高三尖杉酯碱在制备抑制肿瘤细胞pd-l1制剂中的应用
阅读说明：本技术 高三尖杉酯碱在制备抑制肿瘤细胞pd-l1制剂中的应用 (Application of homoharringtonine in preparation of tumor cell inhibiting PD-L1 preparation ) 是由 苏玲 刘相国 刘超 李晓鹏 王莹莹 于 2021-10-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高三尖杉酯碱在制备抑制肿瘤细胞PD-L1制剂中的应用,其中有效下调肿瘤细胞PD-L1水平的高三尖杉酯碱的浓度为0.5～2μmol/L。此外,本发明证实TRIM13介导PD-L1的泛素化,且HHT增加肺癌细胞TRIM13的水平并增强TRIM13与PD-L1结合,表明HHT通过上调TRIM13蛋白水平并增强TRIM13与PD-L1结合,进而促进PD-L1通过泛素-蛋白酶体途径降解。同时小鼠实验证实HHT可抑制LLC荷瘤小鼠PD-L1的表达及增加杀伤性T细胞数量并抑制肿瘤生长。本发明的应用实现了通过下调肿瘤中的PD-L1水平抑制肿瘤的发展,预示HHT作为传统化疗药物可参与肿瘤免疫治疗,并具有良好的前景和实用价值。为传统药物在肿瘤治疗领域中的二次开发提供了一定的参考和启示,并为免疫治疗的联合用药提供了新思路。(The invention discloses an application of homoharringtonine in preparation of a preparation for inhibiting tumor cells PD-L1, wherein the concentration of homoharringtonine for effectively reducing the level of tumor cells PD-L1 is 0.5-2 mu mol/L. Furthermore, the present invention demonstrates that TRIM13 mediates ubiquitination of PD-L1 and that HHT increases the levels of TRIM13 in lung cancer cells and enhances the binding of TRIM13 to PD-L1, suggesting that HHT promotes the degradation of PD-L1 through the ubiquitin-proteasome pathway by up-regulating TRIM13 protein levels and enhancing the binding of TRIM13 to PD-L1. Meanwhile, the mouse experiment proves that HHT can inhibit the expression of LLC tumor-bearing mouse PD-L1, increase the number of killer T cells and inhibit the growth of tumors. The application of the invention realizes the inhibition of the development of the tumor by down-regulating the PD-L1 level in the tumor, indicates that HHT can participate in the tumor immunotherapy as the traditional chemotherapeutic drug, and has good prospect and practical value. Provides certain reference and inspiration for the secondary development of the traditional medicine in the field of tumor treatment, and provides a new idea for the combined medication of immunotherapy.)
技术领域
本发明涉及细胞周期非特异性抗肿瘤植物碱高三尖杉酯碱(Homoharringtonine，HHT) 的应用，尤其涉及高三尖杉酯碱在制备下调肿瘤细胞PD-L1(Programmed Cell Death1 Ligand 1，细胞程序性死亡受体配体1，又称为CD274或B7-H1)水平的制剂中的应用，属于生物医药和分子生物学技术领域。
背景技术
PD-L1是存在于肿瘤细胞质膜的糖蛋白，PD-L1与T细胞表面的PD1(ProgrammedDeath Receptor1，细胞程序性死亡受体-1)结合后可诱导T细胞凋亡、失能、耗竭，进而抑制肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的激活、增殖和抗肿瘤功能，实现肿瘤免疫逃逸。迄今为止，一些单克隆抗体通过靶向PD1/PD-L1信号通路来治疗癌症的方法在癌症治疗中取得了较好的效果，例如Nivolumab(纳武利尤单抗)和pembrolizumab(帕伯利珠单抗)、Atezolizumab (阿替利珠单抗)、avelumab和durvalumab等。然而，抗体药物亦有缺点存在，例如成本较高、运输困难以及潜在的免疫原性副作用等问题，因此有不少研究聚焦于针对PD1/PD-L1 信号通路设计开发小分子抑制剂。肿瘤细胞通过高表达PD-L1来持续激活PD1/PD-L1信号通路，从而触发多种免疫抑制机制，那么PD1与PD-L1的结合也可以通过抑制PD-L1的表达或促进其降解来中断。因此寻找能够下调肿瘤细胞中PD-L1表达的小分子化合物，并研究它的分子机制，对于改善肺癌免疫治疗效果具有重要意义。
高三尖杉酯碱(Homoharringtonine，HHT)是天然有效的细胞周期非特异性抗肿瘤植物碱，来源于红豆杉科尖杉属的一种植物，分子式为C29H39NO9，分子量为545.631。由于其价格低廉和效果显著已被临床用于治疗白血病超过30年，主要通过抑制真核细胞的蛋白质合成，干扰多聚体形成的早期阶段，影响真核细胞DNA的合成，诱导白血病细胞凋亡来发挥抗肿瘤作用。目前临床多用于ALL(急性淋巴细胞白血病)或CML(慢性粒细胞白血病) 的治疗。并已有许多研究证实该生物碱具有抗肿瘤活性，然而检索发现HHT对PD-L1的影响目前尚未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种高三尖杉酯碱(HHT)在制备抑制肿瘤细胞PD-L1制剂中的应用
本发明所述高三尖杉酯碱(HHT)在制备抑制肿瘤细胞PD-L1制剂中的应用。
其中：有效下调肿瘤细胞PD-L1水平的高三尖杉酯碱(HHT)的浓度为0.5～2μmol/L。所述的肿瘤为PD-L1受体天然高表达或因为肿瘤的治疗导致PD-L1受体高表达的肿瘤。
优选的，有效下调肿瘤细胞PD-L1水平的高三尖杉酯碱(HHT)的浓度为2μmol/L。所述的肿瘤为非小细胞肺癌。
本发明提供了一种针对PD-L1泛素化的调控方式，有助于进一步了解PD-L1相关的分子机制，为设计相关药物提供理论依据。
本发明发现了高三尖杉酯碱(HHT)可以通过下调小鼠肿瘤组织PD-L1水平并增加杀伤性T细胞数量来抑制肿瘤生长，揭示了高三尖杉酯碱(HHT)在抗肿瘤免疫反应中的潜力，为传统药物在肿瘤治疗领域中的二次开发提供了一定的参考和启示。
为了更好地理解本发明的实质，下面用高三尖杉酯碱(HHT)的生化和细胞实验及结果来阐明其在制备抑制肿瘤细胞PD-L1制剂及其相关研究中的应用。
采用生物化学、细胞生物学和分子生物学的方法，进行如下实验：
1、HHT下调肺癌细胞PD-L1蛋白水平
在H460、H1792、A549细胞分别用(0、0.125μM、0.25μM、0.5μM、1μM、2μM)的高三尖杉酯碱(HHT)处理20h，收集细胞，通过Western blot检测PD-L1蛋白水平；在 H460、H1792、A549细胞中，用1μM的高三尖杉酯碱(HHT)分别处理6h、12h、24h，收集细胞，通过Westernblot检测PD-L1蛋白水平。
结果表明：在三种细胞系——H460、A549以及H1792中选用不同浓度、不同时间分别处理细胞，高三尖杉酯碱(HHT)均能下调肺癌细胞中PD-L1的蛋白水平(图1A-F)。
2、高三尖杉酯碱(HHT)通过泛素-蛋白酶体途径下调PD-L1蛋白水平
PD-L1表达受多种途径的调控，包括基因转录、转录后，翻译和翻译后修饰等。基于HHT可减少人肺癌细胞PD-L1的蛋白表达含量，还需确定HHT是通过转录水平还是蛋白水平影响PD-L1表达。使用1μM、2μM的HHT分别处理A549、H1792细胞20h后，提取 RNA进行RT-PCR，检测PD-L1的mRNA水平的变化。
细胞内蛋白质降解主要通过溶酶体途径和蛋白酶体途径。基于HHT通过PD-L1的翻译后修饰降低其蛋白稳定性，那么接下来验证HHT引起的PD-L1水平下降是通过溶酶体途径还是蛋白酶体途径进行。在A549和H1792细胞中加入1μM或2μM的高三尖杉酯碱(HHT) 处理12h后，再分别加入20μmol/L的蛋白酶体抑制剂MG132和15μmol/L的溶酶体抑制剂 CQ处理8h，然后再通过western blot检测PD-L1和ACTB的水平。检测高三尖杉酯碱对 PD-L1的下调所依赖的途径。
在H1792细胞中转染pcDNA3.1-FLAG-PD-L1、pcDNA3.1-HA-UB质粒，并使用20nM 的HHT处理2h，利用FLAG抗体进行CO-IP实验，通过Western blot检测PD-L1的泛素化水平。
结果表明：(1)数据显示，与对照相比，不论在A549还是在H1792细胞中，加药处理后的PD-L1的mRNA水平均是上升的(图3A、B)。PD-L1的mRNA水平虽然上升，但其蛋白表达量下降，因此HHT不是在转录水平下调肿瘤细胞中PD-L1水平，可能在蛋白翻译后水平下调PD-L1。(2)与蛋白酶体抑制剂MG132联合处理能抑制高三尖杉酯碱(HHT) 引起的PD-L1下调(图2C、D)，而联合使用溶酶体抑制剂CQ与高三尖杉酯碱(HHT)单独处理相比二者无明显变化(图2E、F)，说明高三尖杉酯碱(HHT)对PD-L1的下调依赖蛋白酶体途径而非溶酶体途径。(3)通过Co-IP实验证实高三尖杉酯碱(HHT)能增强PD- L1的泛素化水平进而促进PD-L1通过泛素-蛋白酶体途径降解(图2G)。
3、高三尖杉酯碱(HHT)调控TRIM13蛋白水平
基于前面的研究，发现HHT能增强PD-L1的泛素化，进一步推测HHT可能通过E3连接酶调控PD-L1水平。TRIM13、SYVN1、CHIP是几个定位于内质网上E3连接酶。在 A549细胞中，用不同浓度的(0、0.125μM、0.25μM、0.5μM)的高三尖杉酯碱(HHT)处理20h，然后收集细胞裂解，再通过western blot检测PD-L1、TRIM13、CHIP、SYVN1和 ACTB蛋白水平。在H460、H1792细胞中，用不同浓度的(0、0.125μM、0.25μM、0.5μM、 1μM、2μM)的高三尖杉酯碱(HHT)处理20h，然后收集细胞裂解，再通过western blot检测PD-L1、TRIM13和ACTB蛋白水平。
在H1792和H460细胞中使用1μM和2μM的高三尖杉酯碱(HHT)处理20h后，然后收集细胞，提取RNA，使用RT-PCR技术检测TRIM13的转录情况。
在H1792细胞中转染TRIM13的siRNA干扰TRIM13的表达24h后，再向细胞中加入 1μM的高三尖杉酯碱(HHT)继续处理20h，通过Western blot检测PD-L1、TRIM13、 ACTB的表达情况。
结果表明：(1)HHT处理后TRIM13的蛋白水平上升(图3A-C)，HHT处理后 TRIM13的转录水平无变化趋势(图3D、E),说明HHT对TRIM13的影响不是发生在转录水平上的。(2)敲低TRIM13后发现，HHT引起的PD-L1下调可在一定程度上被抑制(图 3F)。TRIM13属于TRIM家族的一个蛋白，主要定位于内质网，而内质网膜上锚定的E3连接酶可通过ERAD途径参与错误折叠蛋白质的降解。因此推测，TRIM13可能介导PD-L1的泛素化。
4、TRIM13表达水平与PD-L1呈负相关
使用GEPIA数据库分析PD-L1与TRIM13表达的相关性。通过Western blot检测A549、Calu-1、H1299、H157、H1792和H460六种NSCLC细胞中PD-L1与TRIM13的蛋白表达量。使用Kaplan-Meier Plotter数据库分析肺癌患者的总生存率与TRIM13表达的相关性。最后，在H460细胞中梯度过表达TRIM13，通过Western blot检测PD-L1与TRIM13的蛋白表达量。
结果表明：(1)利用GEPIA数据平台，对数据库进行分析，发现TRIM13表达水平与PD-L1呈负相关(图4A)。通过Western blot实验检测6种NSCLC细胞中PD-L1与TRIM13 的蛋白表达量，数据显示在Calu-1、H1299中，PD-L1蛋白水平高的同时TRIM13蛋白水平较低，相反在A549、H1792和H157中则是PD-L1蛋白水平低而TRIM13蛋白水平高(图 4B)。另外，根据Kaplan-Meier Plotter数据库的分析，TRIM13在肺癌细胞中的表达水平与肺癌病人的总生存率呈正相关(图4C)。且在H460细胞中梯度过表达TRIM13，结果显示 PD-L1的蛋白水平也呈下降趋势(图4D)，以上均证实TRIM13可能与PD-L1的蛋白稳定性相关。
5、TRIM13与PD-L1相互作用且HHT增强两者结合
由于PD-L1的糖基化对其蛋白稳定性很重要，因此本申请中构建两种关于PD-L1的质粒，一种是pcDNA3.1-FLAG-PD-L1，它能表达正常糖基化形式的PD-L1；另一种是pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)，它将PD-L1主要的三个糖基化位点(N192、N200和N219) 突变，使其无法正常糖基化，最终以不成熟的非糖基化形式存在于内质网中。在HEK293FT、 H1792细胞中转染pcDNA3.1-FLAG-PD-L1、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)、pcDNA3.1-HA- TRIM13质粒24h，使用FLAG蛋白抗体进行Co-IP实验，通过Western blot检测TRIM13与 PD-L1(WT)和PD-L1(3NQ)的结合情况。在H460细胞中转染pcDNA3.1-HA-TRIM13 质粒，使用HA蛋白抗体进行Co-IP实验，通过Western blot检测内源蛋白PD-L1与 TRIM13的结合。
在H460细胞中转染pcDNA3.1-HA-TRIM13质粒，加入20nM的高三尖杉酯碱(HHT) 处理2h，使用HA蛋白抗体进行Co-IP实验，通过Western blot检测内源蛋白PD-L1与 TRIM13的结合，并进行灰度分析。
结果表明：(1)TRIM13与糖基化和非糖基化PD-L1均存在相互作用(图5A、B)。另外，在H460中过表达pcDNA3.1-HA-TRIM13质粒，通过Co-IP实验验证TRIM13能与内源 PD-L1结合(图5C)。(2)HHT处理后TRIM13与内源非糖基化PD-L1的结合显著增强 (图5D、E)，说明HHT可能通过TRIM13介导PD-L1的下调。
6、TRIM13增强PD-L1的泛素化
在HEK293FT细胞中转染pcDNA3.1-FLAG-PD-L1、pcDNA3.1-TRIM13、pcDNA3.1- HA-UB质粒，进行Co-IP实验，通过Western blot检测PD-L1的泛素化水平。在HEK293FT 细胞中转染pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)、pcDNA3.1-TRIM13、pcDNA3.1-HA-UB质粒，进行Co-IP实验，检测PD-L1非糖基化的泛素化水平。在H1792与A549细胞中分别转染 pcDNA3.1-FLAG-PD-L1、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)、pcDNA3.1-TRIM13、pcDNA3.1- HA-UB质粒，进行Co-IP实验，检测PD-L1糖基化与非糖基化的泛素化水平。
结果表明：(1)Co-IP实验发现TRIM13可促进糖基化和非糖基化PD-L1的泛素化(图6A-D)。
7、高三尖杉酯碱(HHT)下调小鼠肿瘤组织PD-L1水平并增加杀伤性T细胞数量，抑制肿瘤生长
在小鼠肺癌细胞LLC细胞中，用(0、0.125μM、0.25μM、0.5μM、1μM、2μM)的高三尖杉酯碱(HHT)处理20h，然后通过western blot检测Pd-l1和Actb蛋白水平。
将10只6周龄大的C57BL/6小鼠分为两组，一组为对照组，在皮下注射1×106/100μl·只LLC细胞7天后，每隔一天腹腔注射与实验组等量的生理盐水，继续培养20天；另一组为实验组，在皮下注射1×106/100μl·只LLC细胞7天后，每隔一天按1.25mg/kg的标准腹腔注射HHT，继续培养20天。这期间每隔一天测量一次小鼠的体重和肿瘤的长与宽，根据公式V＝π*(length*width2)/6计算肿瘤的大小，实验结束后处死小鼠并取出肿瘤并将解剖出的肿瘤进行称重。
取解剖后的肿瘤组织进行石蜡切片的制作，然后对切片分别进行免疫组化和免疫荧光实验。CD8+T细胞是T细胞的一种，能杀伤表达抗原的靶细胞，它在抗毒感染、急性同种异型移植物排斥和对肿瘤细胞的杀伤作用中是重要的效应细胞。因此，CD8+T细胞的数量在一定程度上反映了对肿瘤的杀伤能力。在显微镜下观察小鼠肿瘤组织内的PD-L1水平，在荧光显微镜下观察小鼠CD8+T细胞在LLC皮下移植瘤组织附近的分布。
结果表明：(1)HHT对小鼠肺癌细胞LLC的PD-L1表达存在下调作用(图7A)。(2) 随着HHT注射时间的增长，实验组小鼠肿瘤组织的生长明显放缓(图7E)。最终的解剖结果也显示，实验组的2只成瘤小鼠在注射HHT后肿瘤逐渐减小直至消失(图7C)。将解剖出的肿瘤进行称重，发现实验组中肿瘤重量明显低于对照组，统计分析表明，二者存在显著差异(p<0.05)(图7F)。在整个实验过程中，两组小鼠体重均呈现稳步增长，因此可排除小鼠生长状况对实验结果的影响(图7D)。(3)通过免疫组化实验发现实验组小鼠肿瘤组织内的PD-L1水平低于对照组(图8A)。通过对两组的石蜡切片进行免疫荧光实验，结果显示，实验组的CD8+T淋巴细胞数量多于对照组(图8B)，说明HHT处理可能增强小鼠T细胞的杀伤能力。
由上述实验及其结果，可以得出如下结论：
在非小细胞肺癌中，高三尖杉酯碱(HHT)处理后可下调PD-L1蛋白表达水平。其次，利用体外细胞实验证明HHT通过上调TRIM13的蛋白表达水平并增强TRIM13与PD-L1的结合，进而促进PD-L1通过泛素-蛋白酶体途径降解。最后，通过小鼠实验证实HHT处理可抑制LLC荷瘤小鼠PD-L1的表达及增加杀伤性T细胞数量并抑制肿瘤生长。
本发明的有益效果体现在：
本发明提供了高三尖杉酯碱(HHT)在制备抑制肿瘤细胞PD-L1制剂中的应用。其中：能有效下调肿瘤细胞PD-L1水平的乌苯苷的浓度为0.5～2μmol/L。并进一步证实高三尖杉酯碱可以通过下调肿瘤中的PD-L1水平抑制肿瘤的发展和高三尖杉酯碱在抗肿瘤免疫反应中的应用潜力。同时本发明公开的高三尖杉酯碱为研制开发有关制备抑制肿瘤细胞PD-L1的制剂奠定了基础，也为传统药物在肿瘤治疗领域中的二次开发提供了一定的参考和启示。
本发明提供的针对PD-L1泛素化的调控方式，有助于进一步了解PD-L1有关的分子机制，为设计相关药物提供了理论依据，为了解肿瘤逃逸的基本机制提供了理论基础，本研究有望拓展HHT在抗肿瘤免疫治疗领域的应用，并为免疫治疗的联合用药提供了新思路。
附图说明
图1为高三尖杉酯碱(HHT)下调肺癌细胞PD-L1蛋白水平
其中，图1A-C为在H460、A549以及H1792细胞中用(0、0.125μM、0.25μM、 0.5μM、1μM、2μM)的HHT处理20h，通过Western blot检测PD-L1蛋白水平；图1D-F 为在H460、A549以及H1792细胞中用1μM的HHT分别处理6h、12h、24h，通过 Western blot检测PD-L1蛋白水平。
图2为高三尖杉酯碱(HHT)通过泛素-蛋白酶体途径下调PD-L1蛋白水平
其中，图2A、2B为在A549和H1792细胞中，使用1μM和2μM的HHT处理20h后，提取总RNA，取1μg进行RT-PCR检测PD-L1的转录水平；图2C、2D为在A549和 H1792中使用20μM的蛋白酶体抑制剂MG132阻断蛋白酶体相关的降解途径，1μM的 HHT处理12h后加入MG132继续培养8h，通过Western blot检测PD-L1和ACTB的水平；图2E、2F为在A549和H460中使用15μM的溶酶体抑制剂CQ阻断溶酶体相关的降解途径，1μM的HHT处理12h后加入CQ继续培养8h，通过Western blot检测PD-L1和ACTB 的水平；图2G为在H1792细胞中过表达pcDNA3.1-FLAG-PD-L1、pcDNA3.1-HA-UB质粒，并使用20nM的HHT处理2h，进行Co-IP实验，通过Western blot检测PD-L1的泛素化水平。
图3为高三尖杉酯碱(HHT)调控TRIM13蛋白水平
其中，图3A为在A549中，HHT梯度浓度(0、0.125μM、0.25μM、0.5μM)处理20h 后，通过Western blot检测PD-L1、TRIM13、CHIP和SYVN1蛋白水平；图3B、3C为在 H460和H1792中，HHT梯度浓度(0、0.125μM、0.25μM、0.5μM、1μM、2μM)处理20h 后，通过Western blot检测PD-L1和TRIM13蛋白水平；图3D、3E为在H460和H1792中，使用1μM和2μM的HHT处理20h后，利用RT-PCR技术检测TRIM13的转录情况；图3F 为在H1792中利用TRIM13的siRNA敲低TRIM13的表达，并使用1μM的HHT处理细胞 20h后，通过Western blot检测PD-L1、TRIM13、ACTB的表达情况。
图4为TRIM13表达水平与PD-L1呈负相关
其中，图4A为使用GEPIA数据库分析PD-L1与TRIM13表达的相关性；图4B为不同NSCLC细胞(A549、Calu-1、H1299、H157、H1792和H460)中PD-L1和TRIM13的蛋白表达水平；图4C为使用Kaplan-Meier Plotter数据库分析肺癌患者的总生存率与 TRIM13表达的相关性；图4D为在H460中梯度过表达pcDNA3.1-HA-TRIM13质粒，通过 Western blot检测PD-L1和TRIM13的蛋白表达水平。
图5为TRIM13与PD-L1相互作用且高三尖杉酯碱(HHT)增强两者结合
其中，图5A、5B为在HEK293FT、H1792细胞中过表达pcDNA3.1-FLAG-PD-L1、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)、pcDNA3.1-HA-TRIM13质粒，通过Co-IP实验检测 TRIM13与PD-L1(WT)和PD-L1(3NQ)的结合情况；图5C为在H460中过表达pcDNA3.1- HA-TRIM13质粒，利用HA珠子进行Co-IP实验，检测内源蛋白PD-L1与TRIM13的结合；图5D、5E为在H460中过表达pcDNA3.1-HA-TRIM13质粒，并使用20nM的HHT处理2h，利用HA珠子进行Co-IP实验，检测内源蛋白PD-L1与TRIM13的结合，并进行灰度分析， mean±SEM，*p<0.05，**p<0.01。
图6为TRIM13增强PD-L1的泛素化
其中，图6A为在HEK293FT细胞中过表达pcDNA3.1-FLAG-PD-L1、pcDNA3.1-TRIM13、pcDNA3.1-HA-UB质粒，通过Co-IP实验检测PD-L1的泛素化水平；图6B为在HEK293FT细胞中过表达pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)、pcDNA3.1-TRIM13、pcDNA3.1- HA-UB质粒，通过Co-IP实验检测PD-L1非糖基化的泛素化水平；图6C、6D为在H1792 与A549细胞中过表达pcDNA3.1-FLAG-PD-L1、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)、 pcDNA3.1-TRIM13、pcDNA3.1-HA-UB质粒，通过Co-IP实验检测PD-L1糖基化与非糖基化的泛素化水平。
图7为高三尖杉酯碱(HHT)抑制小鼠LLC肿瘤生长
其中，图7A为在小鼠肺癌细胞LLC中，HHT梯度浓度(0、0.125μM、0.25μM、 0.5μM、1μM、2μM)处理20h后，WB检测Pd-l1和Actb表达水平；图7B、7C为接种后第20天取肿瘤，拍照；图7D为接种后小鼠体重记录，每隔一天测量；图7E为接种后 LLC肿瘤随时间增长，每隔一天测量肿瘤体积，mean±SEM，*p<0.05；图7F为小鼠肿瘤重量记录，mean±SEM，*p<0.05。
图8为高三尖杉酯碱(HHT)下调小鼠肿瘤组织内PD-L1水平并增加杀伤性T细胞数量
其中，图8A为通过免疫组化分析小鼠PD-L1在LLC皮下移植瘤中的表达；图8B为利用CD8抗体进行免疫荧光分析小鼠CD8+T细胞在LLC皮下移植瘤组织附近的分布。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的材料、质粒、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
其中：高三尖杉酯碱(Homoharringtonine，HHT)购自MCE；人非小细胞型肺癌细胞系(NSCLC)：H460、H1792、A549、H157、H1299、Calu-1均购自美国ATCC；人胚肾细胞系：HEK293FT、HEK293T购自Invitrogen。
本发明实施例中涉及的质粒有：pcDNA3.1-FLAG-PD-L1、pcDNA3.1-HA-UB、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)、pcDNA3.1-HA-TRIM13、pcDNA3.1-TRIM13其构建均采用常规分子生物学方法，其中以pcDNA3.1-FLAG-PD-L1质粒为例具体构建方法如下：
1、肿瘤细胞RNA提取
(1)细胞培养在6孔板中，提取RNA前先用真空吸泵吸出培养板中的培养基溶液，之后加入1×PBS磷酸缓冲溶液清洗一遍，吸去残留的液体。
(2)向每个6孔板中加入500μL的TRIZOL溶液进行裂解，裂解时应用移液器反复吹打以使细胞完全破裂，之后将6孔板放在室温的条件下静置5分钟。
(3)静置后将上述所得的裂解液放入高压灭菌的无RNase的1.5mL的离心管中。之后再加入100μL的氯仿溶液进行15s左右的充分摇晃，最后再在室温条件下静置2分钟。
(4)2分钟静置后，将离心管放入4摄氏度的低温离心机中离心15分钟，转速为12000g。
(5)离心完成后，溶液明显分为上中下三层，使用移液器将上层的液体吸入到新的离心管中，再加入250μL的异丙醇溶液。体系混匀后放于室温下静置10分钟。
(6)静置完成后，将离心管放入4摄氏度离心机中，转速12000g时间10分钟。
(7)离心后，使用移液器将上清小心去除，之后再向离心管中加入500μL用DEPC水配置的75％的乙醇溶液，轻轻弹匀后，放于4摄氏度离心机中，转速7500g离心5分钟。此过程重复两遍。
(8)使用移液器将上清液全部弃去，将离心管管口朝下放于无菌的吸水纸上自然晾干。
(9)晾干过程中可以清晰看见离心管底部白色沉淀变得越来越透明，之后加入40μL 的DEPC水，轻轻弹匀沉淀使底物的RNA全部溶解。
(10)使用分光光度计测量提取的RNA的纯度和浓度。
2、反转录过程
(1)该过程加样全程在冰盒上进行。取反转录试剂盒于冰上。
(2)取高压灭菌后的PCR小管，向其中加入1μL的Oligo(dT)和1μg的提取的RNA (计算RNA所加的体积)，剩余的体积使用无菌超纯水补齐到13μL，轻轻混匀后，在高速离心机中短离10秒。
(3)离心后将PCR小管放入PCR仪中，65摄氏度进行反应，设定反应时间为时间10分钟。
(4)反应完成后取出PCR管，再向其加入4μL的5×Reaction buffer和0.5μL的RNase 抑制剂和0.5μL的逆转录酶以及2μL的dNTP溶液，轻轻混匀，进行瞬时离心。
(5)离心后，将PCR管再次放置于PCR仪中，设定程序为先55摄氏度进行30分钟的反应，然后再进行85摄氏度5分钟的反应，最后反应完成后放入-20摄氏度保存。
3、目的基因克隆
(1)基因克隆使用的PCR体系：
试剂名称加入体积
PD-L1基因上下游引物序列如下：
pcDNA3.1-PD-L1-FLAG FWD:
CGGTACCGCCGCCACCATGAGGATATTTGCTGTCTTTATATTC
pcDNA3.1-PD-L1-FLAG REV:
CCTCGAGTTACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCCGTCTCCTCCAAATGTGTATC
(2)PCR反应时间和温度设定：
温度设定 时间设定
98摄氏度 2分钟
98摄氏度 10秒
53摄氏度 15秒
72摄氏度 30秒
72摄氏度 7分钟
4摄氏度 保存
注：PCR循环数设定为35个循环。
(3)加A反应：取30μL的PCR终产物于新的PCR管中，向其中加入DNA Taq聚合酶0.3μL，轻轻混匀后放于PCR仪中进行72摄氏度20分钟的反应过程。
(4)目的基因的片段与T载体的连接：
试剂名称体积
放于PCR仪中16摄氏度过夜进行T载体连接。
4、质粒表达载体构建
(1)从-80摄氏度冰箱中取10μL的大肠杆菌感受态细胞，放置于冰盒上。
(2)向感受态细胞中加入3-5μL的基因与T载体连接的产物，轻轻混匀后在冰盒上静置30分钟。
(3)冰上静置完成后，在42摄氏度的恒温水浴锅中进行热激反应90秒，紧接着再放入冰上静置2分钟。
(4)静置后向离心管中加入500μL的液体LB培养基，在37摄氏度细菌培养要床上震动培养1h。
(5)1h后使用移液器将500μL的上述菌液加入含有抗生素的LB固体培养基中，抗生素的选取要根据所连接的载体所带的抗性基因决定。
(6)细菌涂布后，将细菌平板在37摄氏度细菌培养箱中倒置培养一夜。
(7)取合适数量的1.5mL的离心管，向其中加入15μL的无菌水，之后根据平板上长出的菌落，挑取一定数量的单菌株放入无菌水中。
(8)挑取完成后，向离心管中加入15μL的酚氯仿异戊醇溶液，使用涡旋振荡仪充分裂解细菌。
(9)裂解完成后，在常温下进行离心，12000g离心10分钟，离心后溶液分为三层，取上层溶液进行琼脂糖凝胶电泳验证。
(10)根据电泳结果挑选连接成功的菌落，进行摇菌步骤。先在5mL摇菌管中加入液体LB培养基以及1‰的抗生素，后挑取选定的单菌落放入其中在细菌培养箱中震荡培养16h。
(11)提取质粒，质粒的提取使用小提中量质粒提取试剂盒。
(12)将提取的质粒送入生物公司测基因序列，比对基因序列是否与目的基因序列一致。
(13)对连接上PD-L1基因片段的T载体以及质粒表达载体pcDNA3.1进行相同的限制性内切酶KpnI和XhoI酶切，酶切结束后，进行琼脂糖凝胶电泳验证。酶切体系如下：
试剂名称体积
(14)验证成功后，将琼脂糖凝胶电泳上的条带切割下来进行胶回收，提纯DNA。
(15)胶回收的PD-L1基因片段与质粒表达载体按照如下体系进行连接：
试剂名称体积
5、蛋白验证
选取构建测序正确的质粒转染细胞，收集细胞，做western blot，验证蛋白是否过表达。
除上述pcDNA3.1-FLAG-PD-L1质粒构建外，所述其他质粒的构建步骤也同上，不同的是各质粒所需上下游引物序列如下：
pcDNA3.1-HA-TRIM13 FWD:
CAAGCTTGCCGCCACCATGGATGTGATGGAGCTGCTTG
pcDNA3.1-HA-TRIM13 REV:
CTCTAGATTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATAATAGTTTATATTTGCACAC AAAT
pcDNA3.1-TRIM13 FWD:
CAAGCTTGCCGCCACCATGGATGTGATGGAGCTGCTTG
pcDNA3.1-TRIM13 REV:
CTCTAGATTATAATAGTTTATATTTGCACACAAAT。
实施例1：高三尖杉酯碱(HHT)下调肺癌细胞PD-L1蛋白水平
将H460、H1792、A549细胞分别接种于12孔板(细胞培养皿)中，37℃，CO2孵箱内培养24h之后，用(0、0.125μM、0.25μM、0.5μM、1μM、2μM)的高三尖杉酯碱(HHT) 处理20h，然后将长有细胞的培养板(皿)置于冰上，吸走培养基；用事先预冷的1×PBS清洗细胞一次，后吸走板中液体；加入适当体积含1％混合蛋白酶抑制剂的细胞裂解液(PIC)，冰上裂解30min，收集细胞裂解液，4℃13200r/min离心15min，取上清待制样。再制作标准曲线并测蛋白浓度，先取5个1.5mL EP管，各加入10μL去离子水，再分别加入(0、1、 2、4、8)μL BSA(浓度为2mg/mL)，此组用于标准曲线的制作；取0.5mL EP管，加入 10μL去离子水，再加入2μL蛋白样品裂解液；配制适量的1×蛋白染液(5×蛋白染液稀释而成，现用现配)，实验组加入500μL染液，标曲组中加入1mL染液，混合均匀；每管液体中分别取200μL，加入到96孔板中，用酶标仪测量595nm波长下的OD值，根据标曲组OD 值，绘制标准曲线，根据样品的OD值计算样品的浓度；根据浓度和上样量，计算所需的蛋白裂解液、3×SDS以及1×SDS的体积，依次加入0.5mL EP管中，制蛋白样；95℃金属浴，变性5min，可用于SDS-PAGE胶上样。根据配方制备分离胶与浓缩胶。将金属浴加热变性后的蛋白样品短暂离心后进行上样。将胶孔梳子拔出向电泳槽和胶板中加入稀释后的 1×Running Buffer溶液。在上样孔道中按照蛋白样品的实验顺序依次加入并在不同实验组之间加入标准蛋白Marker以用来指示不同蛋白的分子量大小。上样完成后进行跑胶，先90V 电压进行压胶，待蛋白Marker分离后使用120V电压待溴酚蓝跑至胶的底部附近时，结束跑胶。然后转膜，先用甲醇活化PVDF膜1min，提前预冷Transfer buffer，采用湿转法将胶上的蛋白转移至PVDF膜上，150V，2-3h。转膜完成后，5％的脱脂奶粉(1×PBST配置)封闭 1h；1×PBST洗三遍，每遍5min；一抗孵育，3％BSA配置一抗，4℃孵育过夜；第二天回收一抗，1×PBST洗两遍，每遍8min；室温下二抗(3％脱脂奶粉配置)孵育1h；1×PBST洗三遍，每遍10min；ECL显色，将膜与底物混合后，置于暗室，利用显影片进行曝光，再分析结果。经过以上western blot步骤后检测PD-L1蛋白水平。
将H460、H1792、A549细胞分别接种于6孔板(细胞培养皿)中，37℃，CO2孵箱内培养24h之后，用1μM的高三尖杉酯碱(HHT)分别处理6h、12h、24h，然后将长有细胞的培养板(皿)置于冰上，吸走培养基；用事先预冷的1×PBS清洗细胞一次，后吸走板中液体；加入适当体积含1％混合蛋白酶抑制剂的细胞裂解液(PIC)，冰上裂解30min，收集细胞裂解液，4℃13200r/min离心15min，取上清，通过以上western blot步骤后检测PD- L1蛋白水平。
结果表明：在三种细胞系——H460、A549以及H1792中选用不同浓度、不同时间分别处理细胞，高三尖杉酯碱(HHT)均能下调肺癌细胞中PD-L1的蛋白水平(图1A-F)。
实施例2：高三尖杉酯碱(HHT)通过泛素-蛋白酶体途径下调PD-L1蛋白水平
将A549和H1792细胞分别接种于6孔板(细胞培养皿)中，37℃，CO2孵箱内培养 24h之后，使用1μM和2μM的HHT处理20h后，提取总RNA，提取RNA前先用真空吸泵吸出培养板中的培养基溶液，之后加入1×PBS磷酸缓冲溶液清洗一遍，吸去残留的液体；向每个6孔板中加入500μL的TRIZOL溶液进行裂解，裂解时应用移液器反复吹打以使细胞完全破裂，之后将6孔板放在室温的条件下静置5分钟；静置后将上述所得的裂解液放入高压灭菌的无RNase的1.5mL的离心管中。之后再加入100μL的氯仿溶液进行15s左右的充分摇晃，最后再在室温条件下静置2分钟；2分钟静置后，将离心管放入4摄氏度的低温离心机中离心15分钟，转速为12000g；离心完成后，溶液明显分为上中下三层，使用移液器将上层的液体吸入到新的离心管中，再加入250μL的异丙醇溶液。体系混匀后放于室温下静置 10分钟；静置完成后，将离心管放入4摄氏度离心机中，转速12000g时间10分钟；离心后，使用移液器将上清小心去除，之后再向离心管中加入500μL用DEPC水配置的75％的乙醇溶液，轻轻弹匀后，放于4摄氏度离心机中，转速7500g离心5分钟。此过程重复两遍；使用移液器将上清液全部弃去，将离心管管口朝下放于无菌的吸水纸上自然晾干；晾干过程中可以清晰看见离心管底部白色沉淀变得越来越透明，之后加入40μL的DEPC水，轻轻弹匀沉淀使底物的RNA全部溶解；使用分光光度计测量提取的RNA的纯度和浓度。取反转录试剂盒于冰上；取高压灭菌后的PCR小管，向其中加入1μL的Oligo(dT)和1μg的提取的RNA (计算RNA所加的体积)，剩余的体积使用无菌超纯水补齐到13μL，轻轻混匀后，在高速离心机中短离10秒；离心后将PCR小管放入PCR仪中，65摄氏度进行反应，设定反应时间为时间10分钟；反应完成后取出PCR管，再向其加入4μL的5×Reaction buffer和 0.5μL的RNase抑制剂和0.5μL的逆转录酶以及2μL的dNTP溶液，轻轻混匀，进行瞬时离心；离心后，将PCR管再次放置于PCR仪中，设定程序为先55摄氏度进行30分钟的反应，然后再进行85摄氏度5分钟的反应，最后反应完成后放入-20摄氏度保存。利用获得的 cDNA为模板，使用的10μL PCR体系(2×PrimeSTAR Max Premix 5μL，10μmol/L的PD- L1基因上游引物0.4μL，10μmol/L的PD-L1基因下游引物0.4μL，模板cDNA 0.4μL，双蒸水3.8μL，总体积共10μL)以TRIM13基因(SEQ ID NO.1所示)设计的上下游引物进行 PCR扩增PD-L1的基因序列，再进行1％琼脂糖凝胶电泳以检测PD-L1的转录情况。
上述PD-L1基因的上下游引物序列如下：
FWD:GCTGCACTAATTGTCTATTGGGA
REV:GCTGCACTAATTGTCTATTGGGA
将A549和H1792细胞分别接种于12孔板(细胞培养皿)中，37℃，CO2孵箱内培养24h之后，加入1μM的高三尖杉酯碱(HHT)处理12h后，再分别加入20μmol/L的蛋白酶体抑制剂MG132和15μmol/L的溶酶体抑制剂CQ处理8h,然后收集细胞裂解(具体步骤见实施例1)，再通过western blot(步骤见实施例1)检测PD-L1和ACTB的水平。
将H1792细胞接种于10cm细胞培养皿中，37℃，CO2孵箱内培养24h之后，在 H1792细胞中转染pcDNA3.1-FLAG-PD-L1、pcDNA3.1-HA-UB质粒，每个处理取2个 1.5mL的EP管，各加入200μL的培养基，根据实验要求计算后，分别加入质粒和质粒质量 2倍的转染试剂，分别用移液枪吹打五次，静置5min；将2个1.5mL的EP管中的液体混合，吹打五次使之充分混匀，静置20min；将原先的一部分培养基吸走，滴加上述混匀静置后的液体，晃动，令其均匀分布；转染6h后换加入5％血清的新鲜培养基，继续培养至24h。其中一个处理在收集细胞2h前加入20nM的高三尖杉酯碱(HHT)处理2h，收集细胞6h前两个处理都加入20μmol/L的MG132，然后将长有细胞的培养板(皿)置于冰上，吸走培养基；用事先预冷的1×PBS清洗细胞一次，后吸走板中液体；加入适当体积含1％混合蛋白酶抑制剂(PIC)的IP裂解液，冰上裂解30min，收集细胞裂解液，4℃13200r/min离心15min，取上清。为避免珠子与蛋白的非特异性结合，取10μL的Protein A珠子或者Protein G珠子于1.5mLEP管中，加入900μL 1×PBS，4℃离心机中9000g离心1min，小心吸走上清，注意不要吸到珠子，再加入900μL IP裂解液，重复以上操作，最后加入蛋白样品裂解液，4℃缓慢摇晃孵育2-4h；取15μL的Protein A珠子或者Protein G珠子于新的1.5mLEP管中，加入 900μL 1×PBS，4℃离心机中9000g离心1min，小心吸走上清，注意不要吸到珠子，再加入 900μL IP裂解液，重复以上操作；然后对含珠子的蛋白样品离心，9000g，1min，取上清，同Western blot实验(步骤见实施例1)，根据实验要求计算出Co-IP(免疫共沉淀)实验所需蛋白样的体积，加入新洗好的珠子中，并用IP裂解液(含1％PIC)补齐至500μL，还需制input蛋白样；按抗体与蛋白1:1000的比例中向500μL体系IP样品中加入抗体，4℃摇床孵育4-6h；孵育完成后，取出离心管进行4摄氏度1分钟，9000g的离心，使用移液器将上清液吸出，之后再加入900μL含1％PIC的IP裂解液，放于4摄氏度摇床上清洗珠子5分钟，最后再9000g,1分钟离心，用移液枪吸出上清；重复一次加入900μL含1％PIC的IP裂解液，放于4摄氏度摇床上清洗珠子5分钟，最后再9000g,1分钟离心，用移液枪吸出上清；最后加入20-25μL 2×SDS，短暂离心后放于100摄氏度金属浴上变性10分钟；13200r/min，离心5min，吸取上清跑SDS-PAGE胶，后续操作同Western blot实验(步骤见实施例1)，通过 Western blot检测PD-L1的泛素化水平。
结果表明：(1)数据显示，与对照相比，不论在A549还是在H1792细胞中，加药处理后的PD-L1的mRNA水平均是上升的(图2A、B)。PD-L1的mRNA水平虽然上升，但其蛋白表达量下降，因此HHT不是在转录水平下调肿瘤细胞中PD-L1水平，可能在蛋白翻译后水平下调PD-L1。(2)与蛋白酶体抑制剂MG132联合处理能抑制高三尖杉酯碱(HHT) 引起的PD-L1下调(图2C、D)，而联合使用溶酶体抑制剂CQ与高三尖杉酯碱(HHT)单独处理相比二者无明显变化(图2E、F)，说明高三尖杉酯碱(HHT)对PD-L1的下调依赖蛋白酶体途径而非溶酶体途径。(3)通过Co-IP实验证实高三尖杉酯碱(HHT)能增强PD- L1的泛素化水平进而促进PD-L1通过泛素-蛋白酶体途径降解(图2G)。
实施例3：高三尖杉酯碱(HHT)上调TRIM13蛋白水平。
将A549细胞接种于12孔板(细胞培养皿)中，37℃，CO2孵箱内培养24h之后，用不同浓度的(0、0.125μM、0.25μM、0.5μM)的高三尖杉酯碱(HHT)处理20h，然后收集细胞裂解(具体步骤见实施例1)。再通过Western blot(步骤见实施例1)后检测PD-L1、 TRIM13、CHIP、SYVN1和ACTB蛋白水平。将H460、H1792细胞分别接种于12孔板(细胞培养皿)中，37℃，CO2孵箱内培养24h之后，用不同浓度的(0、0.125μM、 0.25μM、0.5μM、1μM、2μM)的高三尖杉酯碱(HHT)处理20h，然后收集细胞裂解(具体步骤见实施例1)。再通过Western blot(步骤见实施例1)后检测PD-L1、TRIM13和 ACTB蛋白水平。
将H1792和H460细胞分别接种于6孔板(细胞培养皿)中，37℃，CO2孵箱内培养 24h之后，使用1μM和2μM的高三尖杉酯碱(HHT)处理20h后，提取RNA，使用RT- PCR技术检测TRIM13的转录情况(具体步骤见实施例2)。
TRIM13基因的上下游引物序列如下：
FWD:GTTTTGCCTTGCTCCCACAAC
REV:TCCTTACGGCATGTAGGACAC
将H1792细胞分别接种于6孔板(细胞培养皿)中，37℃，CO2孵箱内培养24h后，在H1792细胞中转染(具体步骤见实施例2)TRIM13的siRNA干扰TRIM13的表达24h后，在收集细胞20h前向细胞中加入1μM的高三尖杉酯碱(HHT)继续处理20h，通过Western blot(步骤见实施例1)检测PD-L1、TRIM13、ACTB的表达情况。
结果表明：(1)HHT处理后TRIM13的蛋白水平上升(图3A-C)，HHT处理后 TRIM13的转录水平无变化趋势(图3D、E),说明HHT对TRIM13的影响不是发生在转录水平上的。(2)敲低TRIM13后发现，HHT引起的PD-L1下调可在一定程度上被抑制(图 3F)。TRIM13属于TRIM家族的一个蛋白，主要定位于内质网，而内质网膜上锚定的E3连接酶可通过ERAD途径参与错误折叠蛋白质的降解。因此推测，TRIM13可能介导PD-L1的泛素化。
实施例4：TRIM13表达水平与PD-L1呈负相关
使用GEPIA数据库分析PD-L1与TRIM13表达的相关性。将6种不同的NSCLC细胞A549、Calu-1、H1299、H157、H1792和H460细胞分别接种于6cm细胞培养皿中，37℃， CO2孵箱内培养24h之后，通过Western blot(步骤见实施例1)检测PD-L1、TRIM13和 ACTB的表达情况。使用Kaplan-Meier Plotter数据库分析肺癌患者的总生存率与TRIM13表达的相关性。将H460细胞接种于6孔板(细胞培养皿)中，37℃，CO2孵箱内培养24h之后，在H460细胞中转染(具体步骤见实施例3)不同剂量的pcDNA3.1-HA-TRIM25质粒 24h后，通过Western blot(步骤见实施例1)检测PD-L1、TRIM13、ACTB的表达情况。
结果表明：(1)利用GEPIA数据平台，对数据库进行分析，发现TRIM13表达水平与PD-L1呈负相关(图4A)。通过Western blot实验检测6种NSCLC细胞中PD-L1与TRIM13 的蛋白表达量，数据显示在Calu-1、H1299中，PD-L1蛋白水平高的同时TRIM13蛋白水平较低，相反在A549、H1792和H157中则是PD-L1蛋白水平低而TRIM13蛋白水平高(图 4B)。另外，根据Kaplan-Meier Plotter数据库的分析，TRIM13在肺癌细胞中的表达水平与肺癌病人的总生存率呈正相关(图4C)。且在H460细胞中梯度过表达TRIM13，结果显示 PD-L1的蛋白水平也呈下降趋势(图4D)，以上均证实TRIM13可能与PD-L1的蛋白稳定性相关。
实施例5：TRIM13与PD-L1相互作用且高三尖杉酯碱(HHT)增强两者结合
将HEK293FT、H1792细胞分别接种于6cm、10cm细胞培养皿中，37℃，CO2孵箱内培养24h之后，在HEK293FT、H1792细胞中转染(具体步骤见实施例2)pcDNA3.1- FLAG-PD-L1、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)、pcDNA3.1-HA-TRIM13质粒24h，收集细胞 6h前加入20μmol/L的MG132处理，收集细胞进行Co-IP实验(步骤见实施例2)，检测 TRIM13与PD-L1(WT)和PD-L1(3NQ)的结合情况。将H460细胞分别接种于10cm细胞培养皿中，37℃，CO2孵箱内培养24h之后，在H460细胞中转染(具体步骤见实施例2) pcDNA3.1-HA-TRIM13质粒24h，收集细胞6h前加入20μmol/L的MG132处理，收集细胞进行Co-IP实验(步骤见实施例2)，检测内源蛋白PD-L1与TRIM13的结合。
将H460细胞分别接种于10cm细胞培养皿中，37℃，CO2孵箱内培养24h之后，在H460细胞中转染(具体步骤见实施例2)pcDNA3.1-HA-TRIM13质粒24h，在收集细胞2h 前加入20nM的高三尖杉酯碱(HHT)处理2h，收集细胞6h前两个处理都加入20μmol/L的 MG132处理6h，收集细胞进行Co-IP实验(步骤见实施例2)，检测内源蛋白PD-L1与 TRIM13的结合，并进行灰度分析。
结果表明：(1)TRIM13与糖基化和非糖基化PD-L1均存在相互作用(图5A、B)。另外，在H460中过表达pcDNA3.1-HA-TRIM13质粒，通过Co-IP实验验证TRIM13能与内源 PD-L1结合(图5C)。(2)HHT处理后TRIM13与内源非糖基化PD-L1的结合显著增强 (图5D、E)，说明HHT可能通过TRIM13介导PD-L1的下调。
实施例6：TRIM13增强PD-L1的泛素化
将HEK293FT细胞分别接种于6cm细胞培养皿中，37℃，CO2孵箱内培养24h之后，在HEK293FT细胞中转染(具体步骤见实施例2)pcDNA3.1-FLAG-PD-L1、pcDNA3.1- TRIM13、pcDNA3.1-HA-UB质粒24h，收集细胞6h前加入20μmol/L的MG132处理，收集细胞进行Co-IP实验(步骤见实施例2)，检测PD-L1的泛素化水平。将HEK293FT细胞分别接种于6cm细胞培养皿中，37℃，CO2孵箱内培养24h之后，在HEK293FT细胞中转染 (具体步骤见实施例2)pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)、pcDNA3.1-TRIM13、pcDNA3.1- HA-UB质粒24h，收集细胞6h前加入20μmol/L的MG132处理，收集细胞进行Co-IP实验 (步骤见实施例2)，检测PD-L1非糖基化的泛素化水平。将H1792与A549细胞分别接种于10cm细胞培养皿中，37℃，CO2孵箱内培养24h之后，分别在H1792与A549细胞中转染(具体步骤见实施例2)pcDNA3.1-FLAG-PD-L1、pcDNA3.1-FLAG-PD-L1(3NQ)、 pcDNA3.1-TRIM13、pcDNA3.1-HA-UB质粒24h，收集细胞6h前加入20μmol/L的MG132 处理，收集细胞进行Co-IP实验(步骤见实施例2)，检测PD-L1糖基化与非糖基化的泛素化水平。
结果表明：(1)Co-IP实验发现TRIM13可促进糖基化和非糖基化PD-L1的泛素化(图6A-D)。
实施例7：高三尖杉酯碱(HHT)下调小鼠肿瘤组织PD-L1水平并增加杀伤性T细胞数量，抑制肿瘤生长
将小鼠肺癌细胞LLC细胞接种于6孔板(细胞培养皿)中，37℃，CO2孵箱内培养24 h之后，用(0、0.125μM、0.25μM、0.5μM、1μM、2μM)的高三尖杉酯碱(HHT)处理20h，然后收集细胞裂解(具体步骤见实施例1)。再通过western blot(步骤见实施例1)后检测Pd-l1和Actb蛋白水平。
将10只6周龄大的C57BL/6小鼠分为两组，一组为对照组，在皮下注射1×106/100μl·只LLC细胞7天后，每隔一天腹腔注射与实验组等量的生理盐水，继续培养20天；另一组为实验组，在皮下注射1×106/100μl·只LLC细胞7天后，每隔一天按1.25mg/kg的标准腹腔注射HHT，继续培养20天。这期间每隔一天测量一次小鼠的体重和肿瘤的长与宽，根据公式V＝π*(length*width2)/6计算肿瘤的大小，实验结束后处死小鼠并取出肿瘤并将解剖出的肿瘤进行称重。
取解剖后的肿瘤组织进行石蜡切片的制作，首先肿瘤组织用4％多聚甲醛固定过夜，放入乙醇前用1×PBS清洗一次；再加入75％乙醇，可长久保存(4度)或室温4小时；85％乙醇处理2h；95％乙醇处理1.5h；100％乙醇I处理40min，100％乙醇II处理40min；乙醇二甲苯(1:1)处理10min；二甲苯I处理15min，二甲苯II处理15min(样品不同，处理时间，尽量不要超过30min；二甲苯石蜡(1:1)处理30min；浸蜡(选取56度熔点的蜡，提前置于63℃烘箱中)：石蜡I处理1h，石蜡II处理1h，石蜡III处理2h；提前将加热垫调到 75℃，将放有组织的石蜡III，新鲜石蜡、包埋盒放置在加热垫上。将新鲜石蜡倒入包埋盒，在酒精灯上烧一下镊子，并在石蜡中降温，迅速将组织放入装有石蜡的包埋盒，并调整位置。然后将包埋盒移至实验台，加上标签纸，待凝固后，放入4度冰箱冰镇一下。接下来进行切片，用切片机切5μm切片，置于40摄氏度水浴锅中展片；将片子置于载玻片上，63℃烘箱中烘烤，至少4h，常温下保存备用。然后对石蜡切片进行免疫组化实验，切片用之前63℃烘箱加热30min，便于脱蜡；二甲苯I、II、III各处理10min脱蜡，然后100％、100％、95％、 80％、70％乙醇，ddH2O各处理5min水化。接下来对片子进行抗原修复：电磁炉加热水至沸腾，水中放入抗原修复盒，加热30min，期间保持微沸的状态，室温下冷却至少40min； 1×PBS洗三次，每次5min；为去除内源性过氧化物酶，3％H2O2，室温处理10min；1×PBS 洗三次，每次5min；0.2％Triton-X(PBS配置)处理15min，1×PBS洗三次，每次5min；滴加正常山羊血清封闭液(5％，1×PBS配)，室温下封闭0.5h，甩去多余液体；滴加PD-L1一抗50ul-100ul，4度湿盒过夜，第二天室温复温30min；1×PBS洗三次，每次5min；滴加二抗50ul(用正常山羊血清封闭液稀释，比例为1:200)，室温静置1h；1×PBS洗三次，每次 5min；DAB染色2-10min,在显微镜下掌握染色程度，后用自来水冲10min；苏木素提拉三次，流水2min，盐酸乙醇分化，提拉一次，流水2min；梯度乙醇脱水各3min，二甲苯×2各 3min；干燥30min，加20ul封片液(中性树胶：二甲苯＝2:1)封片。在显微镜下观察小鼠肿瘤组织内的PD-L1水平。接下来对石蜡切片进行免疫荧光实验，切片用之前63℃烘箱加热 30min，便于脱蜡；二甲苯I、II、III各处理15min脱蜡，然后100％、100％、95％、80％、 70％乙醇，ddH2O各处理5min水化。再对片子进行抗原修复：电磁炉加热水至沸腾，水中放入抗原修复盒，加热30min，期间保持微沸的状态，室温下冷却至少40min；1×PBS洗三次，每次5min；0.2％Triton-X处理12min，1×PBS洗三次，每次5min；滴加正常山羊血清封闭液(5％，1×PBS配)，室温下封闭0.5h，甩去多余液体；滴加CD8一抗50ul-100ul，4 度湿盒过夜，第二天室温复温30min；1×PBS洗三次，每次5min；滴加荧光二抗50ul(用正常山羊血清封闭液稀释，比例为1:500)，室温静置1.5h(避光)；1×PBS洗三次，每次5min； DAPI(1ug/ml)染色10min，1×PBS洗三次，每次5min；抗荧光淬灭剂封片。在荧光显微镜下观察小鼠CD8+T细胞在LLC皮下移植瘤组织附近的分布。
结果表明：(1)HHT对小鼠肺癌细胞LLC的PD-L1表达存在下调作用(图7A)。(2) 随着HHT注射时间的增长，实验组小鼠肿瘤组织的生长明显放缓(图7E)。最终的解剖结果也显示，实验组的2只成瘤小鼠在注射HHT后肿瘤逐渐减小直至消失(图7C)。将解剖出的肿瘤进行称重，发现实验组中肿瘤重量明显低于对照组，统计分析表明，二者存在显著差异(p<0.05)(图7F)。在整个实验过程中，两组小鼠体重均呈现稳步增长，因此可排除小鼠生长状况对实验结果的影响(图7D)。(3)通过免疫组化实验发现实验组小鼠肿瘤组织内的PD-L1水平低于对照组(图8A)。通过对两组的石蜡切片进行免疫荧光实验，结果显示，实验组的CD8+T淋巴细胞数量多于对照组(图8B)，说明HHT处理可能增强小鼠T细胞的杀伤能力。
序 列 表
<110> 山东大学
<120> 高三尖杉酯碱在制备抑制肿瘤细胞PD-L1制剂中的应用
<141> 2021-10-07
<160> 1
<210> 1
<211> 1233
<212> DNA
<213> Homo sapiens(human)
<221> TRIM13基因的核苷酸序列
<222>（1）…（1233）
<400> 1
atggatgtga tggagctgct tgaagaagat ctcacatgcc ctatttgttg tagtctgttt 60
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