐剂偶联物溶于有机溶剂中，并与乳化剂水溶液混合，混合溶液经超声处理，旋蒸除去有机溶剂后，获得酸敏感聚合物-免疫佐剂偶联物纳米颗粒；
2)将制备所得的酸敏感聚合物-免疫佐剂偶联物纳米颗粒与工程化肿瘤细胞膜经由纳米挤出器共挤出融合，得到酸敏感聚合物-免疫佐剂偶联物纳米颗粒表面包被工程化肿瘤细胞膜的全细胞肿瘤纳米疫苗。
在上述制备方法中，所述酸敏感聚合物、免疫佐剂、酸敏感聚合物-免疫佐剂偶联物以及工程化肿瘤细胞膜如上所定义，此处不再赘述。
在实施方式中，所述有机溶剂包括但不限于氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮。
在实施方式中，所述乳化剂包括但不限于聚乙烯醇，所述乳化剂水溶液优选为2-10wt％聚乙烯醇水溶液。
在实施方式中，在步骤1)中，所述酸敏感聚合物、免疫佐剂的重量比为1-50：1。
在实施方式中，在步骤2)中，所述纳米颗粒与肿瘤细胞膜的重量比为0.1-10：1。
再一方面，本发明还提供了一种所述全细胞肿瘤纳米疫苗在制备用于恶性肿瘤治疗以及抗肿瘤复发和转移的药物中的用途。
在实施方式中，所述恶性肿瘤包括但不限于：乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤和胰腺癌。
有益效果
本发明的全细胞肿瘤纳米疫苗可通过纳米化尺度效应靶向淋巴结而被DCs所摄取，工程化肿瘤细胞细胞膜上在化疗或光动力治疗刺激下外翻的钙网蛋白与淋巴结中树突状细胞作用，可增加树突状细胞对疫苗的摄取，借助于聚合物的酸敏感，有利于纳米疫苗中肿瘤抗原和免疫佐剂的胞质释放，增强树突状细胞抗原呈递效率，激活多种特异性细胞毒性T淋巴细胞，实现高效的抗肿瘤复发和转移效应。纳米化的全细胞肿瘤疫苗有利于实现恶性肿瘤的个性化治疗。
附图说明
图1为本发明制备实施例1中所制备的工程化细胞膜的透射电镜图，图中标尺为100nm。
图2：a)为本发明制备实施例4中所制备的包载雷西莫特的mPEG-PC7A纳米颗粒透射电镜图，b)为本发明制备实施例7中所制备的全细胞肿瘤纳米疫苗的透射电镜图，图中标尺为100nm。
图3示出了制备实施例7中全细胞肿瘤疫苗在不同pH条件下的粒径变化。
图4示出了本发明制备实施例8中荧光标记的全细胞肿瘤纳米疫苗对小鼠淋巴结的靶向作用。
图5示出了本发明全细胞肿瘤纳米疫苗对CT-26小鼠移植瘤的生长抑制曲线，其中，A：PBS对照组；B：未包载雷西莫特的mPEG-PC7A纳米疫苗组；C：包载雷西莫特的mPEG-PC7A纳米疫苗组；以及D：mPEG113-b-P(DPA42-co-R8483)纳米疫苗组。
具体实施方式
以下结合附图通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明不受这些具体实施例限定。
以下实施例中所用试剂及仪器如下：
甲氧基封端的聚乙二醇胺5000、聚乙二醇二胺5000、2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯、雷西莫特(R848)、4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸均购自西格玛奥德里奇(中国)公司。如无特殊说明，其余所用试剂和溶剂均购自国药集团(上海)化学试剂有限公司。
CT-26结肠癌细胞和B16-F10黑色素瘤细胞的培养分别用DMEM培养基和1640培养基，胎牛血清购自Gibco公司。
4-5周龄的Balb/C白鼠，C57BL/6黑鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，并通过于小鼠右背部接种体外培养的B16黑色素瘤癌细胞构建荷B16肿瘤的荷瘤小鼠模型。整个动物实验的操作过程均严格遵循上海药物研究所动物护理与使用委员会的相关规定。
样品数据由以下仪器测定：核磁共振氢谱(1H-NMR)用Varian-MERCURY Plus-400核磁共振仪，以TMS为内标，化学位移单位为ppm-1；阳离子颗粒的流体力学粒径和表面电位由MALVERN NANO SIZER型粒径测定仪测定；透射电镜照片由Tecnai G2 F20 S-TWIN型透射电子显微镜获得。
在本发明中，如无特殊说明，所用设备及测试方法均为本领域常规的设备和方法。
制备实施例1：工程化细胞膜的制备
收集经奥沙利铂处理后的CT-26细胞，并以Tris-HCl pH 7.0，蔗糖，D-甘露醇清洗，随后在磷酸酶抑制剂及蛋白酶抑制剂混合物的存在下，利用均质器对细胞进行机械破坏，并通过超速离心的方式获取细胞膜。所获得的细胞膜以乙二胺四乙酸水溶液进行清洗后在-20℃条件保存。膜总蛋白含量通过BCA蛋白检测试剂盒定量。
图1为所制备的工程化细胞膜经纳米挤出器挤出后的透射电镜照片，该细胞膜经乙酸铀负染后展现出良好膜结构，厚度约为10nm左右。
制备实施例2：聚合物的合成
将4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸(CTA)(19.3mg,0.048mmol)溶于5mL N,N-二甲基甲酰胺中，向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(27.5mg,0.144mmol)，1-羟基苯并三唑(HOBT)(19.4mg,0.144mmol)，三乙胺(TEA)(16.16mg,0.160mmol)室温下反应1.5h。随后，向其中加入mPEG113-NH2(200.8mg,0.040mmol),室温反应24h后，反应液以乙醇和去离子水透析，透析袋截留分子量为3500D，冻干后获得淡黄色粉末状固体182mg，产率84.3％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.84–3.80(m,3H),3.69–3.62(m,456H),3.56(dd,J＝9.9,5.1Hz,6H),3.47(dd,J＝9.2,4.7Hz,6H),3.39(s,3H),3.35–3.30(m,2H),2.51(d,J＝3.9Hz,3H),1.69(dt,J＝15.0,7.5Hz,2H),1.45–1.36(m,4H),1.35–1.28(m,8H),1.26(s，12H)，0.88(t，J＝6.8Hz，3H).
将mPEG113-CTA(100mg,18.6μmol),2-(氮杂环庚烷-1-基)乙基甲基丙烯酸酯(PC7A)(235mg,1.11mmol)及偶氮二异丁腈(AIBN)(0.30mg,1.9μmol)溶于1mL无水二氧六环中，通过三次冻融循环除去体系中氧气，随后在70℃下反应24h。反应结束后，反应液以乙醇及去离子水透析后冻干，透析袋截留分子量为3500D，得210mg淡黄白色固体mPEG-PC7A，产率79.9％。
制备实施例3：酸敏感聚合物-免疫佐剂偶联物的制备
将化合物1(6.0g,0.04mol)，TEA(8.08g,0.08mol)溶于10mL二氯甲烷中，冰水浴下，向其中缓慢滴加10mL甲基丙烯酰氯(2.08g,0.08mol)的二氯甲烷溶液，滴毕，室温反应12h。反应液以水洗，二氯甲烷萃取后，无水硫酸钠干燥，柱分离后得3.8g化合物2，产率87.2％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.15(s,1H),5.64–5.55(m,1H),4.35–4.30(m,2H),3.79–3.75(m,2H),3.75–3.71(m,2H),3.69(s,4H),3.64–3.60(m,2H),1.96(s,3H).
将化合物2(0.20g,0.91mmol)，N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(354mg,2.75mmol)溶于10mL四氢呋喃中，冰水浴下向其中加入二(对硝基苯)碳酸酯(NPC)(418mg,1.37mmol)，室温下反应12h。反应完毕后，反应液先后以水，饱和氯化铵溶液洗涤，二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，柱分离获得285mg化合物3，产率81.8％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.29(d，J＝9.2Hz，2H)，7.40(d，J＝9.2Hz，2H)，6.14(s，1H)，5.59(s，1H)，4.47–4.43(m，2H)，4.35–4.31(m，2H)，3.85–3.81(m，2H)，3.80–3.76(m,2H),3.72(s,4H)，1.96(s,3H).
将化合物3(80mg,0.21mmol),雷西莫特(55mg,0.17mmol)溶于2mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，向其中加入1-羟基苯并三唑(HOBT)(35.1mg,0.26mmol)，室温下反应12h。反应完毕后，旋蒸去掉溶剂，反应液以水洗，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥后，柱分离得72mg化合物4，产率77.7％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.47(s,1H)，8.14(d,J＝8.2Hz,2H),7.58(dd,J＝11.3,4.1Hz，1H)，7.49–7.43(m，1H)，6.12(s，1H)，5.59–5.53(m，1H),4.90(s,2H),4.78(s，2H)，4.46–4.40(m，2H)，4.30–4.24(m，2H)，3.84–3.79(m,2H),3.77(dd,J＝5.5,4.2Hz，2H)，3.71(s，4H)，3.64(q，J＝7.0Hz，2H)，3.35(s，1H)，1.93(s,3H),1.33(s,6H),1.25(t,J＝7.0Hz,3H).
将化合物4(65mg,0.12mmol)，mPEG113-CTA(89.5mg，16.6μmol),2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸(DPA)(177mg,0.83mmol)及偶氮二异丁腈(AIBN)(0.27mg,1.7μmol)溶于1mL无水二氧六环中，通过三次冻融循环除去体系中氧气，随后在70℃下反应24h。反应结束后，反应液以乙醇及去离子水透析后冻干，透析袋截留分子量为3500D，得210mg淡黄白色固体mPEG113-b-P(DPA42-co-R8483)，产率75.8％。
制备实施例4：包载雷西莫特或未包载雷西莫特的纳米颗粒的制备
将5mg制备实施例2中制备的mPEG-PC7A和0.5mg雷西莫特溶解在0.5mL氯仿中，充分溶解后加入至5mL 2wt％聚乙烯醇水溶液中形成水油两相，冰水浴中，将超声探头没入液面，80w超声5min，超声结束后于室温下旋蒸除掉残余氯仿，混合液经过20000g离心60min后所得沉淀经磷酸缓冲盐溶液分散后即得包载雷西莫特的聚合物纳米颗粒。
另外，除了不加入雷西莫特以外，以上述方式相同的方式制备了未包载雷西莫特的mPEG-PC7A纳米颗粒。
制备实施例5：聚合物-雷西莫特偶联物纳米颗粒的制备
将5mg制备实施例3中制备的mPEG113-b-P(DPA42-co-R8483)溶解在0.5mL氯仿中，充分溶解后加入至5mL 2％聚乙烯醇水溶液中形成水油两相，冰水浴中，将超声探头没入液面，80w超声5min，超声结束后于室温下旋蒸除掉残余氯仿，混合液经过20000g离心60min后所得沉淀经磷酸缓冲盐溶液分散后即得聚合物-雷西莫特偶联物纳米颗粒。
制备实施例6：荧光标记的纳米颗粒的制备
将5mg实施例2中制备的mPEG-PC7A，0.5mg雷西莫特以及0.05mg IR-780染料溶解在0.5mL氯仿中或将5mg实施例3中制备mPEG113-b-P(DPA42-co-R8483)和0.05mg IR-780染料溶解在0.5mL氯仿中，充分溶解后加入至5毫升2wt％聚乙烯醇水溶液中形成水油两相，冰水浴中，将超声探头没入液面，80w超声5min，超声结束后于室温下旋蒸除去残余氯仿，混合液经过20000g离心60min后所得沉淀经磷酸缓冲盐溶液分散后即得IR-780染料标记的纳米颗粒。
制备实施例7：全细胞肿瘤纳米疫苗的制备
将含有1毫克膜蛋白的制备实施例1中的肿瘤细胞膜与3毫克制备实施例4或5中所制备的聚合物纳米颗粒在去离子水中混合，混合后置于摇床摇晃60min并通过纳米挤出器反复挤出200nm聚碳酸酯滤膜21次即得纳米疫苗(分别制得未包载雷西莫特的mPEG-PC7A的纳米疫苗；包载雷西莫特的mPEG-PC7A的纳米疫苗；以及mPEG113-b-P(DPA42-co-R8483)纳米疫苗)。
制备实施例8：荧光标记的全细胞肿瘤纳米疫苗的制备
将含有1毫克制备实施例1中制备的膜蛋白的肿瘤细胞膜与3毫克制备实施例6所制备的纳米颗粒在去离子水中混合，混合后置于摇床摇晃60min并通过纳米挤出器反复挤出200nm聚碳酸酯滤膜21次即得全细胞肿瘤纳米疫苗。
测试实施例1：纳米疫苗的酸敏性测试
将100μL制备实施例7中所制备的浓度为2mg/mL的纳米疫苗分别加入到900μL的pH值为6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2和7.4的柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，静置20min后，记录其DLS粒径变化情况，测试结果如图3所示。
测试结果显示，该纳米疫苗在pH为6.2时，颗粒结构发生解离，表明纳米颗粒在包被工程化细胞膜后仍具有良好的酸敏感性。
测试实施例2：小动物成像测试
将制备实施例8中的荧光标记的全细胞纳米疫苗通过足垫注射的方式对Balb/c鼠进行给药，分别在给药2h,5h,8h,12h,24h,36h时，通过小动物成像仪观察纳米疫苗在小鼠体内分布情况，测试结果如图4所示。
测试结果显示，纳米疫苗在给药2h后即可靶向小鼠腹股沟处淋巴结，并在淋巴结中长时间滞留，直至24h后，荧光强度逐渐降低，逐渐被机体分解代谢。
测试实施例3：纳米疫苗对皮下荷瘤鼠的抑瘤实验
于Balb/c白鼠背部接种CT-26肿瘤细胞后，当肿瘤体积达到50mm3左右时将小鼠随机分为4组，每组5只，组别分别为PBS组；制备实施例7中的未包载雷西莫特的mPEG-PC7A纳米疫苗组；包载雷西莫特的mPEG-PC7A纳米疫苗组；mPEG113-b-P(DPA42-co-R8483)纳米疫苗组。每七天给药1次，每次给药体积为100μL，浓度为30mg/kg的纳米疫苗；给药两次，每三天记录一次肿瘤的体积，测试结果如图5所示。
测试结果显示，包载或偶联雷西莫特纳米疫苗组(参见图5C和图5D)显著抑制肿瘤生长，且延长小鼠生存周期。
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